防凍消毒劑在北方冬季畜禽養殖場的抗凍和消殺作用研究

董 娜，楊作豐，許 丹，齊六衛，趙寶凱，謝書宇

1.沈陽市農業綜合行政執法隊，遼寧沈陽 110031；2.遼寧省農業發展服務中心，遼寧沈陽 110032；3.沈陽偉嘉牧業技術有限公司，遼寧沈陽 110027；4.華中農業大學動物醫學院，湖北武漢 430070

1 前言

冬季低溫環境不僅有利于環境中病毒、細菌的長期存活，也顯著降低了消毒劑的消毒效果[1]，消毒液在室外-6 ℃下會發生凍結無法發揮其消毒作用。此外，在冷凍溫度下對畜禽養殖場道路等表面噴灑消毒劑會變得濕滑，易導致養殖場人員的安全事故。

為了有效解決北方冬季消毒劑在低溫下因為凍結而不能呈現無消殺作用的問題，項目組通過采用能降低水冰點和增加消毒劑分子擴散能力的無機鹽、陽離子活性劑和消毒劑的合理組方，利用多組分間的協同作用開發出在-35 ℃的超低溫條件下仍然具有高效消殺作用的防凍消毒劑，為解決我國北方地區畜禽養殖場冬季消毒面臨的低溫和消毒效果效率差的難題提供新的解決方案。本研究通過抗凍試驗測定其防凍能力，并通過瓊脂擴散法以及殺菌時間曲線評價其在畜禽養殖場常溫和超低溫的殺菌活性。

2 材料與方法

2.1 試驗材料

防凍消毒劑、戊二醛溶液、碘伏市場采購。

LB肉湯，青島海博生物科技有限公司。

LB瓊脂，青島海博生物科技有限公司。

金黃色葡萄球菌、大腸桿菌和沙門氏菌保存于國家獸藥殘留基準實驗室(華中農業大學)。

2.2 防凍測試

準確稱量防凍消毒劑，并將其配制成質量分數為5%、10%、15%、20%、25%的10 mL溶液，將其放入-70 ℃冰箱，每間隔10 min利用低溫溫度計測量防凍液的溫度，測量每個濃度梯度開始凍結的臨界溫度，每個濃度3個重復。

2.3 抗菌活性測試

2.3.1 瓊脂擴散法

將對數生長期的金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、沙門氏菌懸液分別稀釋至107CFU/mL的濃度，然后將100 μL的稀釋細菌懸液均勻地涂布在瓊脂培養基的表面。均勻涂布后，在每個瓊脂培養皿制作3個孔，分別將200 μL不同稀釋濃度的防凍消毒液、碘伏以及戊二醛稀釋液加入瓊脂培養皿的小孔中。隨后，將瓊脂培養皿置于37 ℃培養箱中培養16～18 h，觀察各孔周圍的抑菌圈大小。

2.3.2 低溫殺菌試驗

將對數生長期的金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、沙門氏菌懸液加入2 mL LB肉湯中，使其菌液濃度為107CFU/mL。隨后將防凍消毒劑、碘伏以及戊二醛稀釋液加入上述 LB肉湯中，使防凍消毒劑的最終濃度為5%、10%、20%以及對應濃度的戊二醛和碘液。將含有菌液和消毒劑的試管置于-20 ℃的冷室中，靜止孵育12 h將菌液按10倍比稀釋后，取100 μL稀釋液均勻涂布到瓊脂培養皿，在37 ℃下孵育24 h后進行菌落計數。每個濃度重復3次。

3 結果

3.1 防凍作用

防凍試驗研究表明，防凍消毒劑具有良好的抗凍和耐低溫作用，其在5%、10%、15%、20%和25%濃度下分別抵抗-5、-11、-14、-22、-35 ℃的超低溫。上述結果表明，該防凍消毒劑抗凍性能良好，可以有效抵抗-35 ℃的超低溫。本品抗凍作用呈現濃度依賴性，隨著濃度增加效果顯著增強。

3.2 抗菌活性

3.2.1 對金黃色葡萄球菌的殺菌活性

瓊脂擴散法研究表明，在加入不同濃度的防凍消毒劑溶液的小孔周圍的抑菌圈明顯伴隨著濃度的升高而增大，表明防凍消毒劑對金黃色葡萄球菌的抑菌效果呈濃度依賴性。

在-20 ℃的低溫殺菌曲線試驗結果表明，防凍消毒劑殺菌效果極為顯著，尤其20%的防凍消毒劑溶液使金黃色葡萄球菌減少了8.59 log，而市售消毒劑戊二醛和碘伏在高濃度下僅使其減少5.7 log和4.34 log。在-20 ℃下5%的防凍消毒劑溶液使金黃色葡萄球菌減少了6.52 log，而戊二醛稀釋液僅能降低4.9 log，碘伏幾乎對金黃色葡萄球菌無殺滅效果。因此，相比于市售戊二醛和碘液，該防凍消毒劑在不同濃度下對金黃色葡萄球菌的殺滅效果都更為顯著。

3.2.2 對大腸桿菌的殺菌活性

殺菌活性試驗表明，在高、低濃度下，3種不同消毒劑的微生物抑菌圈依次為：防凍消毒劑＞戊二醛＞碘伏。在不同濃度下，防凍消毒劑抑菌圈均顯著大于戊二醛和碘伏。因此，防凍消毒劑在高低濃度下對大腸桿菌抑菌活性均顯著強于市售消毒劑戊二醛和碘液在推薦劑量對大腸桿菌的抑菌活性。

在-20 ℃的低溫殺菌曲線試驗結果表明，防凍消毒劑、戊二醛以及碘伏對大腸桿菌均表現出良好的殺菌活性。在推薦的不同劑量下，防凍消毒劑在殺菌活性均顯著大于市售的戊二醛和碘伏。因此，在3種不同消毒劑中，防凍消毒劑對大腸桿菌殺滅作用更加顯著。

3.2.3 對沙門氏菌的殺菌活性

瓊脂擴散法結果所示，在不同濃度下，3種消毒劑中僅該防凍消毒液有明顯的抑菌圈。該防凍消毒液的抑菌圈隨著濃度的增大而增加，而戊二醛和碘液不管是在高濃度還是在低濃度的情況下，其抑菌圈均不明顯。由此可見，該防凍消毒液在高、低濃度下對沙門氏菌抑菌活性均顯著強于市售消毒劑戊二醛和碘液在推薦劑量對沙門氏菌的抑菌活性。

在-20 ℃的低溫殺菌曲線試驗結果表明，防凍消毒液和戊二醛對沙門氏菌均表現出良好的殺菌效果，而碘伏不管是在高濃度還是低濃度條件下對沙門氏菌幾乎沒有殺滅效果。盡管戊二醛和防凍消毒液都對沙門氏菌表現出良好的殺菌效果，在推薦使用劑量下的菌落計數計數來看，防凍消毒液更具有優勢，尤其是20%的防凍消毒溶液對沙門氏菌的殺滅效果達到10.12 log。因此，防凍消毒液在低溫呈現比戊二醛和碘附更強的殺滅作用。

4 討論

由試驗數據可知，該防凍消毒液具有高效的防凍消毒效果，可用于解決低溫下消毒的難題，為解決我國北方地區畜禽養殖場在冬季消毒面臨的低溫凍結和消毒效果差的難題提供新的解決方案，對北方冬季非洲豬瘟等動物疫病的防控提供了技術和產品保障。該防凍消毒劑具有良好的抗凍消毒作用，其在-35 ℃的超低溫條件下仍然具備消毒作用。這是因為本品采用無機鹽的復配和表面活性的協同作用，在有效降低水的冰點的同時，提升了消毒效果，好于單品的抗凍效果。無機鹽溶解于水后，能夠降低水的冰點溫度，通過陽離子表面活性劑的復配增強了鹽離子降低水冰點的能力，在超低溫下具有防凍功能。本品抗凍作用呈現濃度依賴性，隨著濃度增加效果顯著增強。建議在北方冬季使用過程中，根據外界溫度合理配制消毒劑濃度。

常規和低溫抗菌活性試驗研究表明，防凍消毒液在5%～20%的濃度下均呈現強大的殺菌效力，并呈現濃度依賴性。高濃度金屬離子、OH-和陽離子表面活性劑復配可使病毒、細菌蛋白變性沉淀，增強其細胞通透性，使微生物體破裂死亡，呈現高效的消殺作用，并且對芽孢具有消殺活性。另外，防凍消毒液溶解后，液體的高流動性和放熱作用可加快消毒劑分子的擴散速率，增強消毒劑分子進入微生物體的效率，從而呈現強大的消毒消殺作用。

從防凍和消殺試驗結果來看，該防凍消毒液可以為我國北方地區畜禽養殖場在冬季消毒面臨的的低溫凍結和消毒效果差的難題提供新的解決方案，并為北方冬季非洲豬瘟等動物疫病消毒提供技術和產品支持。