miR-3529-3p通過下調E2F3基因表達抑制卵巢癌SKOV-3細胞增殖的機制研究

萬淑瓊 鮑群麗 黃耿 姜艷萍 張青冬 王楚平

1鄂東醫療集團黃石市中心醫院（湖北理工學院附屬醫院）婦科，黃石 435000；2鄂東醫療集團黃石市中心醫院（湖北理工學院附屬醫院）檢驗科，黃石 435000；3鄂東醫療集團黃石市中心醫院（湖北理工學院附屬醫院）泌尿外科，黃石 435000

卵巢癌是女性常見的惡性腫瘤，因其組織結構較為隱蔽，卵巢癌早期的臨床特征并不明顯，大部分卵巢癌患者初診時已發生轉移，嚴重威脅女性生命安全［1-2］。卵巢癌的臨床治療主要是手術治療，然而術后的高復發率嚴重影響患者預后［3］。尋找早期的診斷標志物及治療靶標成為卵巢癌研究的重點。微小RNA（miR）是一類保守的單鏈RNA，屬于非編碼內源性RNA，長度約為23個核苷酸［4-5］。miR通過在轉錄后水平影響靶基因的表達，在細胞的生理和病理過程中發揮著重要作用［6-7］。已有大量研究顯示，miR作為調控因子參與卵巢癌細胞的增殖、分化、遷移、凋亡等功能［8-9］。2021年1月至5月，本研究擬探討miR-3529-3p對卵巢癌細胞增殖的影響及作用機制。

材料與方法

1、細胞與主要試劑

DMEM培養基購于美國Gibco公司；NC mimic、miR-3529-3p mimic購于上海碧云天生物技術有限公司；卵巢癌細胞SKOV-3購于中國科學院典型培養物保藏委員會細胞庫；CCK-8試劑盒購于上海生工生物工程股份有限公司；結晶紫購于美國Sigma公司；Lipofectamine 3000、Opti-MEM培養基購于美國Life Technologies公司；反轉錄試劑盒和實時熒光定量逆轉錄聚合酶鏈反應（qRT-PCR）試劑盒購于大連寶生物公司；一抗和辣根過氧化物酶標記的二抗購于美國CST公司。

2、細胞培養和轉染

將SKOV-3細胞接種于含10%胎牛血清的DMEM培養基中，于37℃、5%CO2培養箱內培養。在24孔板內接種處在對數生長期的SKOV-3細胞，采用Opti-MEM培養基分別稀釋miR試劑和Lipofectamine 3000試劑，充分混勻冰上孵育15 min，分別加預混液至24孔板。轉染NC mimic的SKOV-3細胞為NC組，轉染miR-3529-3p mimic的SKOV-3細胞為miR-3529-3p組。

3、qRT-PCR檢測miR-3529-3p、E2F轉錄調節因子3（E2F3）mRNA表達

采用TRIzol試劑收集細胞并提取RNA，按照反轉錄試劑盒和qRT-PCR試劑盒說明書分別進行反轉錄和qRT-PCR，引物序列如下，E2F3引物正向序列5’-TGACCCAATGGTAGGCACAT-3’，反 向 序 列5’-CATCTAGGACCACACCGACA-3’；miR-3529-3p引物正向序列5’-GTGGGGAGGGAAGGGTCATGCA-3’，反向序列5’-CTTCATCAGCGTCAACAG-3’。以U6為miR-3529-3p的內參基因，以GAPDH為E2F3的內參基因，按照2-ΔΔCt法計算miR-3529-3p、E2F3信使RNA（mRNA）的表達。

4、CCK-8法檢測SKOV-3細胞增殖情況

取兩組處于對數生長期的SKOV-3細胞制成單細胞懸液，按2×103個/孔接種至96孔板，分別在第1、2、3、4天，每孔加入30μl CCK-8試劑，培養箱繼續培養3 h，使用酶標儀檢測于450 nm處每孔的吸光度（A）值。每個樣本采用4個復孔，實驗重復4次。

5、集落形成實驗檢測SKOV-3細胞增殖能力

取兩組處于對數生長期的SKOV-3細胞制成單細胞懸液，按2×103個/孔接種至6孔板，連續培養10 d后，加入甲醇進行固定，加入結晶紫進行染色，流水沖洗多余染液，計數集落形成數。每個樣本采用4個復孔，實驗重復4次。

6、生物信息學軟件預測miR-3529-3p的靶基因

采用miRNAMap數據庫（http：//mirnamap.mbc.nctu.edu.tw/）預測miR-3529-3p的靶基因，E2F3可能是miR-3529-3p的靶基因。

7、蛋白質免疫印跡法（Western blot）檢測靶基因蛋白的表達

采用細胞裂解液裂解SKOV-3細胞，提取總蛋白，在SDS-PAGE凝膠中進行電泳，采用硝酸纖維素膜進行轉膜。采用5%脫脂牛奶封閉，在一抗中孵育過夜，加入二抗并孵育2 h，均勻加入ECL顯影液，在凝膠成像儀中顯影、拍照。

8、統計學分析

采用SPSS17.0軟件進行統計學分析，計量數據符合正態分布，以均數±標準差（±s）表示，兩組間比較應用獨立樣本t檢驗，以P＜0.05為差異有統計學意義。

結 果

1、各組SKOV-3細胞中miR-3529-3p的表達

SKOV-3細胞轉染24 h后，NC組和miR-3529-3p組SKOV-3細胞中miR-3529-3p的表達分別為（1.01±0.07）和（9.55±1.50），miR-3529-3p組相比NC組上調了9.46倍（t=5.68，P＜0.01）。

2、miR-3529-3p對SKOV-3細胞增殖活性的影響

與NC組相比，miR-3529-3p組SKOV-3細胞在第2、3、4天時增殖活性均有下降趨勢（均P＜0.05），表明miR-3529-3p過表達抑制卵巢癌SKOV-3細胞增殖活性（圖1）。

圖1 高表達miR-3529-3p對SKOV-3細胞增殖能力的影響

3、miR-3529-3p對SKOV-3細胞集落形成能力的影響

NC組和miR-3529-3p組集落形成數分別為（120.50±18.38）個和（56.25±10.78）個，差異有統計學意義（t=3.02，P＜0.01），提示miR-3529-3p過表達可抑制卵巢癌SKOV-3細胞的集落形成（圖2）。

圖2 miR-3529-3p對SKOV-3細胞集落形成的影響（結晶紫染色 ×10）

4、生物信息學軟件預測miR-3529-3p的靶基因

如圖3，采用miRNAMap數據庫預測miR-3529-3p的靶基因可能是E2F3。

圖3 miR-3529-3p與E2F3 mRNA的互補配對區域

5、miR-3529-3p對E2F3 mRNA表達的影響

NC組和miR-3529-3p組SKOV-3細胞中E2F3 mRNA的 表 達 分 別 為（1.03±0.14）和（0.27±0.05），表 明miR-3529-3p可抑制E2F3 mRNA的表達（t=5.60，P＜0.01）。

6、miR-3529-3p對E2F3蛋白表達的影響

Western blot結果表明，與NC組相比，miR-3529-3p組SKOV-3細胞E2F3蛋白減少，細胞周期相關蛋白CDK4、CDK6表達降低（圖4）。

圖4 高表達miR-3529-3p對E2F3蛋白表達的影響

討 論

miR的異常表達與卵巢癌的發生、發展、轉移相關［10-11］。miR如miR-29c-3p［12］、miR-34a-5p［13］可通過干擾癌基因表達抑制卵巢癌的增殖，誘導細胞凋亡，增強化療敏感性，產生抑癌作用。miR如miR-665［14］、miR-378a-3p［10］可通過干擾抑癌基因表達促進卵巢癌細胞的增殖和轉移，與患者的不良預后相關，表現為促癌作用。miR-3529-3p在卵巢癌細胞中的作用尚不明確。本研究顯示，過表達miR-3529-3p可顯著抑制卵巢癌SKOV-3細胞的增殖活性，miR-3529-3p在卵巢癌細胞中表現為抑癌作用。

miRNA序列主要通過與對應靶基因mRNA的3’非翻譯區不完全互補，抑制靶基因mRNA的翻譯或直接誘導其降解，導致靶基因蛋白表達降低［12］。本研究采用miRNAMap數據庫預測，miR-3529-3p和E2F3 mRNA存在互補反應元件。E2F3蛋白屬于E2F轉錄因子家族成員，通過調控細胞周期促進細胞的增殖［15］。E2F3蛋白在膀胱癌、肝癌、胃癌等腫瘤中呈高表達，在細胞的惡性轉化中發揮重要作用［16］。E2F3蛋白在卵巢癌癌組織中的表達高于癌旁組織，其表達水平伴隨臨床分期和腫瘤惡性程度發展而增高，沉默E2F3基因表達可抑制卵巢癌細胞的增殖和順鉑耐藥性［15］。本研究顯示，過表達miR-3529-3p后SKOV-3細胞中E2F3基因的表達明顯降低，表明miR-3529-3p可靶向抑制E2F3的表達，E2F3可能是miR-3529-3p的靶基因。本研究顯示，miR-3529-3p抑制E2F3表達后，SKOV-3細胞中細胞周期相關蛋白CDK4、CDK6表達降低，間接提示細胞的增殖活性降低。

綜上所述，miR-3529-3p可能通過調控E2F3基因表達抑制卵巢癌細胞的增殖活性，提示miR-3529-3p可能成為卵巢癌靶向治療的分子靶點。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突