Versican與胃癌上皮-間質轉化相關蛋白的表達及意義

楊迷玲 楊金花 王 娜 徐憲偉 姜海波 郝義彬

胃癌是消化道常見的惡性腫瘤之一，嚴重影響人類健康[1]。胃癌的發生、發展是多因素參與的過程，遺傳和環境因素是其發病機制的重要因素[2]。上皮-間質轉化(epithelial-mesenchymal transition, EMT)在包括胃癌在內的上皮性惡性腫瘤的侵襲、轉移過程中起著重要作用。EMT是一個動態的過程，在細胞信號因子的刺激下上皮細胞轉化為間充質細胞，細胞形態的改變使細胞的侵襲和轉移能力增強。有研究報道，Versican高表達與胃癌患者的生存相關，但是和胃癌患者的生存有兩種觀點， Versican與胃癌上皮-間質轉化的關系尚未見報道[3,4]。因此，本研究運用免疫組化和qRT-PCR檢測胃癌組織中Versican與上皮-間質轉化相關蛋白E-鈣黏蛋白(E-cadherin)和N-鈣黏蛋白(N-cadherin)的表達，分析它們之間的相關性及與臨床病理特征的關系，并進一步分析Versican蛋白表達對胃癌患者生存期的影響。

材料與方法

1.臨床資料：選取鄭州人民醫院病理科2012年1月～2016年12月病理診斷為胃癌的石蠟標本167例，其中男性123例，女性44例，患者年齡25～88歲。按照WHO分類標準，高-中分化者76例，低-未分化者91例；臨床分期Ⅰ～Ⅱ期86例，Ⅲ～Ⅳ期81例；有淋巴結轉移者94例，無淋巴結轉移者73例；按1965年Lauren分型，腸型90例，彌漫型77例。同時收集相應的癌旁正常胃黏膜組織(距腫瘤切緣>5cm)作為對照組。有完整5年隨訪資料的患者120例，患者無病生存期從手術之日開始計算，終止日期為腫瘤復發日期或末次隨訪日期。選取其中30例新鮮胃癌組織和相應的癌旁胃黏膜組織于-196℃液氮保存，用于qRT-PCR檢測。所有病例術前均未進行放療和化療。本研究所有標本的使用均經患者知情同意，并通過鄭州人民醫院醫學倫理學委員會審批(倫理審批號：2018L02009)。

2.主要試劑：濃縮型兔抗人多克隆抗體Versican(克隆號：ab19345)購自英國Abcam公司；鼠抗人單克隆抗體E-cadherin和N-cadherin及ElivisionTM染色試劑盒均購自福州邁新公司；qRT-PCR檢測試劑盒購自美國Invitrogen公司；引物由ABI公司的Primer Express Software v2.0設計。

3.免疫組織化學：組織標本由10%甲醛溶液固定，取材，脫水，石蠟包埋，4μm厚連續切片、烤片、脫蠟并水化，采用枸櫞酸鹽緩沖液高溫高壓修復，然后用免疫組織化學EliVision法染色。免疫組化操作步驟嚴格按照試劑盒說明書進行。DAB顯色，蘇木精復染，鹽酸乙醇分化，氨水返藍，脫水，透明，封片。以PBS代替一抗作為陰性對照，已知陽性切片作為陽性對照。

4.免疫組化結果判定：所有指標的結果均由兩位有經驗的病理科醫生經雙盲法獨立評估。Versican的陽性著色為癌細胞周圍的癌相關纖維母細胞胞質呈棕黃色。參照文獻[5]的判定標準，據染色強度進行半定量判定分為3個等級：弱陽性為1級；中等陽性為2級；強陽性為3級。根據間質陽性細胞的百分比判定：0～100%，然后根據平均百分比(30%)及染色強度綜合判定：間質陽性細胞數<30%且染色強度為強陽性判定為低表達，間質陽性細胞數≥30%且染色強度為強陽性判定高表達。E-cadherin主要表達于細胞膜，>50%的細胞呈棕黃色顆粒定義為陽性； N-cadherin表達于細胞膜，>10%的細胞呈棕黃色顆粒定義為陽性。

5.qRT-PCR檢測：總RNA提取，反轉錄，熒光定量PCR擴增，分析數據。實時熒光定量PCR在PCR儀上96孔板中進行，重復做3次平行實驗。反應中的Ct值數據的采用校正的閾值設定，以β-actin作為內參基因，采用2-ΔΔCt法進行相對定量。β-actin正向引物：5′-CATGTACGTTGCTATCCAGGC-3′，反向引物：5′-CTCCTTAATGTCACGCACGAT-3′；Versican正向引物：5′-CAAGCTGCTGGCAAGTGATG-3′，反向引物：5′-GCCGCCCTGTAGTGAAACAC-3′；E-cadherin正向引物：5′-AAAGAGCCCTTACTGCCCCC-3′，反向引物：5′-TGTGCAGCTGGCTCAAGTCA-3′；N-cadherin正向引物：5′-CTGCAGCAGCCTGACACTGT-3′，反向引物：5′-CAGATCGGACCGGATACTGG-3′。

結 果

1.Versican、E-cadherin和N-cadherin蛋白在癌旁胃黏膜和胃癌中的表達：Versican在癌旁正常胃黏膜中的陽性率為19.76%(33/167)，顯著低于在胃癌組織中的陽性率為72.46%(121/167，χ2=61.084，P=0.000)。Versican主要表達于胃癌細胞周圍的癌相關纖維母細胞的胞質。E-cadherin在胃癌及癌旁胃黏膜組織中主要定位于細胞膜，呈棕黃色顆粒狀，胃癌中E-cadherin的陽性表達率明顯低于癌旁胃黏膜，差異有統計學意義(χ2=10.066，P=0.002)。N-cadherin在胃癌及癌旁胃黏膜組織中主要表達于細胞膜，棕黃色顆粒狀，胃癌中N-cadherin的陽性率明顯高于癌旁胃黏膜組織，差異有統計學意義(χ2=4.365，P=0.037，圖1、表1)。

圖1 Versican、E-cadherin和N-cadherin在胃癌和癌旁組織中的表達(免疫組化染色，×100)A～C.癌旁組織; D～F.胃癌組織

表1 胃癌和癌旁胃黏膜組織中Versican、E-cadherin和N-cadherin蛋白的表達[n(%)]

2.Versican、E-cadherin和N-cadherin mRNA在癌旁胃黏膜和胃癌中的表達：胃癌中Versican和N-cadherin mRNA的表達水平顯著高于癌旁胃黏膜(P<0.001)，E-cadherin mRNA的表達水平顯著低于癌旁胃黏膜(P<0.001，圖2)。

圖2 胃癌組織及癌旁組織中Versican、E-cadherin和N-cadherin mRNA的相對表達水平

3.Versican、E-cadherin和N-cadherin蛋白的表達與胃癌各臨床病理參數的關系：Versican蛋白在低-未分化胃癌中的表達顯著高于高-中分化胃癌，臨床分期Ⅲ～Ⅳ期，浸潤深度達漿膜及淋巴結出現轉移時Versican的表達增加(P均<0.05)。E-cadherin蛋白的表達與胃癌的Lauren分型、分化程度、浸潤深度、臨床分期和淋巴結轉移顯著相關(P<0.05)，即隨著胃癌浸潤深度的加深、臨床分期的進展及淋巴結出現轉移時，E-cadherin蛋白的表達逐漸減少，在低-未分化組的表達率低于高-中分化組，在彌漫型胃癌中的表達率低于腸型胃癌。N-cadherin在胃癌組織中與胃癌的Lauren分型、浸潤深度、臨床分期和淋巴結轉移顯著相關(P<0.05)，當胃癌浸潤深度達漿膜，臨床分期達Ⅲ、Ⅳ期及淋巴結出現轉移時，N-cadherin蛋白的表達逐漸增加，詳見表2。

表2 Versican、E-cadherin和N-cadherin的表達與167例胃癌各臨床病理參數的關系(n)

4.胃癌組織中Versican與E-cadherin和N-cadherin之間的相關性分析：Spearman等級相關性分析結果顯示，Versican的表達與E-cadherin的表達呈負相關(r=-0.638，P=0.000)，Versican的表達與N-cadherin的表達呈正相關(r=0.313，P=0.000，表3)。

表3 胃癌中Versican與E-cadherin和N-cadherin的Spearman相關性分析(n)

5.胃癌組織中Versican蛋白的表達與患者生存期的關系：有5年完整隨訪資料的120例胃癌患者的無病生存率為54.2%(65/120)。Versican蛋白高表達者的無病生存率49.2%(32/65)低于Versican低表達者60.0%(33/55)，差異有統計學意義(Log-rank=8.805，P=0.003，圖3)。COX比例風險模型分析結果顯示，Versican高表達(Wald=8.552，P=0.003)是影響胃癌患者預后的獨立危險因素(表4)。

表4 胃癌患者多因素生存分析(n=120)

圖3 胃癌組織中Versican蛋白表達與患者預后的Kaplan-Meier生存曲線

討 論

腫瘤的發生、發展是腫瘤細胞和腫瘤微環境相互作用的過程，腫瘤的微環境包括各種細胞群、細胞外基質、激素、生長因子等。在腫瘤微環境中，細胞外基質具有重要的生物學功能。多功能蛋白聚糖(Versican)屬于蛋白聚糖家族，是一種硫酸軟骨素蛋白多糖(CSPG)，是細胞外基質的主要成分，是腫瘤微環境的必要成分，Versican由3個不同的區域組成，有5個亞單位，不同的亞單位有不同的功能[6]。Versican在胚胎發育和疾病發展中起重要作用，在細胞的黏附、增殖、遷移和血管生成中發揮調節作用[7～9]。Versican在腫瘤的進展中起重要作用，在多種惡性腫瘤中異常表達，包括上皮源性腫瘤和間葉源性腫瘤[10～14]。

有人通過基因檢測研究認為，與正常胃黏膜比較，Versican在胃癌中高表達，高表達的Versican與胃癌患者的不良預后有關[3]。本研究分別采用RT-PCR法和免疫組織化學法在基因水平和蛋白水平上均證實了Versican在胃癌組織中表達升高，與上述研究結果一致。免疫組化結果顯示，Versican蛋白在胃癌的間質纖維母細胞中高表達，且其表達水平在分化程度越低、臨床分期越晚、淋巴結出現轉移時越高，說明Versican與胃癌的進展和淋巴結轉移有關。在膀胱癌和葡萄膜黑色素瘤中Versican mRNA高表達，并且Versican mRNA高表達者患者預后不良[11,12]。在食管鱗癌間質纖維母細胞中高表達的Versican與患者的無病生存率有關，是食管癌患者預后的獨立危險因素[13]。本研究運用Kaplan-Meier分析顯示，Versican高表達者患者的無病生存率低于低表達者，COX風險比例模型分析顯示Versican高表達是影響胃癌患者預后的獨立危險因素。

轉移是影響胃癌患者預后的關鍵因素，胃癌的侵襲、轉移與胃癌細胞發生EMT有關。EMT是上皮細胞在特定的生理和病理條件下轉化為間質細胞的現象。在這個過程中上皮細胞標志物E-cadherin表達下調，上皮細胞的特性和行為受到抑制，同時間質標志物N-cadherin表達上調，獲得間質細胞的特點，細胞變成梭形，運動能力增強，因此，EMT是腫瘤細胞發生侵襲、轉移的主要機制之一[15,16]。本研究結果顯示，胃癌組織中Versican和N-cadherin的陽性率顯著高于正常胃黏膜，而E-cadherin的陽性率則顯著低于正常胃黏膜，并且均與分化程度、臨床分期和淋巴結轉移相關，表明Versican、E-cadherin和N-cadherin共同參與了胃癌的發生、發展。

研究發現，Versican在乳腺癌、肝細胞癌和白血病中表達均升高，并且可以促進腫瘤細胞上皮-間質轉化進而促進腫瘤浸潤轉移[17～19]。本研究通過相關分析發現Versican與E-cadherin表達呈負相關，與N-cadherin表達呈正相關，表明胃癌中高表達的Versican可能通過使胃癌細胞形態發生變化，失去上皮細胞的形態，獲得間質細胞表型，即E-cadherin表達減少，N-cadherin表達增高，細胞的黏附能力降低，運動能力增強，進而促進上皮-間質轉化的發生。本研究顯示，胃癌中Versican高表達者，臨床上患者處于進展期，更易發生淋巴結轉移，并且5年無病生存率較低。但也有研究認為胃癌上皮細胞中Versican高表達者患者預后較好[20]。這與本研究結果不一致，可能是因為觀察目標不同，本研究觀察的是胃癌細胞周圍的間質纖維母細胞中的Versican，胃癌細胞發生上皮-間質轉化后，上皮成分減少，間質成分增多，間質中的Versican表達也增多，進一步促進腫瘤細胞上皮-間質轉化，形成惡性循環。

綜上所述，胃癌組織中Versican和N-cadherin的表達均增高，而E-cadherin的表達則減少，并且Versican與N-cadherin呈正相關，與E-cadherin呈負相關，Versican是胃癌患者預后的獨立危險因素，這提示Versican可能是通過調節胃癌細胞上皮-間質轉化來促進胃癌發生浸潤、轉移的，Versican有望成為判斷胃癌預后的標志物，其具體機制需開展后續實驗予以進一步證實。