滑膜間充質干細胞外泌體源性miR-376b-3p靶向MYC抑制骨關節炎進展①

牛學剛 劉朝旭 劉一帆 （聊城市中醫醫院骨創傷科，聊城 252000）

骨關節炎（osteoarthritis，OA）是一種以關節軟骨退化、骨結構改變、滑膜炎癥和疼痛為特征的常見退行性關節?。?］。非甾體抗炎藥是目前OA治療的常用手段，能夠有效緩解關節疼痛，晚期OA患者治療則采用常規關節置換手術，但均有一定局限性［2］。

miRNAs已成為骨骼病理生理學中有前途的治療靶點，能夠調節OA進展［3-5］。最新研究顯示，miR-376-3p在OA軟骨組織中異常低表達，高水平的miR-376b-3p能夠減輕OA細胞炎癥損傷，發揮保護作用［6］。另外，人滑膜間充質干細胞（synovial mesenchymal stem cells，SMSCs）可分泌攜帶 miRNAs的外泌體（exosome，exo），對OA起保護作用［7］。MYC是作用廣泛的轉錄因子，通過多種機制調節細胞分化和增殖，包括靶基因轉錄擴增，MYC能夠激活MAPK通路進而促進OA進展［8］。本研究以miR-376b-3p為切入點探索exo源性miR-376b-3p調控MYC參與OA進程的具體機制，為OA治療提供新的依據。

1 材料與方法

1.1 材料 HC-A細胞購于美國典型菌株保藏中心；LipofectamineTM3000購于美國Invitrogen公司；載體及PCR引物購于南京金斯瑞生物科技有限公司；TRIzol試劑、RIPA裂解液、CCK-8試劑盒、Annexin V-FITC/PI細胞凋亡檢測試劑盒、BCA試劑盒購于北京索萊寶生物科技公司；ELISA試劑盒購于武漢華美生物工程有限公司；相關抗體均為英國Abcam公司產品；轉染序列由上海吉瑪基因公司設計合成；雙熒光素酶報告基因試劑盒購于上海翊圣；Superscript Ⅲ cDNA synthesis kit、SYBR Premix Ex Taq 購于美國Thermo Fisher；GW 4869外泌體抑制劑購于翌圣生物。

1.2 方法

1.2.1 生物信息學分析 從NCBI數據庫的GEO數據庫獲取miRNAs差異表達芯片數據集GSE79258，包括2個腰椎間盤突出（lumbar disc herniation，LDH）患者關節軟骨樣本和2個OA患者關節軟骨樣本miRNA測序信息。Starbase（http：//starbase.sysu.edu.cn/）和 Targetscan（http：//www.targetscan.org/vert_72/）查詢miR-376b-3p下游靶基因，在線工具Venny 2.1.0（https：//bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/index.html）繪制韋恩圖。借助KOBAS在線預測網站（http：//kobas.cbi.pku.edu.cn/）進行KEGG功能富集分析，DisGeNET數據庫（https：//www.disgenet.org/）查詢OA疾病風險基因（C0409959）。String數據庫（https：//string-db.org）分析蛋白互作關系。

1.2.2 組織樣本采集 人滑膜樣本取自2019年12月至2020年12月于聊城市中醫醫院進行全膝關節置換術的59例OA患者膝關節軟骨，術中無菌提取和分離患者滑膜組織，男性23例，女性36例，平均年齡（62.15±3.12）歲。選取同期在聊城市中醫醫院因外部創傷行膝關節截肢手術的15例患者作為對照組（Non-OA）。Non-OA組患者過往無膝關節創傷及手術史，臨床資料完整且未合并器質性疾病或自身免疫病。OA組患者根據Kellgren和Lawrence分級系統（Kellgrenand Lawrence grading，KLG）分為Early OA組（KLG＜2，n=16）、Middle OA組（KLG=2，n=29）和Late OA組（KLG＞2，n=14）。OA患者納入標準：①符合美國風濕病協會推薦的OA診斷標準；②臨床病歷資料完整；③未患有其他反應性關節炎等關節疾?。虎芙谖词褂眠^糖皮質激素或甾體類抗炎藥。排除標準：①接受過膝關節相關手術；②合并有器質性疾病、自身免疫系統疾病及其他可能影響本研究結果的疾病患者。本研究方案經聊城市中醫醫院院倫理委員會批準，受試者及家屬知情同意。

1.2.3 SMSCs分離與鑒定 OA滑膜標本用PBS沖洗，剪為1 mm3組織碎塊，加入約10倍體積的Ⅱ型膠原酶消化3 h，過100目篩，1 500 r/min離心5 min，含10%胎牛血清的高糖培養基重懸后繼續培養，細胞貼壁后傳代。取第五代細胞，采用含EDTA的0.25%胰蛋白酶消化，含3%BSA的PBS孵育30 min，添加APC熒光Anti-CD34抗體、PE熒光Anti-CD44抗體、APC熒光Anti-CD73抗體及FITC熒光Anti-CD45抗體，流式細胞儀對處理后的細胞進行表型分析。CD34、CD45低表達，CD44和CD73高表達提示SMSCs分離成功。

1.2.4 SMSCs源性exo分離與鑒定 取細胞培養上清，加入0.2 ml分離純化溶液充分混勻，4 ℃孵育過夜，離心，去除殘余溶液，沉淀即為exo。透射電鏡觀察exo形態并拍照，Western blot檢測exo標志蛋白表達。

1.2.5 細胞培養及鑒定 HC-A細胞復蘇后采用DMEM培養基培養，補充10%胎牛血清和100 U/ml青鏈霉素，培養條件為37 ℃、5%CO2，每24 h更換1次新鮮培養基。細胞達到80%融合后0.25%胰蛋白酶消化傳代，將第三代細胞分別用10 ng/ml IL-1β培養0 h、3 h、6 h、12 h，建立OA體外細胞模型。

1.2.6 轉染與分組 將inhibitor-NC、miR-376b-3p inhibitor質粒轉染至對數生長期SMSCs，按1.2.4分離exo，將pc-DNA3.1、pc-MYC質粒轉染至對數生長期HC-A細胞。轉染步驟依據LipofectamineTM3000轉染試劑說明書進行。收集不同轉染組SMSCs-Exo與不同組轉染H-CA細胞共培養72 h，配制GW6849工作液至1.43 mmol/L，加入細胞培養基處理30 min。

1.2.7 qRT-PCR檢測目標基因表達 TRIzol法提取總RNA，Nanodrop紫外分光光度計檢測濃度、純度，采用Superscript Ⅲ cDNA synthesis kit合成cDNA，qRT-PCR檢測試劑盒為SYBR Premix Ex Taq，以cDNA為模板，以特異性引物為正向引物進行qRTPCR反應。miR-376b-3p以U6為內參，MYC以GAPDH為內參。Real-Time PCR 儀進行相應PCR反應，條件為：95 ℃ 3 min；95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，40個循環。2-ΔΔCt計算相對表達。引物序列見表1。

表1 引物序列Tab.1 Primer sequences

1.2.8 Western blot檢測目標蛋白表達 收集細胞離心，沉淀中加入預冷RIPA細胞裂解液冰上振蕩裂解30 min，轉移上清，按BCA試劑盒說明對蛋白濃度進行定量分析。取蛋白樣本10%SDS-PAGE凝膠電泳分離，轉至PVDF膜，TBST溶液阻斷，洗膜，加入稀釋的一抗GAPDH（1∶1 000）、CD9（1∶2 000）、CD63（1∶1 000）、Calnexin（1∶1 000） 4 ℃孵育，次日取出，室溫復蘇1 h，TBST沖洗10 min，添加過氧化物酶標記的山羊抗兔二抗IgG（1∶1 000）孵育2 h，TBST沖洗，ECL化學發光液滴加至PVDF膜，自動凝膠成像儀拍照，Image J量化分析目標條帶蛋白表達強度，根據GADPH進行歸一化處理。

1.2.9 雙熒光素酶報告實驗檢測靶向關系 根據在線生物預測網站預測的特異性結合位點擴增MYC 3'UTR片段，克隆至熒光素酶報告載體，即MYC-WT。再對原結合位點進行定點突變，擴增并克隆至載體，即MYC-MUT。將以上質粒分別與mimic-NC、miR-376b-3p mimic共轉染至細胞，按LipofectamineTM3000試劑盒說明進行，轉染48 h后按雙熒光素酶基因報告試劑盒說明檢測，以海腎熒光素酶為對照熒光素酶報告基因進行歸一化。

1.2.10 CCK-8檢測細胞增殖 共培養后將細胞接種于96孔板，37 ℃、5%CO2培養，0 h、24 h、48 h、72 h時每孔加入10 μl CCK-8溶液繼續孵育1 h，檢測490 nm處吸光度。各樣品檢測3次。

1.2.11 流式細胞術檢測細胞凋亡 將各組共培養的HC-A細胞接種至96孔板，當細胞達到60%～80%融合時加入PBS緩沖液調整濃度，制成細胞懸液，加入 Annexin V-FITC/PI各 5 μl，混勻，避光孵育15 min，流式細胞儀下檢測并計算細胞凋亡。

1.2.12 ELISA檢測免疫相關因子分泌水平 取細胞上清，常規梯度密度離心去除懸浮顆粒物，ELISA試劑盒檢測上清中TNF-α、IL-6水平，按試劑盒說明操作，多功能酶標儀檢測490 nm處各孔吸光度（OD）。

1.3 統計學分析 采用SPSS23.0軟件處理數據，符合正態分布與方差齊性的計量資料采用±s表示，采用t檢驗與單因素方差分析結合Tukey's檢驗。計數資料以n表示，采用卡方檢驗或Fisher確切概率檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 OA組織與細胞系中miR-376b-3p表達下調篩選GSE79258數據集中差異表達的miRNAs，發現miR-376b-3p在OA組織中表達顯著低于LDH組織（圖1A）。相對于Non-OA組，OA組織中miR-376b-3p表達顯著降低（P＜0.05，圖1B）。進一步根據KLG分級檢測不同階段OA患者miR-376b-3p表達，結果發現miR-376b-3p水平隨病程延長而下降（均P＜0.05，圖1C）。IL-1β處理后發現，與0 h相比，IL-1β處理的HC-A細胞miR-376b-3p表達呈時間依賴性下調（均P＜0.05，圖1D）。提示miR-376b-3p低表達可能與OA發生發展相關。

圖1 OA組織與細胞系中miR-376b-3p表達下調Fig.1 miR-376b-3p expression was down-regulated in both OA tissue and cells

2.2 SMSCs源性exo中miR-376b-3p表達增加 流式細胞術結果顯示，間充質干細胞標志物CD73和SMSCs標志物CD44陽性表達率分別為98.59%、99.54%，而CD34和CD45陽性表達率僅為1.59%、0.38%，提示SMSCs分離成功。透射電鏡下可見exo具有雙層膜結構的圓盤狀顆粒（圖2A）。Western blot結果顯示，相對于對照組，CD9與CD63在exo中高表達，而Calnexin在SMSCs-Exo組不表達（均P＜0.05，圖2B），SMSCs-Exo鑒定成功。將HC-A細胞與SMSCs-Exo共培養，結果顯示，相對于HC-A組，HC-A+SMSCs-Exo組miR-376b-3p表達增加（均P＜0.05），加入exo抑制劑GW4869后miR-376b-3p表達被抑制（均P＜0.05，圖2C），提示SMSCs-Exo能夠攜帶miR-376b-3p進入HC-A細胞。

圖2 SMSCs源性exo分離及miR-376b-3p表達Fig.2 Exo separated from SMSCs and expression of miR-376b-3p

2.3 SMSCs源性exo能抑制軟骨細胞凋亡和炎癥反應，并促進其增殖 IL-1β可顯著抑制HC-A細胞增殖，誘導細胞凋亡，該效應可被SMSCs-Exo部分逆轉（均P＜0.05，圖3A、B）。ELISA結果顯示，IL-1β可提高TNF-α、IL-6水平，這些變化可被SMSCs-Exo部分逆轉（均P＜0.05，圖3C）。提示SMSCs-Exo可促進HC-A細胞增殖，抑制其凋亡和炎癥反應，改善OA軟骨細胞炎癥損傷。

圖3 SMSCs源性exo抑制軟骨細胞凋亡和炎癥反應并促進其增殖Fig.3 Apoptosis and inflammatory response of chondrocyte were inhibited and proliferation was promoted by SMSCs-derived exo

2.4 SMSCs通過調控miR-376b-3p減輕OA損傷qRT-PCR顯示，SMSCs-miR-inhibitor-Exo組miR-376b-3p表達較陰性轉染SMSCs-inhibitor-NC-Exo組顯著降低（均P＜0.05，圖4A）。與陰性對照組相比，與SMSCs-miR-inhibitor-Exo共培養的HC-A細胞miR-376b-3p表達顯著降低（均P＜0.05，圖4B）。SMSCs-miR-inhibitor-Exo組較SMSCs-inhibitor-NC-Exo組細胞增殖活力降低、凋亡率升高，炎癥因子TNF-α和IL-6水平上調（均P＜0.05，圖4C～E）。提示SMSCs-Exo通過分泌miR-376b-3p有效抑制OA進展。

圖4 SMSCs通過調控miR-376b-3p抑制OA進展Fig.4 SMSCs inhibits progression of OA by regulating miR-376b-3p

2.5 MYC是miR-376b-3p的下游靶點 TargetScan和StarBase獲取miR-376b-3p的下游靶基因并取交集，結果顯示，共有528個交集基因（圖5A）；KEGG功能富集分析結果顯示，miR-376b-3p的靶基因顯著富集于干細胞多能性信號通路（圖5B）；將該通路的16個基因與DisGeNET獲取的OA疾病風險基因（C0409959：GDF5、SBNO1、LTBP1和WWP2）進行蛋白互作分析，結果顯示，MYC與OA風險基因及干細胞多能性通路相關基因具有較強的相關性（圖5C）。miR-376b-3p可直接靶向作用于MYC（均P＜0.05，圖5D、E）。OA組MYC表達較Non-OA組上調（均P＜0.05，圖5F），且與OA中miR-376b-3p表達呈負相關（r=-0.287 2，P=0.027 4，圖5G），提示MYC可能作為miR-376b-3p的下游靶點在OA中損傷軟骨細胞。

圖5 MYC是miR-376b-3p的下游靶點Fig.5 MYC is downstream target of miR-376b-3p

2.6 MYC促進軟骨細胞凋亡和炎癥反應并抑制其增殖，exo源性miR-376b-3p可部分逆轉該作用 qRTPCR結果顯示，MYC能穩定高表達于轉染pc-MYC的細胞（P＜0.05，圖6A）。共培養后發現，與pc-MYC組相比，pc-MYC+SMSCs-Exo組MYC表達下調（P＜0.05，圖6B）。功能試驗結果顯示，與pc-DNA3.1組相比，pc-MYC組細胞增殖活力降低、凋亡數增加、TNF-α及IL-6水平升高（均P＜0.05），而與pc-MYC組相比，pc-MYC+SMSCs-Exo組細胞增殖活力升高、凋亡率、TNF-α 及 IL-6水平降低（均P＜0.05，圖6C～E）。提示exo中高水平的miR-376b-3p通過負調控MYC表達抑制OA進展。

圖6 SMSCs-Exo源性miR-376b-3p/MYC對軟骨細胞增殖、凋亡及炎癥反應的影響Fig.6 Effects of SMSCs-Exo derived miR-376b-3p/MYC on proliferation，apoptosis and inflammatory response of chondrocytes

3 討論

研究顯示，exo是一類雙層膜結構囊泡，直徑約100 nm，由不同類型活細胞分泌，與其源性細胞具有類似生物功能，但不產生明顯免疫原性或致瘤性等不良反應，通過攜帶蛋白和遺傳物質等作為載體將信息穩定傳遞至受體細胞，與受體細胞融合并調控基因表達［9］。SMSCs源性exo在OA治療中的作用不可或缺，如SMSCs源性exo可顯著改善OA關節內衰老細胞積累的微環境［10］。SMSCs源性exo能將miR-140-5p傳遞至軟骨細胞，促進軟骨細胞增殖［11］。miR-31經SMSCs源性exo包裝、攜帶，傳遞至軟骨細胞，通過調控KDM2A基因促進軟骨細胞增殖、遷移及軟骨形成，有效改善了OA導致的軟骨損傷和炎癥［12］。因此認為SMSCs源性exo可有效治療并預防OA。

為尋找更有效的生物靶向分子，本研究通過GEO數據庫分析發現，miR-376b-3p在OA組織中表達下調。已有研究發現，一些miRNAs對OA發揮抗凋亡和抗炎作用，其中包含miR-376b-3p［6］。本研究通過qRT-PCR發現，miR-376b-3p在OA中異常低表達，且隨著OA病程延長表達逐漸下調。軟骨退化、軟骨細胞衰老是OA的主要特征，而IL-1β是一種促炎癥細胞因子，可導致軟骨組織及細胞損傷［13］。因此本研究在體外采用促炎因子IL-1β誘導并模擬OA損傷建立細胞模型，發現miR-376b-3p水平呈時間依賴性下調。隨后從滑膜組織中分離SMSCs，并進一步從SMSCs中分離exo，將exo與軟骨細胞共培養后發現，SMSCs源性exo可減輕IL-1β誘導的HC-A細胞凋亡，同時抑制炎癥反應，提高細胞增殖活力。而抑制SMSCs源性exo中miR-376b-3p表達，該效果減弱，提示SMSCs源性exo抑制OA進程的作用可能通過攜帶高水平miR-376b-3p實現。

為探索SMSCs源性exo攜帶的miR-376b-3p對OA的具體作用機制，本研究借助一系列在線生物預測網站，結合文獻篩選并確定miR-376b-3p的下游靶基因MYC。MYC被證明可影響破骨細胞分化，且與OA發病機制緊密相關［14］。在大鼠早期OA踝突軟骨細胞中表達上調，下調其表達可促進踝突軟骨細胞增殖、肥大和遷移［15］。本研究證明MYC具有促OA炎癥損傷作用，而該作用能被攜帶高水平miR-376b-3p的exo部分逆轉，表明SMSCs源性exo中miR-376b-3p可影響OA進展，該作用可能通過調節MYC基因實現。

綜上，SMSCs源性exo能夠攜帶miR-376b-3p通過調控MYC表達參與OA進展，首次提出SMSCs源性exo中的miR-376b-3p可被用作OA的治療性生物標志物，為OA治療策略研究提供了新的視角。本研究未針對性開展體內實驗，且樣本量有限，因此仍存在一定局限性。