膿毒癥對新生小鼠遠期認知功能障礙的機制研究①

王海川 陽 倩 唐彬秩 李茂軍 石 偉 吳 青

（四川省醫學科學院·四川省人民醫院兒科，成都 610072）

膿毒癥是新生兒常見危急重癥，病死率高，預后差，膿毒癥相關性腦病是常見并發癥，對小兒腦損傷嚴重，影響其遠期生活質量，臨床癥狀主要以譫妄、意識水平改變為主要特征，輕者表現為煩躁不安、注意力缺陷，嚴重者可導致遠期認知功能障礙，智力低下、學習能力減弱、執行功能障礙，部分患兒甚至可遺留癇性發作，導致患兒死亡風險上升［1-3］。

目前有關新生兒膿毒癥相關性腦病導致遠期認知功能障礙的研究較少，發病機制尚不明確，主要集中在信號傳導學說、炎癥反應學說、谷氨酸導致的興奮性毒性學說等［4］。現研究主要聚焦于腦線粒體氧化呼吸鏈功能障礙后，導致神經元凋亡，大腦病理切片及影像學表現為囊性改變及局灶性液化壞死，中樞神經系統出現不可逆損傷，進一步導致患者發生遠期認知功能障礙［5］。但在臨床工作中也發現，有部分患兒雖經過治療后觀察到神經系統影像學無明顯的囊性改變或局灶壞死，但仍出現抑郁、焦慮及社交障礙，甚至在該類患兒中有14%嚴重病例需要進入特殊學校學習及心身醫學科的治療［6-7］。目前的研究未能全面解釋該病的發病原因，因此對其機制仍需進一步探討。

Tau蛋白是腦內含量最為豐富的微管相關蛋白，在學習記憶過程中發揮了重要作用，如參與神經元的營養及軸突的運輸、維持神經系統內部的正常生物學信號傳導［8］。在疾病狀態下，Tau蛋白出現過度磷酸化，導致神經元出現神經纖維纏結，損傷神經元，并進一步誘發患者出現認知功能障礙［9］。截至目前，國內外在新生兒膿毒癥介導的相關性腦病的研究中，關于中樞神經系統中的Tau蛋白是否出現異常磷酸化的研究較少，且Tau蛋白在其中的作用也尚不清楚。因此，本研究通過構建新生小鼠膿毒癥模型，探討新生兒膿毒癥導致患者遠期認知功能出現障礙，是否與Tau蛋白過度磷酸化存在關聯。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 C57BL/6J孕鼠購于北京維通利華實驗動物技術有限公司，體質量30 g左右。動物飼養在四川省人民醫院動物實驗中心，溫度20 ～25 ℃，相對濕度55%～65%，整個實驗過程和實驗操作符合國際實驗動物認可和評估委員會認證的要求。

1.1.2 藥品與試劑 脂多糖（lipopolysaccharide，LPS，L2880）、anti-pS396 抗體（ab109390，1∶5 000，Sigma公司）；戊巴比妥鈉（T8590，索萊寶公司）；PVDF膜（IPVH00010，Millipore公司）；脫脂奶粉（232100，BD公司）；anti-IL-1β抗體（ab9787，1∶1 000）、anti-TNF-α抗體（ab66579，1∶1 000）、anti-pS404抗體（2691-1，1∶5 000，Abcam公司）；anti-Tau抗體（MA-12808，1∶1 000，ThermoScientific公司）；anti-GAPDH抗體（ZSGB-BIO，1：2 000，中杉金橋公司）；anti-MouseIgG-HRP 抗體（M210015，1∶1 000）、anti-RabbitIgG-HRP抗體（M210025，1∶1 000，Abmart公司）；Donkey anti-Mouse（AlxaFluor594）抗 體（A-21203，1∶400，Invitrogen公司）；TNF-α ELISA試劑盒（MB-2868B）、IL-1β ELISA試劑盒（MB-2776B，江蘇酶標生物科技有限公司）。

1.1.3 主要儀器 BIO-RAD MiniPROTEAN Tetra電泳儀、BIO-RAD Trans-Blot半干轉膜儀（BIO-RAD，美國）；低溫離心機（Heal Force Neofuge 13R，中國）；全波長酶標儀（MD Spectra Max 190，美國）；BIORAD Chemical XRS+顯影系統（Bio-Rad，美國）。

1.2 方法

1.2.1 動物模型的建立 選取出生后第5天C57BL/6J小鼠腹腔注射LPS（100 μg/kg），誘導全身炎癥反應，構造膿毒癥小鼠模型。選取經LPS干預下且存活至8周的小鼠12只設為模型組，正常小鼠12只設為對照組。

1.2.2 行為學實驗評估 采用曠場實驗、新奇實驗、新物體位置識別實驗分別評估C57BL/6J小鼠記憶和焦慮行為。曠場實驗：將小鼠放置在正方形的場地（長48 cm×寬48 cm ×高30 cm）中央，通過頂部的攝像機觀察實驗小鼠在5 min內的活動總距離和在角落區域內的時間，結果通過EthoVision8.5軟件來進行數據分析。新奇實驗：在一正方形的箱內（長48 cm×寬48 cm×高30 cm）讓小鼠自由活動10 min，以熟悉周圍環境。然后將實驗小鼠放回原居住鼠籠。把A、B兩個相同物體放入箱內，并且固定好位置，再次放入實驗小鼠，讓其自由探索10 min，探索完成后再將小鼠放回鼠籠。第2天將試驗用物A替換為物C，物B位保持原位置，再將實驗小鼠放入箱中，讓其活動10 min，記錄小鼠在B、C兩個物體周圍活動的時間。新物體位置識別實驗是在原實驗環境及原實驗步驟的基礎上，將物A由原來位置換到新標記位置，物B保持原位置，記錄小鼠在A、B兩物體的活動時間，結果均通過EthoVision 8.5軟件進行數據分析處理。

1.2.3 Western blot蛋白水平測定 各組小鼠海馬組織，通過蛋白裂解試劑盒提取蛋白原液，采用Bandford法檢測蛋白濃度，每組取蛋白樣品20 μg進行SDS-PAGE電泳，跑膠完成后，將膠移至PVDF膜，轉膜完成后將膜放置5%脫脂牛奶封閉1 h，再添加Ⅰ抗4 ℃過夜。第2天給予含有辣根過氧化物酶的Ⅱ抗室溫下孵育2 h。BIO-RAD Chemical XRS+顯影系統對條帶顯影，采用Imege J 3.0軟件系統分別測定各組小鼠蛋白的灰度值。

1.2.4 ELISA檢測外周血清中IL-1β、TNF-α 稱量模型組及對照組小鼠體質量；取1%戊巴比妥鈉（60 mg/kg）腹腔注射麻醉；取模型組及對照組C57BL/6J小鼠外周血，置于室溫后1 h，4 ℃，2 000 r/min離心20 min后吸取血清備用，按照小鼠IL-1β、TNF-α試劑盒的檢測方法檢測小鼠血清中IL-1β、TNF-α的含量。

1.2.5 免疫熒光檢測海馬齒狀回腦區Tau蛋白稱量模型組及對照組小鼠體質量，取1%戊巴比妥鈉（60 mg/kg）腹腔注射麻醉。經心臟用4%多聚甲醛灌注后取出腦組織，用冷凍包埋劑包埋組織后，利用冷凍切片機切片（40 μm），切片完成后放置-20 ℃冰箱中保存。將切片用PBS液沖洗3次，每次5 min。加入5%的驢血清進行封閉，室溫2 h。加入Ⅰ抗Tau（1∶150），在4 ℃下孵育過夜。次日用PBS液沖洗3次，每次5 min。加入熒光Ⅱ抗，在室溫下孵育2 h，用PBS液沖洗3次，每次3 min。最后加入含有Dapi的熒光淬滅液封片。采用熒光顯微鏡對海馬組織中齒狀回腦區Tau蛋白的表達進行觀察，Image J 3.0軟件系統對拍攝的圖片進行統計分析。

1.3 統計學分析 數據以±s表示。使用SPSS21.0統計軟件對實驗數據進行統計檢驗處理。對各組數據進行正態性和方差齊性檢驗，數據呈正態分布，采用獨立樣本t檢驗進行統計學分析。P＜0.05時認為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 行為學測試結果 在行為學實驗中發現，模型組小鼠與對照組小鼠相比，在測定運動距離及角落時間方面明顯滯后于對照組，差異有統計學意義（P＜0.05，圖1A、B）；測定模型組小鼠與對照組小鼠對新物體識別及物體位置探索后發現，模型組小鼠對新物體和物體位置沒有明顯的偏好，兩組比較差異有統計學意義（P＜0.01，圖1C、D）。

圖1 曠場試驗、新奇試驗和新物體位置識別試驗Fig.1 Open field test，novel object recognition test and new object position recognition test

2.2 外周血清IL-1β、TNF-α水平檢測 與對照組水平相比，在出生后8周時模型組小鼠外周血清IL-1β、TNF-α 水平差異無統計學意義（P＞0.05，圖2）。

圖2 外周血清IL-1β和TNF-α的水平檢測Fig.2 Levels of IL-1β and TNF-α in peripheral serum

2.3 腦組織中IL-1β、TNF-α、Tau蛋白和磷酸化Tau蛋白的表達 在出生后8周時模型組小鼠腦組織中IL-1β和TNF-α的表達高于對照組，差異有統計學意義（P＜0.05，圖3A）；此外，與對照組相比，模型組小鼠Tau蛋白表達顯著上調，第396和第404蘇氨酸位點的磷酸化水平顯著上升，差異有統計學意義（P＜0.05，圖3B）。

圖3 腦組織內IL-1β和TNF-α、Tau蛋白和磷酸化Tau蛋白的表達Fig.3 Expression of IL-1β and TNF-α，Tau protein and phosphorylated Tau protein in brain tissue

2.4 免疫熒光觀察海馬齒狀回腦區中Tau蛋白表達 在病理切片上，模型組小鼠海馬齒狀回腦區Tau蛋白的表達相較于對照組小鼠明顯升高，差異有統計學意義（P＜0.05，圖4）。

圖4 小鼠海馬齒狀回腦區Tau蛋白表達（免疫熒光染色，×100）Fig.4 Expression of Tau protein in dentate gyrus of mouse hippocampus （immunofluorescence staining，×100）

3 討論

研究表明，線粒體功能障礙、谷氨酸興奮性毒性作用、中樞神經系統中神經元自噬現象均與新生兒膿毒癥相關性腦病的遠期認知功能障礙存在關聯［10］。本研究發現膿毒癥小鼠在出生后8周時行為學出現異常，考慮可能與炎癥反應作用于機體后導致大腦功能受損，行為學出現異常存在關聯。全身炎癥反應早期機體炎癥因子大量釋放，內皮細胞遭到破壞后，血腦屏障通透性增加，炎癥因子IL-1β、TNF-α、IL-10進一步作用于免疫細胞， CD4+T淋巴細胞的循環轉移，導致大腦內CD4+T淋巴細胞數量增加，外周血中CD4+T細胞減少，促進Th1淋巴細胞向Th2淋巴細胞的轉化增加，加速免疫失衡進程［11-12］。本次實驗測定模型組腦內IL-1β和 TNF-α的含量明顯高于對照組，該實驗結果同國內外文獻報道一致，表明膿毒癥小鼠腦內存在炎癥反應［13］。

國內有學者研究報道膿毒癥后期腦組織出現了局部囊性改變或液化壞死病灶，主要發生在海馬、枕葉部位，海馬組織參與學習、記憶及情感調控，海馬組織病變與行為學異常密切相關［14］。目前國內外較多的膿毒癥模型多采用出生后1個月或成熟期小鼠作為動物模型，本次實驗與以往研究有所不同，采用出生5 d幼鼠造模，觀察了海馬區Tau蛋白的變化。生命早期免疫功能尚不成熟，機體對炎癥因子的打擊反應程度不同，機體的應激反應也存在差異性，導致器官損傷部位及程度也不盡相同［15-16］。本實驗從模型構造的差異性及誘發全身炎癥反應的不同狀態出發，來探討其遠期認知功能障礙的可能發病機制。

本次實驗同時測定外周血清中IL-1β、TNF-α的濃度，對照組與模型組無明顯差異，目前研究報道疾病早期外周及顱內炎癥因子均升高二者存在一致性，而后期二者相關性的研究目前暫無文獻報道，考慮與機體外周免疫調節與中樞神經系統免疫調節機制可能存在不同的信號通路存在關聯［17-18］。顱內神經系統小膠質細胞活化后，導致炎癥瀑布反應持續存在，慢性炎癥因子浸潤，神經元出現不可逆損傷［19-20］。而外周大部分組織器官代償增生能力較強，通過免疫自穩促進機體的自身修復來降低炎癥因子損傷，使顱內炎癥因子明顯升高，而外周炎癥因子無明顯變化［21-22］。

Tau蛋白是腦內含量最為豐富的微管相關蛋白，可分泌神經營養因子，參與維持大腦正常發育［23］。Tau蛋白是否參與了新生兒膿毒癥相關性腦病遠期認知功能障礙的發病機制，目前國內外相關報道較少。通過本次研究發現，顱內炎癥因子含量明顯升高時，Tau蛋白也呈現出過度磷酸化狀態，考慮二者之間可能存在關聯性。炎癥狀態下，Ca2+可出現明顯的濃度差異，而鈣激酶活性受Ca2+濃度調節，鈣激酶可通過影響糖原合成酶激酶3 （glycogen synthase kinase 3，GSK3）來參與調節Tau蛋白磷酸化［24-25］。目前已有研究發現GSK3主要通過促進Tau蛋白 Thr205、Thr212、Ser214、Thr217和 Ser396/404多個位點發生過度磷酸化參與認知功能障礙［26-28］。GSK3磷酸化位點的不同，發揮的生物活性也存在差異，如ser9位點的磷酸化可抑制鈣激酶對GSK3的剪切及抑制作用［29-30］。目前已有文獻報道Tau蛋白磷酸化位點多以Ser202/205位點為主［31］。本實驗發現Tau蛋白主要以Ser396/404磷酸化位點表達上調，與既往報道磷酸化位點有所不同，有研究報道小鼠腦損傷后檢測3個月時顱內Tau蛋白磷酸化水平無明顯變化，而在16個月時才出現明顯異常，考慮Tau蛋白磷酸化位點的不同及時間差異性，可能與腦損傷的年齡段、原發疾病及試驗對象品系基因易感性相關［32-33］。

綜上所述，在本次實驗中發現膿毒癥小鼠出現了遠期行為學異常，外周血清中炎癥因子無明顯變化，但海馬組織中炎癥因子濃度升高，且出現Tau蛋白過度磷酸化，考慮到炎癥因子作用于中樞神經系統后，導致免疫失衡及Tau蛋白異常，這可能是膿毒癥相關性腦病發生遠期行為學異常的重要原因。因此對中樞神經系統免疫功能的研究，將有助于更好地探討新生兒膿毒癥及其遠期認知功能障礙可能的發病機制。