維生素D通過調控Traf6/TAK1通路抑制2型糖尿病腎病大鼠腎小管上皮細胞間充質轉分化

薛 莉 瞿 偉 （南通市中醫院，南通 226001）

隨著人們生活方式的改變和老齡化社會的加劇，2型糖尿病（type 2 diabetes mellitus，T2DM）患病率逐年上升，成為繼心腦血管疾病及腫瘤后威脅人類健康的又一嚴重疾病［1］。糖尿病腎病（diabetic kidney disease，DKD）是T2DM的常見并發癥，臨床特征為腎小管上皮細胞肥大、腎小管基底膜增厚，進而出現微量白蛋白尿、大量蛋白尿、腎小管間質纖維化（renal interstitial fibrosis，RIF）及腎小球硬化等，最終導致終末期腎病［2］。其中RIF是終末期腎病最典型的病變，也是多種腎病發展為終末期腎功能衰竭的共同環節，而上皮細胞間充質轉分化（epithelial mesenchymal transition，EMT）是形成RIF的主要病變途徑。因此抑制EMT對預防慢性腎病具有重要價值［3］。腫瘤壞死因子受體相關分子6（tumor necrosis factor receptor associated factor 6，Traf6）是Toll樣受體家族成員，參與介導Toll樣受體與腫瘤壞死因子受體的信號傳導，Traf6可以使轉化生長因子β活化激酶1（transforming growth factor β activated kinase 1，TAK1）磷酸化，進而誘導炎癥、凋亡及氧化應激的發生［4-5］。另外Traf6還參與腎小管上皮細胞轉分化過程［6-7］。維生素D（vitamin D，Vit D）是脂溶性維生素，活性形式為25-羥維生素D3［25-（OH）D3］，其主要來源于食物或由暴露在紫外光下的皮膚合成。近年來研究發現Vit D對胰島細胞具有一定的保護作用，Vit D是否影響DKD患者腎小管EMT鮮有報道。

本研究通過觀察Vit D對鏈脲佐菌素（streptozotocin，STZ）誘導的DKD大鼠Traf6/TAK1信號通路的調控作用、炎癥反應及腎小管EMT的影響，進一步探究Vit D在DKD發生、發展中的作用，為Vit D臨床防治RIF提供依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 48只8周齡、體質量為（250±10） g的SPF級SD雄性大鼠購自北京生物制品研究所有限責任公司，生產許可證號為SYXK（京）2020-0031。飼養環境為室溫23 ℃、標準濕度60%、12 h/12 h晝夜交替、正常供給飼料和飲用水、分籠飼養。飼養1周后用于實驗。本研究實驗經醫院倫理委員會批準。

1.1.2 主要試劑和儀器 STZ（美國Sigma公司）；骨化三醇膠丸（上海羅氏制藥有限公司）；E-cadherin抗體（美國Protein-tech公司）；α-SMA抗體（美國Selleck公司）；Traf6、p-TAK1抗體（美國CST公司）；辣根過氧化物酶標記的二抗（北京博爾西科技有限公司）；RIPA裂解液、BCA蛋白濃度測定試劑盒（北京中杉金橋生物技術有限公司）；TGF-β1抗體、ELISA試劑盒（武漢博士德生物工程有限公司）；Thermo酶標儀（上海熱電儀器有限公司）；組織包埋機（德國Leica公司）；臺式冰凍離心機（美國Beckman公司）；蛋白電泳儀（美國Bio-Rad公司）；光學顯微鏡（日本Olympus公司）；便攜式血糖監測儀（德國ACCU-Chek公司）。

1.2 方法

1.2.1 造模、分組和留樣 將48只大鼠隨機分為對照組（Control組）、模型組（Vehicle組）、治療組（Vit D組）。模型制作：Control組喂普通飼料，Vehicle組及Vit D組喂高脂高糖飼料（飼料配方：10%煉豬油，20%蔗糖，2%膽固醇，8%蛋黃粉，60%普通飼料），6周后Vehicle組及Vit D組大鼠空腹12 h后腹腔注射小劑量STZ（30 mg/kg）。注射3 d后，隨機檢測血糖，連續3次非同日尾靜脈注射≥16.7 mmol/L STZ為T2DM大鼠。T2DM成模大鼠在STZ注射后6周和7周時檢測晨尿中微量蛋白含量，若連續3次以上為陽性，則為DKD大鼠。DKD大鼠建模成功后，Vit D組給予0.03 μg/（kg·d）骨化三醇（溶于0.05 ml花生油）灌胃8周，Vehicle組給予等量花生油灌胃，Control組不做任何處理。8周后收集大鼠24 h尿液，測定24 h尿蛋白含量及尿量。腹腔注射0.3%戊巴比妥鈉（3 ml/kg）麻醉大鼠，心臟穿刺取血，分離血清，保存于-20 ℃備用，測定FBG、血肌酸酐、血尿素氮含量。處死大鼠后，分離兩側腎，取皮質部分，切成1 mm×1 mm×1 mm的小塊，部分用4%多聚甲醛固定，部分浸入RNA later液中，置于-80 ℃保存待測。

1.2.2 生化指標檢測 采用德國ACCU-Chek血糖儀測定FBG，Olympus全自動生化分析儀檢測尿蛋白、血肌酸酐、血尿素氮。采用ELISA法檢測血清中IL-6、IL-1β及TNF-α含量。

1.2.3 HE染色觀察腎臟組織形態學改變 取出用4%多聚甲醛固定的腎臟組織，進行脫水透明、石蠟包埋、脫蠟等操作，蘇木素染色5～6 min，伊紅染液染30 s，之后乙醇梯度脫水、透明、中性樹膠封片，顯微鏡（×400）下觀察大鼠腎臟組織病理學改變。

1.2.4 Masson染色觀察腎臟組織纖維化改變 切片進行常規脫蠟，蘇木素染色10 min，麗春紅酸性復紅液染色5 min，磷鉬酸溶液分化5～10 s，亮綠染色6～8 min，乙醇梯度脫水，中性樹膠封片，顯微鏡（×400）下觀察大鼠腎臟組織纖維化程度。

1.2.5 免疫組化觀察腎臟 E-cadherin、TGF-β1、α-SMA表達 石蠟切片經60 ℃熔蠟、二甲苯脫蠟、乙醇梯度脫水后，進行高壓抗原修復，分別滴加一抗E-cadherin、TGF-β1、α-SMA（1∶200）孵育過夜，二抗（辣根過氧化物酶標記）孵育20 min，DAB顯色液顯色，蘇木精復染，乙醇梯度脫水、透明、封片，顯微鏡（×200）下鏡檢。陽性染色為棕黃色，隨機選取5個視野，利用Image J軟件進行陽性面積統計。

1.2.6 Western blot法檢測Traf6、p-TAK1蛋白的表達 取凍存的腎臟組織，加入RIPA裂解液，超聲勻漿提取總蛋白，BCA蛋白檢測試劑盒測定蛋白濃度。將蛋白沸水浴變性，取等量變性后的蛋白進行SDS-PAGE電泳，濕轉至PVDF膜，用含5%脫脂牛奶死亡 TBST封閉 2 h，加入一抗 Traf6、p-TAK1（1∶2 000）4 ℃孵育過夜，TBST漂洗3次，加入二抗（1∶10 000）室溫孵育2 h，用ECL化學發光劑進行顯影，以GAPDH作為內參校正，Image J軟件進行發光結果的灰度分析。

1.3 統計學分析 數據統計采用SPSS16.0軟件，作圖工具采用Graphpad5.0，計數資料采用n（%）表示，兩組間比較采用χ2檢驗，多組間比較采用單因素方差分析，P＜0.05表示差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 各組大鼠一般情況及血糖、腎臟指標比較Control組大鼠毛色順滑有光澤，飲食、飲水、尿量正常，體質量穩定增長，活動正常。給予高脂高糖喂養，腹腔注射STZ后，Vehicle組大鼠毛發暗淡無光澤，逐漸出現多飲、多食、多尿情況，逐漸消瘦，反應遲鈍，活動減少。給予骨化三醇灌胃后，Vit D組大鼠情況有所改善，毛發逐漸潤澤，飲食、飲水、尿量正常，精神逐漸恢復，體質量穩定增長。

與Control組相比，Vehicle組大鼠FBG、肌酐、尿素氮、24 h尿蛋白水平顯著升高（P＜0.05）；與Vehicle組相比，Vit D組大鼠FBG、肌酐、尿素氮、24 h尿蛋白水平明顯下降，差異具有統計學意義（P＜0.05，表1）。

表1 各組大鼠FBG、肌酐、尿素氮、24 h尿蛋白、尿量的比較（±s）Tab.1 Comparison of FBG， creatinine， urea nitrogen， 24 h urine protein and urine volume of rats in each group （±s）

表1 各組大鼠FBG、肌酐、尿素氮、24 h尿蛋白、尿量的比較（±s）Tab.1 Comparison of FBG， creatinine， urea nitrogen， 24 h urine protein and urine volume of rats in each group （±s）

Note：Compared with control group， 1）P＜0.01； compared with vehicle group， 2）P＜0.05.

Groups Control Vehicle Vit D FBG/（mmol·L-1）5.7±0.35 17.6±2.131）12.4±1.852）Creatinine/（μmol·L-1）97.85±7.32 146.36±8.441）121.75±6.242）Urea nitrogen/（mmol·L-1）5.23±0.45 9.16±0.761）7.56±0.682）24 h urine protein/mg 12.54±4.65 46.23±8.411）28.14±6.522）24 h urine volume/mg 23.56±6.32 126.85±9.341）76.24±8.462）

2.2 各組大鼠炎癥因子IL-6、IL-1β及TNF-α含量比較 ELISA結果顯示（圖1），與Control組相比，Vehicle組大鼠血清TNF-α、IL-1β和IL-6表達水平明顯升高（P＜0.05）；與Vehicle組相比，Vit D組大鼠TNF-α、IL-1β和IL-6表達水平明顯下降，差異具有統計學意義（P＜0.05，圖1）。

圖1 各組大鼠炎癥因子IL-6、IL-1β及TNF-α含量Fig.1 Levels of inflammatory factors IL-6， IL-1β and TNF-α in each group of rats

2.3 各組大鼠腎臟組織形態學改變比較 HE染色結果顯示（圖2），Control組大鼠腎小球、腎小管形態規則，囊壁結構完整；Vehicle組腎小球形態不規則，出現黏連、硬化，部分腎小管擴張，發生壞死，無囊壁結構，有明顯的炎癥細胞浸潤；Vit D組大鼠腎小球形態較規則，細胞數增多，腎小管水腫，有輕度擴張和炎癥細胞浸潤，囊壁結構完整。

圖2 各組大鼠腎臟組織形態學改變（×400）Fig.2 Morphological changes of rat kidney tissue in each group （×400）

2.4 各組大鼠腎臟組織纖維化改變比較 Masson染色結果顯示（圖3），Control組大鼠腎臟為大量紅染的正常腎臟組織，Vehicle組大鼠出現部分藍染的膠原纖維；Vit D組大鼠呈現散在藍染的膠原纖維。

圖3 各組大鼠腎臟組織形態學改變（×400）Fig.3 Morphological changes of rat kidney tissue in each group （×400）

2.5 各組大鼠腎臟組織E-cadherin、TGF-β1、α-SMA表達比較 免疫組化染色結果顯示（圖4），E-cadherin、TGF-β1、α-SMA蛋白陽性表達均呈棕黃色，Control組大鼠E-cadherin蛋白在腎小管上皮細胞呈強陽性表達，TGF-β1在腎小球和腎小管上皮細胞少量陽性表達，α-SMA在腎小管周圍和間質散在表達；與Control組相比，Vehicle組大鼠E-cadherin蛋白表達顯著減少，TGF-β1、α-SMA蛋白表達顯著增加；與Vehicle組相比，Vit D組E-cadherin蛋白表達顯著增加，TGF-β1、α-SMA蛋白表達顯著減少，差異具有統計學意義（P＜0.05）。

圖4 各組大鼠腎臟組織E-cadherin、TGF-β1、α-SMA表達Fig.4 Expression of E-cadherin， TGF-β1 and α-SMA in kidney tissues of rats in each group

2.6 各組大鼠腎臟組織Traf6、p-TAK1蛋白表達比較 Western blot結果顯示（圖5），與Control組相比，Vehicle組大鼠血清Traf6、p-TAK1蛋白表達水平顯著升高（P＜0.05）；與Vehicle組相比，Vit D組大鼠Traf6、p-TAK1蛋白表達水平明顯下降，差異具有統計學意義（P＜0.05）。

圖5 各組大鼠腎臟組織Traf6、p-TAK1蛋白表達Fig.5 Expressions of Traf6 and p-TAK1 protein in kidney tissues of rats in each group

3 討論

DKD是由糖尿病引起的微血管病變進而導致的腎小球硬化癥，是慢性腎病和腎衰竭的常見病因。其中RIF是進展為終末期腎病的必經途徑，而EMT是促進RIF的重要途徑。因此探索緩解腎小管EMT及纖維化的藥物，對于改善腎臟疾病具有重要意義。近年來Vit D對DKD的保護作用備受關注。研究表明Vit D能夠減少腎臟足細胞肥大，減輕蛋白尿及腎小球硬化，抑制炎癥因子的表達及巨噬細胞浸潤等，能有效緩解DKD大鼠腎臟損傷［8］。張曉玲等［9］發現缺乏Vit D與DKD的發生、發展有關，補充Vit D有助于DKD的治療。本研究中Vehicle組大鼠與Control組相比，毛發暗淡無光澤，出現多飲、多食、多尿情況，逐漸消瘦，反應遲鈍，活動減少，FBG、肌酐、尿素氮、24 h尿蛋白等指標水平顯著升高，腎小球出現黏連、硬化，部分腎小管擴張、壞死，說明制作DKD大鼠模型成功。給予Vit D干預后，Vit D組大鼠情況有所改善，毛發逐漸潤澤，飲食、飲水、尿量正常，精神逐漸恢復，體質量穩定增長，FBG、肌酐、尿素氮、24 h尿蛋白水平明顯下降，腎小球形態較規則，腎小管有輕度擴張。說明Vit D能有效改善DKD損傷，與以往研究結果一致。

腎臟組織長期浸潤在高血糖環境中，能夠引起炎癥細胞過量分泌，從而激活核因子、絲裂元活化蛋白激酶家族（MAPKs）等多種炎癥信號通路，誘發TNF-α、IL-1β和IL-6等炎癥因子的分泌［10］。TNF-α能夠損傷腎小管內皮細胞，造成細胞外基質沉積，導致 RIF［11］。IL-1、IL-6 可促進腎小球系膜細胞增殖，導致細胞外基質分泌增多和沉積［12］。Vit D能夠改善DKD炎癥狀態，通過上調IL-10等抗炎因子及抑制TNF-α、IL-1β和IL-6等促炎因子的表達調節炎癥的平衡［13］。趙耀等［14］發現高血糖能引起腎臟組織炎癥反應，DKD大鼠較正常組TNF-α和IL-6含量顯著上升。本研究中Vehicle組大鼠TNF-α、IL-6水平明顯升高，經過Vit D干預后，TNF-α、IL-6水平明顯降低，說明Vit D能夠減輕DKD大鼠炎癥反應，改善腎臟病理損害。

EMT發生后會遷移至間質區域，分泌大量細胞外基質，促進RIF的發生［15］。其中E-cadherin是腎小管上皮細胞的標志物，能夠維持腎臟上皮結構及功能，其表達減少是發生EMT的早期事件。TGF-β1是公認的EMT發生誘導劑，能夠單獨引起并參與整個EMT過程，從而誘導纖維化的發生。α-SMA是間充質細胞的標志物，會隨著腎臟成纖維細胞的激活而增多。趙宇等［16］研究發現高鹽能通過增加TGF-β1、α-SMA的表達誘導EMT的發生，從而促進大鼠腎臟纖維化。韋建輝等［17］發現高糖通過下調E-cadherin的表達，上調α-SMA的表達，成功誘導HK-2細胞發生EMT。白雪峰等［18］發現低氧誘導因子-1α通過上調TGF-β1、α-SMA的表達，降低E-cadherin的表達，促進牦牛腎小管EMT的發生。本研究中Vehicle組大鼠TGF-β1、α-SMA的表達升高，E-cadherin的表達降低，且大鼠腎臟組織出現部分藍染的膠原纖維；經過Vit D干預后，TGF-β1、α-SMA的表達水平明顯降低，E-cadherin的表達明顯增加，且呈現散在藍染的膠原纖維，說明Vit D能夠降低DKD大鼠EMT發生，從而抑制RIF。

TRAF6是一種銜接蛋白，在胞外信號刺激下TRAF6被激活，進而使下游TAK1發生磷酸化，將胞外信號傳至胞內誘導炎癥反應。研究發現，小鼠體內過表達TRAF6基因，會增加TAK1磷酸化水平，進而激活NF-κB信號通路，誘導細胞氧化損傷、炎癥反應及細胞凋亡的發生［19］。沈先敏等［20］發現槲皮素通過抑制TRAF6/TAK1信號通路的活化，抑制TNF-α、IL-1β和IL-6炎癥因子的表達，從而改善脂多糖誘導的BV-2細胞炎癥損傷。李霖等［21］發現蘿卜硫素通過抑制Traf6/TAK1通路，抑制脂多糖誘導的HK-2細胞炎癥因子的產生，以及抑制腎小管EMT。本研究中Vehicle組較Control組TRAF6、TAK1的表達增加，Vit D干預后，TRAF6、TAK1的表達較Vehicle組降低，推斷Vit D對DKD的保護作用可能是通過抑制TRAF6/TAK1信號通路實現的。

綜上所述，Vit D能夠有效改善DKD損傷，抑制機體炎癥反應及腎小管EMT的發生，從而抑制RIF，可能通過抑制TRAF6/TAK1信號通路發揮對DKD大鼠的保護作用。