桑色素對ALI大鼠免疫功能、肺組織病理及IKKα蛋白水平的影響

徐雙麗 孫 偉 韓文杰 史有奎 殷 亮 （山東省濰坊市濰坊醫學院附屬醫院，濰坊 261000）

急性肺損傷（acute lung injury，ALI）是一種急性、彌漫性肺損傷危重疾病，嚴重威脅人類生命健康，其主要由內、外致病因素所致，臨床上病死率超過40%［1］。ALI的主要臨床特點為呼吸窘迫、非心源性肺水腫及難治性低氧血癥［2］。ALI的發病機制較為復雜，目前尚無明確的臨床研究報道。即便近年關于ALI的治療研究較多（一般在糖皮質激素、氧自由基清除劑和肺泡表明活性等方面），但其病死率并未得到顯著改善［3］。有研究發現，炎癥反應失控是ALI發生發展的主要原因［4］。核轉錄因子-κB（nuclear factor kappa B，NF-κB）可調節肺損傷時肺組織內的細胞核轉錄因子等炎癥因子［5］。IKKα是IKK復合體的一個催化亞基，IKK復合體又是NF-κB信號上游的主要成分［6］。外界信號經復雜的信號轉導刺激下，會激活IKK復合體，活化NF-κB，活化的NF-κB進入細胞核內，進而調節各種基因表達，介導炎癥反應、免疫反應、細胞活性等生物過程［7］。桑色素是一種天然的生物活性物質，其化學名稱為（3，5，7，2′，4′-五羥黃酮），屬黃體酮類化合物，其結構特點是含氧的雜環連接兩個芳香環［8］。桑色素的主要化學成分黃體酮類化合物可抑制酶活性，具有抗癌、抗菌、抗炎、降低血糖和抗氧化應激等作用，但桑色素對ALI的作用及機制尚不明確，因此本文建立ALI大鼠模型，探究桑色素對ALI大鼠免疫功能、肺組織病理及IKKα蛋白水平的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 8周齡清潔級SD雄性大鼠30只，體質量180～200 g，購自河南省實驗動物中心［SCXK（豫）2005-0001］。適應性喂養大鼠1周，飼養期間使飼養環境保持在25 ℃、12 h光暗交替循環。30只大鼠均為普通飼料喂養，自由進食攝水。

1.1.2 主要試劑與儀器 桑色素藥物溶液（美國Sigma公司）；NF-κB抗體、IKKα抗體（美國Santa Cruz公司）；DG Spin離心機（美國Thermo公司）；FYL-YS-150烤箱（中國宏展儀器工業股份有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 動物分組及ALI模型制備 30只大鼠分為正常組（NC組）、ALI大鼠模型組（ALI組）、ALI大鼠模型給予桑色素干預組（Morin組），每組10只。采用脂多糖氣管滴注法將ALI組和Morin組大鼠制備成ALI大鼠模型。脂多糖以生理鹽水配制成1 mg/ml的溶液，腹腔注射戊巴比妥鈉麻醉兩組大鼠，沿大鼠頸部中線將頸部切開一小口，使氣管充分暴露在外，將1 ml注射器緩慢插入氣管，緩慢滴入脂多糖溶液，以每千克大鼠5 ml計量，NC組大鼠緩慢滴入等量生理鹽水。馬上將3組大鼠垂直并輕輕旋轉1 min，使脂多糖在大鼠體內均勻分散。

1.2.2 藥物干預 造模后30 min，Morin組大鼠經腹腔注射桑色素干預治療，每千克大鼠給予40 mg桑色素；NC組和ALI組大鼠均腹腔注射等量生理鹽水干預治療，三組大鼠各干預7 d，然后處死大鼠，收集相關標本。

1.2.3 肺組織濕/干重比（W/D）和含水量測定 處死三組大鼠，分別分離三組大鼠肺組織，取出左肺，用干凈濾紙將表面水分吸干，稱取左肺濕重；用錫紙包裹左肺，60 ℃恒溫箱烘烤48 h，至質量不再減少時，再次稱量干重，計算W/D和肺含水量。

1.2.4 抗氧化指標檢測 分別取三組大鼠動脈血，以3 000 r/min離心10 min。取上層血清，測定血清中氧化應激指標丙二醛（malondialdehyde，MDA）含量及超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）活性。

1.2.5 血清中IL-1β和IL-18測定 麻醉各組大鼠后，取大鼠動脈血，在25 ℃環境中將血清靜置2 h。以3 000 r/min離心30 min。取上層血清，ELISA法測定血清中炎癥因子IL-1β和IL-18水平。

1.2.6 動脈血T淋巴細胞亞群CD4+、CD8+、CD4+/CD8+的檢測 麻醉大鼠后，分別取三組大鼠腹主動脈血2 ml，將血液用EDTA抗凝后，各組取出60 μl血液至流式細胞儀，檢測血液中T細胞亞群中的免疫因子 CD4+、CD8+細胞百分比和 CD4+/CD8+。

1.2.7 肺組織形態學變化 分別麻醉并處死三組大鼠，取各組大鼠肺組織，再將左肺上葉組織取出一小塊置于甲醛中固定，48 h后取出組織，石蠟包埋，用切片機將石蠟組織切成5 μm薄片，每組任選3張薄片進行HE染色，最后用顯微鏡觀察組織形態學改變。

對三組大鼠肺組織損傷情況進行評分，0分為肺組織未發生病變；1分為肺組織發生輕微病變；2分為中度病變；3分為重度病變；4分為極重度病變。

1.2.8 Westren blot檢測肺組織中IKKα和NF-κB p65蛋白表達 分別取三組大鼠肺組織50 μg，提取肺組織中的總蛋白，蛋白濃度以BCA法檢測。各組取等量蛋白進行電泳。將電泳后的蛋白轉移至PVDF膜，以脫脂奶粉封閉1 h后加入IKKα和NF-κB一抗，將組織在4 ℃環境中孵育過夜；加入二抗后繼續孵育1 h后ECL顯色。

1.3 統計學方法 采用SPSS15.0軟件分析統計數據，以±s比較三組間數據；三組間比較選用三因素方差進行分析；兩組間比較選用t檢驗；以P＜0.05表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組大鼠肺組織W/D和含水量比較 與NC組大鼠相比，ALI組大鼠肺組織W/D及含水量均顯著升高（P＜0.05）；干預后的Morin組較ALI組肺組織W/D和肺含水量明顯降低（P＜0.05，表1、圖1）。

圖1 各組大鼠W/D和含水量比較Fig.1 Comparison of W/D and water content of rats in each group

表1 各組大鼠W/D和含水量比較（±s）Tab.1 Comparison of W/D and water content of rats in each group （±s）

表1 各組大鼠W/D和含水量比較（±s）Tab.1 Comparison of W/D and water content of rats in each group （±s）

Note：Compared with NC group， 1）P＜0.05； compared with ALI group，2）P＜0.05.

Groups NC ALI Morin F P n 10 10 10 W/D 1.97±0.72 5.51±1.081）3.12±0.821）2）41.5＜0.001 Lung water content（%）68.8±10.5 85.6±12.41）73.1±13.21）2）5.214 0.012

2.2 各組大鼠SOD活性和MDA含量比較 ALI組SOD活性較NC組明顯降低，MDA含量較NC組明顯升高（P＜0.05）；干預后Morin組大鼠氧化指標明顯改善，SOD活性升高，MDA含量降低（P＜0.05），見表2、圖2。

圖2 各組大鼠血清中SOD活性和MDA含量比較Fig.2 Comparison of SOD activity and MDA content in serum of rats in each group

表2 各組大鼠血清中SOD活性和MDA含量比較（±s）Tab.2 Comparison of SOD activity and MDA content in serum of rats in each group （±s）

表2 各組大鼠血清中SOD活性和MDA含量比較（±s）Tab.2 Comparison of SOD activity and MDA content in serum of rats in each group （±s）

Note：Compared with NC group，1）P＜0.05； compared with ALI group，2）P＜0.05.

Groups NC ALI Morin F P n 10 10 10 SOD/（U·mg-1）198.13±40.11 74.52±24.411）175.76±38.181）2）35.54＜0.000 1 MDA/（nmol·mg-1）4.25±1.65 11.28±2.141）5.70±1.111）2）48.55＜0.000 1

2.3 各組大鼠血清中IL-1β和IL-18水平比較 與NC組相比，ALI組血清中炎癥因子IL-1β和IL-18水平均顯著升高（P＜0.05）；干預后的Morin組大鼠較ALI組大鼠血清中IL-1β和IL-18水平明顯降低，見表3、圖3。

圖3 各組大鼠血清中IL-1β和IL-18水平比較Fig.3 Comparison of IL-1β and IL-18 levels in serum of rats in each group

表3 各組大鼠血清中IL-1β和IL-18水平比較（±s，pg/ml）Tab.3 Comparison of IL-1β and IL-18 levels in serum of rats in each group （±s，pg/ml）

表3 各組大鼠血清中IL-1β和IL-18水平比較（±s，pg/ml）Tab.3 Comparison of IL-1β and IL-18 levels in serum of rats in each group （±s，pg/ml）

Note：Compared with NC group， 1）P＜0.05； compared with ALI group，2）P＜0.05.

Groups NC ALI Morin F P n 10 10 10 IL-1β 22.41±6.56 42.88±9.641）31.36±9.031）2）14.76＜0.000 1 IL-18 137.50±59.71 436.25±136.171）250.12±73.481）2）24.83＜0.000 1

2.4 動脈血T淋巴細胞亞群CD4+、CD8+、CD4+/CD8+比較 與NC組相比，ALI組CD4+、CD4+/CD8+明顯降低，CD8+明顯升高（P＜0.05）；和ALI組相比，Morin組CD4+、CD4+/CD8+明顯升高，CD8+明顯降低（P＜0.05），見表4、圖4。

圖4 各組大鼠動脈血T淋巴細胞亞群CD4+、CD8+、CD4+/CD8+比較Fig.4 Comparison of CD4+， CD8+， CD4+/CD8+T lymphocyte subsets in arterial blood of rats in each group

表4 各組大鼠動脈血T淋巴細胞亞群CD4+、CD8+、CD4+/CD8+比較（±s）Tab.4 Comparison of CD4+， CD8+， CD4+/CD8+T lymphocyte subsets in arterial blood of rats in each group（±s）

表4 各組大鼠動脈血T淋巴細胞亞群CD4+、CD8+、CD4+/CD8+比較（±s）Tab.4 Comparison of CD4+， CD8+， CD4+/CD8+T lymphocyte subsets in arterial blood of rats in each group（±s）

Note：Compared with NC group， 1）P＜0.05； compared with ALI group，2）P＜0.05.

Groups NC ALI Morin F P n 10 10 10 CD4+（%）52.01±2.73 34.22±3.19 49.37±1.84 131.6＜0.000 1 CD8+（%）22.23±0.83 27.81±0.841）22.75±1.041）2）115.1＜0.000 1 CD4+/CD8+2.34±0.15 1.23±0.161）2.18±0.151）2）153.0＜0.000 1

2.5 各組大鼠肺組織形態學變化 NC組肺泡組織完整，肺損傷評分為0分；與NC組相比，ALI組大鼠肺組織結構紊亂且被破壞，肺泡腔被壓縮、變窄，大量肺泡萎陷，泡壁增厚、斷裂，有大量炎癥細胞、液體的滲出及紅細胞漏出，間質可見出血、水腫，肺損傷評分為10.38±1.31，較NC組明顯升高；與ALI組相比，Morin組肺組織得到明顯改善，其肺損傷評分（3.75±0.71）也明顯降低，見圖5。

圖5 各組大鼠肺組織形態學變化（HE染色，×200）Fig.5 Morphological changes of lung tissue in rats of each group （HE staining， ×200）

2.6 各組大鼠肺組織中IKKα和NF-κB p65蛋白表達比較 與NC組相比，ALI組IKKα和NF-κB p65蛋白表達均顯著升高（P＜0.05）；與 ALI組相比，Morin組大鼠肺組織中IKKα和NF-κB p65蛋白明顯降低（P＜0.05），見表5、圖6。

表5 各組大鼠肺組織中IKKα和NF-κB p65蛋白表達比較（±s）Tab.5 Comparison of IKKα and NF-κB p65 protein expressions in lung tissue of rats in each group （±s）

表5 各組大鼠肺組織中IKKα和NF-κB p65蛋白表達比較（±s）Tab.5 Comparison of IKKα and NF-κB p65 protein expressions in lung tissue of rats in each group （±s）

Note：Compared with NC group， 1）P＜0.05； compared with ALI group，2）P＜0.05.

Groups NC ALI Morin F P n 10 10 10 NF-κB p65 0.61±0.11 1.02±0.141）0.64±0.081）2）41.13＜0.0001 IKKα 0.41±0.09 0.69±0.111）0.49±0.081）2）23.46＜0.0001

圖6 各組大鼠肺組織中IKKα和NF-κB p65蛋白表達Fig.6 IKKα and NF-κB p65 protein expressions in lung tissue of rats in each group

3 討論

ALI是以肺內大量炎癥細胞浸潤和滲出、肺泡毛細血管通透性增加為主要特征的肺部炎癥綜合反應，嚴重的ALI可導致進行性缺氧性呼吸衰竭，病死率逐年增加［9］。雖然目前臨床上針對ALI治療的研究很多，但能有效治療肺損傷的藥物仍然較少。桑色素是一種天然化合物，普遍存在于中草藥和膳食中，如桑椹、綠茶、橙子和菠蘿蜜等均可食用。LEE等［10］研究表明，桑色素可減弱IL-1β表達，抑制炎癥介質和促炎細胞因子釋放。NIE等［11］研究表明，桑色素可通過抑制miR-188-5p表達抑制cml細胞增殖，同時促進cml細胞凋亡。目前，桑色素對ALI大鼠的作用鮮有報道。

脂多糖是革蘭氏陰性菌細胞壁最重要的成分之一，當大鼠肺內滴入脂多糖時，大鼠炎癥增多，肺組織通透性隨之改變，通常采用脂多糖制備ALI大鼠動物模型［12］。肺毛細血管的通透性會隨肺損傷的發生而增加，同時使炎癥遞質和炎癥蛋白均進入肺泡和肺間質；肺泡上皮細胞會被炎癥因子損傷，進而減少肺泡表面的活性物質，增加其表面張力，使肺泡毛細血管中的液體向肺泡內濾出，進而加重肺水腫［13］。本研究顯示，ALI組大鼠肺泡腔內有大量炎癥細胞浸潤，滲出大量紅細胞，肺泡間質增生嚴重，肺損傷較NC組明顯加重，提示ALI大鼠模型制備成功。實驗結果顯示，ALI組大鼠肺組織W/D和肺含水量較NC組顯著增加；經桑色素干預后的Morin組大鼠肺組織W/D和肺含水量明顯降低，提示桑色素對肺水腫具有明顯的治療效果。WANG等［14］通過脂多糖誘導小鼠肺損傷的研究發現，燈盞花素可有效改善肺損傷，其可能通過抑制小鼠體內COX-2/NLRP3/NF-κB信號通路實現。

本研究發現給予桑色素干預后Morin組大鼠氧化指標明顯改善，SOD活性升高，MDA含量降低。表明桑色素具有抗氧化能力，可降低氧化應激造成的損傷［15］。SOD活性和MDA含量可間接反應機體氧化應激損傷程度，肺損傷后機體活性氧表達上調，加快MDA表達，SOD活性降低，打破氧化抗氧平衡。肺臟本身有抗氧化系統，SOD具有抗氧化能力，當肺部受到損傷后，SOD表達下調，MDA表達上調，細胞毒性增加，肺部生物膜及肺功能損傷加重。楊玲等［16］研究表明，桑色素可提高斑馬魚胚SOD活性，降低自由基表達，從而對受損的斑馬魚胚胎發揮保護作用，提示桑色素具有較強的抗氧化能力。

T淋巴細胞在機體內的分布情況可反映機體細胞的免疫功能，T淋巴細胞表面的共同標志物為CD3+，CD3+代表T淋巴細胞的總數；CD4+可將T細胞誘導為效應細胞，其是Ti/Th表面的標志物；抑制性T細胞通常以CD8+表示，可溶解病原體感染的自身細胞［17］。機體內的免疫功能是否穩定可用CD4+/CD8+反映，CD4+/CD8+在正常哺乳動物中為2，當比值＜2時說明免疫功能被破壞。本研究結果顯示，ALI組大鼠免疫指標較NC組明顯降低；干預后的Morin 組和 ALI組相比，CD4+、CD4+/CD8+明顯升高，CD8+明顯降低，提示使用桑色素治療后能進一步加強機體細胞的免疫功能。鄭紅麗等［18］研究發現，ALI患者治療后血清中T細胞分化亞群指標明顯優于治療前，可見治療后患者體內免疫功能得到改善，進而減輕了炎癥所致的臟器損傷。桑色素中的生物類黃酮抗炎機制在于其抑制了前列腺素生物合成過程中的脂氧化酶、蛋白激酶C等，進而調節炎癥反應過程中內皮細胞和炎癥細胞活性，其可通過影響細胞的分泌過程、有絲分裂及細胞間的相互作用發揮抗炎作用，抑制大鼠肥大細胞和嗜堿性細胞對多種刺激引起的組胺及慢反應物質的釋放，抑制PGE2、白三烯的合成和釋放及透明質酸酶活性，降低大鼠中性粒細胞溶酶體酶的釋放及脫顆粒。有文獻提出，桑色素可介導機體中Th17/Treg平衡，對固有免疫有一定的調節作用［19］。

ALI的病理特征為進行性炎癥失控，可導致肺巨噬細胞焦亡，進而釋放促炎因子IL-1β和IL-18，在ALI中，炎癥的過度反應占據主導作用［20］。本研究結果顯示，ALI組血清中炎癥因子水平均高于NC組；桑色素干預后的Morin組炎癥因子水平受到明顯抑制。眾多炎癥遞質通過不同信號通路作用于巨噬細胞等不同的效應細胞，嚴重影響ALI的炎癥反應，如NF-κB/IKKα表達等。目前研究發現，NF-κB信號通路主要由轉錄因子、7個抑制蛋白和IκB激酶復合物組成，其中轉錄因子包括p50、p56等，IκB激酶復合物包括IKKα、IKKβ等［21］。細胞在經典通路中受到刺激后，會激活NF-κB誘導性激酶，活化IKK復合體，激活IKKα、IKKβ組成的信號小體，導致p65蛋白磷酸化，胞漿內的NF-κB游離后進入細胞核，啟動下游炎癥因子等基因的轉錄翻譯，而這些炎癥因子又成為促進NF-κB重新激活的刺激因素，從而導致級聯性彌漫性炎癥反應［22］。本研究結果顯示，ALI組大鼠肺組織中IKKα和NF-κB p65蛋白表達較NC組明顯增多，Morin組肺組織中蛋白表達明顯受到抑制，提示NF-κB轉錄因子的活化可通過桑色素抑制，同時機體免疫反應的放大程度降低，在一定程度減輕了肺損傷的發生。趙瑜等［23］通過建立幼兒ALI大鼠模型研究發現，miR-24低表達可通過抑制肺組織中p-IKK、NF-κB p65表達減輕ALI幼齡大鼠的炎癥反應。

綜上所述，桑色素可改善ALI大鼠的免疫功能和肺組織病理改變，同時抑制IKKα蛋白表達，進而抑制肺組織中的炎癥反應，減輕肺損傷。