LINC00617靶向miR-218對肺癌吉西他濱耐藥性的影響

張敬毅 蒲 兵 劉秀平 周肖龍 （淄博市第一醫院，淄博 255200）

越來越多的研究表明，長鏈非編碼RNA（lnc-RNA）可以競爭性地抑制miRNAs的表達水平，并且lncRNA/miRNAs軸可以通過各種經典的信號通路或相關蛋白促進肺癌的腫瘤發生、轉移和多藥耐藥性［1］。lncRNAs在肺癌、乳腺癌、胃癌等腫瘤中對多靶點和多途徑的調節失調導致化療耐藥的發生［2］。LINC00617在乳腺癌樣本中表達上調，其通過激活Sox2的轉錄來促進乳腺癌的進展和轉移，敲低LINC00617可抑制癌細胞的肺轉移［3］。本研究通過Targetscan預測發現，miR-218與LINC00617存在結合位點。miR-218被報道在肺癌組織中低表達，miR-218過表達減弱了肺癌細胞的體外增殖、侵襲、集落形成和腫瘤球體形成，并抑制了體內腫瘤生長［4］。但 LINC00617 在肺癌中表達、作用及其與miR-218在肺癌吉西他濱耐藥細胞中的關系目前還尚未可知。主要研究LINC00617和miR-218對肺癌耐藥細胞A549-Gem增殖、凋亡和吉西他濱耐藥性的影響，以期為肺癌的吉西他濱耐藥性研究提供新的方向。

1 材料與方法

1.1 材料 人肺癌細胞株A549購自ATCC；引物、si-LINC00617和陰性對照 si-NC、miR-NC、miR-218 mimics（miR-218）均購自上海吉瑪制藥有限公司；鹽酸吉西他濱、胰蛋白酶、RNA提取試劑Trizol購自美國Sigma-Aldrich公司；Real-time PCR試劑盒、反轉錄試劑盒（RT-PCR）購自寶生物工程（大連）有限公司；Ki67、Caspase3和GAPDH抗體購自美國Santa cruz公司。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養和A549-Gem耐藥細胞系的建立將A549細胞培養于37 ℃下含10%胎牛血清、100 U/ml青霉素、100 μg/ml鏈霉素的RPMI1640培養基，5%CO2培養箱中孵育。根據文獻［5］采用逐步增加培養基中吉西他濱濃度，間歇誘導的方式使A549細胞產生耐藥性。首先，將A549細胞培養在含10 nmol//L 吉西他濱的RPMI1640培養基中，24 h后換脫藥的新鮮培養液培養2周，待細胞恢復對數生長期時再用較高濃度吉西他濱培養液篩選誘導，重復上述過程，連續培養40周，直至A549細胞可穩定生長于含終濃度1 μmol/L吉西他濱的培養液中，獲得肺癌吉西他濱耐藥A549-Gem細胞。

1.2.2 CCK8實驗檢測細胞存活率 將吉西他濱處理或/和轉染后的A549、A549-Gem細胞以1×104個/孔接種于96孔板中，每孔150 μl細胞，過夜培養后在培養液中加入終濃度為2、4、6、8 μmol/L的吉西他濱（約50 μl），以不加藥物只加培養液作為對照，培養72 h，每孔加入 20 μl CCK8溶液，培養2 h，酶標儀測定吸光度（A）值，波長為450 nm。存活率（%）=實驗組A值/對照組A值×100%。并根據存活率計算半數抑制濃度（IC50）。

1.2.3 RT-PCR檢測LINC00617和miR-218的表達 用Trizol試劑提取A549和A549-Gem細胞總RNA，反轉錄PCR試劑盒用于制備cDNA，取cDNA和RT-PCR試劑盒檢測LINC00617和miR-218的含量。引物如下：miR-218正向引物：5'-TAATGGTCGAACGCCTAACGTC-3'，反向引物：5'-CGAGTGCATTTGTGCTTGATCTA-3'；LINC00617正向引物：5'-ATTGGGAGGGGACTTAATGG-3'，反向引物：5'-GTGTTACGGAGCCAGGAGC-3'；U6正向引物：5'-CTCGCTTCGGCAGCACA-3'，反向引物5'-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3'；GAPDH正向引物5'-GTCAACGGATTTGGTCTGTATT-3'，反向引物 5'-AGTCTTCTGGGTGGCAGTGAT-3'。運用 2-ΔΔCt法進行數據分析。

1.2.4 細胞轉染 將對數生長期A549-Gem細胞以2×105個/孔接種于6孔板中，細胞融合一層時進行轉染。根據Lipofectamine2000轉染試劑盒說明書將si-NC、si-LINC00617、miR-NC、miR-218、si-LINC00617+miR-NC、si-LINC00617+miR-218等各組載體或片段轉染至A549細胞，分別記為si-NC組、si-LINC00617組、miR-NC組、miR-218組、si-LINC00617+miR-NC組、si-LINC00617+miR-218組。轉染48 h，收集細胞，采用1.2.3方法驗證轉染效果。

1.2.5 克隆形成實驗檢測細胞增殖能力 將轉染48 h后的各組A549-Gem細胞培養至對數生長期，收集細胞，洗滌并稀釋，以1×103個/孔接種入6孔板，加入6 μmol/L吉西他濱及10%FBS的RPMI1640培養基，培養14 d，棄培養液洗滌細胞3次，固定細胞并進行結晶紫染色，拍照并計數克隆形成數。

1.2.6 流式細胞術檢測細胞凋亡率 將轉染后的各組A549-Gem細胞，用含6 μmol/L吉西他濱無血清RPMI1640培養基，培養72 h，收集細胞，洗滌并稀釋為1×106個/ml，根據凋亡試劑盒說明書進行操作，用流式細胞儀分析細胞凋亡率。

1.2.7 Western blot實驗 提取轉染后的各組A549-Gem細胞蛋白，進行SDS-PAGE電泳、轉膜、封閉，加入一抗（Ki67 1∶1 000、Caspase3抗體 1∶1 000和 GAPDH 抗體 1∶4 000），置于 4 ℃過夜孵育。PBST緩沖液洗膜3次，然后加入稀釋的二抗，室溫孵育1 h，顯影，拍照。以GAPDH為內參，分析蛋白水平。

1.2.8 雙熒光素酶報告系統實驗 根據1.2.4方法，在A549-Gem細胞中，將miR-218或miR-NC分別與構建的LINC00617野生型（WT）和突變型（MUT）報告載體共轉染，收集轉染48 h后的細胞，在Promega雙熒光素酶報告系統中檢測上清中熒光素酶活性。以海腎熒光素酶活性為內參，計算相對螢火蟲熒光素酶活性。

1.3 統計學處理 數據以±s表示，在SPSS19.0統計軟件中進行整理分析，數據中兩組間比較采用獨立樣本t檢驗，多組間比較采用單因素方差進行分析，組間多重比較采用SNK-q法。以P＜0.05為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 肺癌A549細胞和吉西他濱耐藥細胞A549-Gem對吉西他濱耐藥性的檢測 采用2、4、6、8 μmol/L的吉西他濱分別處理肺癌細胞A549和肺癌吉西他濱耐藥細胞A549-Gem，結果發現，隨著吉西他濱濃度的增加，A549細胞存活率逐漸降低，但A549-Gem的存活率無顯著改變，最高濃度8 μmol/L吉西他濱時 A549-Gem的存活率（97.01±7.26）%顯著高于A549（43.21±5.35）%，見圖1。說明A549-Gem細胞對吉西他濱具有顯著的耐藥性。后續實驗選擇對A549作用明顯，對A549-Gem生存無影響且作用效果較為明顯的濃度6 μmol/L。

圖1 A549和A549-Gem細胞對吉西他濱耐藥性檢測Fig.1 Drug resistance of A549 and A549-Gem cells to gemcitabine

2.2 LINC00617在A549和A549-Gem細胞中的表達 qRT-PCR檢測A549和A549-Gem細胞，結果發現，LINC00617 在A549-Gem中含量（3.19±0.14）顯著高于A549細胞（1.00±0.08）（P＜0.05），見圖2。

圖2 LINC00617在肺癌A549和吉西他濱耐藥細胞A549-Gem中的表達Fig.2 Expression of LINC00617 in lung cancer A549 and gemcitabine resistant A549-Gem cells

2.3 抑制LINC00617對A549-Gem細胞增殖、凋亡的影響 與si-NC組相比，si-LINC00617組A549-Gem細胞中LINC00617含量降低，細胞存活率和克隆形成數均降低，凋亡率升高，增殖蛋白Ki67含量降低，凋亡蛋白Caspase3含量升高，差異均具有統計學意義（P＜0.05），見圖3。說明抑制LINC00617聯合6 μmol/L吉西他濱處理可抑制A549-Gem細胞增殖，促進細胞凋亡，增強吉西他濱對細胞的抑制。

圖3 抑制LINC00617對A549-Gem細胞增殖、凋亡的影響Fig.3 Effects of inhibition of LINC00617 on proliferation and apoptosis of A549-Gem cells

2.4 LINC00617 靶 向 miR-218 TargetScan 對LINC00617靶向miR-218的預測結果見圖4。miR-218組共轉染WT-LINC00617的螢火蟲熒光素酶相對活性（0.20±0.02）是miR-NC組螢火蟲熒光素酶相對活性（0.99±0.08）的0.20倍（P＜0.05），而miR-218組突變型MUT-LINC00617的熒光素酶相對活性（0.95±0.08）與miR-NC組（0.97±0.08）相比差異無統計學意義；抑制LINC00617可上調miR-218含量（P＜0.05），見圖4。

圖4 LINC00617的序列中含有與miR-218互補的核苷酸序列和雙熒光素酶報告實驗Fig.4 Sequence of LINC00617 contains nucleotide sequences complementary to miR-218 and dual-luciferase reporter assay system

2.5 miR-218對A549-Gem增殖、凋亡的影響 結果表明，與miR-NC組相比，miR-218組A549-Gem細胞中miR-218含量升高，A549-Gem細胞存活率和克隆形成數均降低，凋亡率升高，增殖蛋白Ki67含量降低，凋亡蛋白Caspase3含量升高，差異均具有統計學意義（P＜0.05），見圖5。說明過表達miR-218聯合6 μmol/L吉西他濱可抑制A549-Gem細胞增殖，促進細胞凋亡，增強吉西他濱對細胞的抑制。

圖5 miR-218對A549-Gem增殖、凋亡的影響Fig.5 Effect of miR-218 on proliferation and apoptosis of A549-Gem

2.6 miR-218可以增強抑制LINC00617對A549-Gem細胞增殖、凋亡的影響 與si-LINC00617+miRNC組相比，si-LINC00617+miR-218組A549-Gem細胞中miR-218含量增高，細胞存活率和克隆形成數均降低，細胞凋亡率升高，Ki67含量降低，凋亡蛋白Caspase3含量升高，差異均具有統計學意義（P＜0.05），見圖6。說明過表達miR-218增強了抑制LINC00617對A549-Gem細胞增殖、凋亡和吉西他濱耐藥性的作用。

圖6 miR-218可以增強抑制LINC00617對A549-Gem增殖、凋亡的影響Fig.6 miR-218 can enhanced and effect of LINC00617 inhibition on proliferation and apoptosis of A549-Gem

3 討論

肺癌確診時多為晚期，后期的臨床耐藥性是晚期肺癌患者治療的最大障礙，因此，提高肺癌細胞的化療敏感性具有重要意義［6］。lncRNA在耐藥和藥物敏感的肺癌細胞中出現差異表達，可能因為調控失調導致耐藥的發生［7］。

最近研究報道，LINC00617可能參與調節癌癥干細胞（cancer stem cell，CSC）的不對稱分裂，并促進自我更新、耐藥性和EMT，從而影響不同癌癥的轉移和復發［8］。LINC00617在乳腺癌樣本中表達上調，其可促進乳腺癌細胞的運動和侵襲，誘導EMT并伴隨著干細胞特性的產生［3］。LINC00617在治療性神經內分泌前列腺癌（therapeutic neuroendocrine prostate cancer，tNEPC）中表達上調，與NEPC的發展有關，可能是NEPC的臨床生物標志物和治療靶點［9］。但其在肺癌中的表達情況和作用尚不清楚。本研究通過建立肺癌吉西他濱耐藥細胞系A549-Gem，檢測不同濃度（2、4、6、8 μmol/L）的吉西他濱下肺癌A549和A549-Gem細胞的存活率，結果發現，吉西他濱對A549-Gem的抑制率顯著低于A549細胞，且LINC00617在A549-Gem細胞中表達顯著上調，與上述結論類似，在A549-Gem細胞中轉染si-LINC00617聯合6 μmol/L吉西他濱處理可降低A549-Gem細胞的存活率和克隆形成數，促進細胞凋亡，上調Caspase3含量，下調增殖蛋白Ki67含量，說明抑制LINC00617可降低A549-Gem細胞對吉西他濱的耐藥性，其可能是肺癌潛在的化療增敏靶點［3，9］。

本研究通過TargetScan預測發現，miR-218與LINC00617存在結合位點。miR-218在多種癌癥中發揮腫瘤抑制因子的作用，在宮頸癌、胃癌、肝細胞癌和骨肉瘤中表達下調，上調其表達可靶向不同的基因抑制癌細胞的遷移、侵襲、凋亡和 EMT［10-13］。miR-218多態性可作為轉移性結直腸癌伊立替康化療反應的標志物［14］。miR-218在肺癌組織中表達水平較癌旁組織明顯下調，其表達水平與組織學分級和淋巴結轉移密切相關，miR-218過表達可抑制細胞遷移、侵襲及EMT過程［15］。miR-218在肺癌細胞中的表達與卡鉑的耐藥及Mcl-1、Survivin對細胞凋亡的調控有關［16］。上述研究均表明miR-218與腫瘤進展及耐藥性有關。本研究通過雙熒光素酶報告和qRT-PCR實驗證實，LINC00617靶向負調控miR-218的表達；過表達miR-218聯合吉西他濱可抑制A549-Gem細胞增殖并促進細胞凋亡，進一步實驗還發現，過表達miR-218可增強抑制LINC00617對A549-Gem細胞增殖、凋亡和吉西他濱耐藥性的作用，間接驗證了在肺癌中兩者之間存在靶向調控關系。

本研究闡述了與肺癌A549細胞相比，在肺癌DTX耐藥細胞A549-Gem中，LINC00617表達上調，LINC00617靶向miR-218調控A549-Gem細胞增殖、凋亡和吉西他濱耐藥性。LINC00617可能是肺癌吉西他濱化療增敏靶點。