橡膠樹KT/HAK/KUP基因家族成員的鑒定與表達分析

肖小虎 林顯祖 龍翔宇 秦云霞 陽江華 方永軍

摘 ?要：為研究巴西橡膠樹鉀轉蛋白（KT/HAK/KUP）基因家族在生長發育和逆境脅迫方面的生物學功能，從橡膠樹基因組中鑒定得到31個KT/HAK/KUP基因家族成員，并從基因結構、染色體定位、系統進化和表達分析等方面進行全面系統的分析。研究結果發現，KT/HAK/KUP基因家族31個成員分布在3個Contig和15個染色體上，8號染色體上數目較多為8個成員，其中5個為串聯重復;各成員編碼的氨基酸殘基數目在288～881個不等，蛋白分子量分布在31.82～98.96 kDa，其蛋白產物均定位于細胞質膜上;內含子數目為5～11個，進化上分為4個明顯分支。在表達方面，部分成員呈現明顯的組織特異性，在葉片發育過程中成員HbKUP5、HbKUP6、HbKUP9和HbKUP14表達發生明顯變化，乙烯利刺激后HbKUP30和HbKUP31在膠乳中的表達明顯上調，在抗寒品種‘93～114’中，HbKUP5和HbKUP9在低溫處理后明顯下調表達。本研究結果為深入解析KT/HAK/KUP基因家族的功能和培育高鉀抗逆的橡膠樹品種提供了理論基礎。

關鍵詞：巴西橡膠樹;KT/HAK/KUP;基因家族;逆境脅迫;表達分析

中圖分類號：S794.1 ? ? ?文獻標識碼：A

Identifcation and Expression of KT/HAK/KUP Genes in Hevea brasliensis

XIAO Xiaohu1， LIN Xianzu1，2， LONG Xiangyu1， QIN Yunxia1， YANG Jianghua1， FANG Yongjun1*

1. Key Laboratory of Biology and Genetic Resources of Rubber Tree， Ministry of Agriculture and Rural Affairs / Rubber Research Institute， Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences， Haikou， Hainan 571101， China; 2. College of Tropical Crops， Hainan University， Haikou， Hainan 570228， China

Abstract： In order to study the biological functions of KT/HAK/KUP gene family in the growth and development and stress of Hevea brasiliensis， 31 KT/HAK/KUP genes were identified， and the gene structure， chromosomal location， evolution and expression were analyzed. 31 members of KT/HAK/KUP gene family were distributed on 3 contig and 15 chromosomes. There were 8 members on chromosome 8， and 5 of which were tandem repeats. The number of amino acid residues ranged from 288 to 881， and the molecular weight of the proteins ranged from 31.82 to 98.96 kDa， the proteins were located on the cytoplasmic membrane， with 5 to 11 introns. All the mumbers could be divided into four distinct branches in evolution. The expression of HbKUP5， HbKUP6， HbKUP9 and HbKUP14 were significantly changed during leaf development. And the expression of HbKUP30 and HbKUP31 in latex were significantly up-regul?ated under ethephon stimulation. In cold resistant cultivar ‘93-114’， the expression of HbKUP5 and HbKUP9 was significantly down-regulated under low temperature treatment. The results of this study would provide theoretical guidance for further study the functions of KT/HAK/KUP gene family and high potassium stress resistant rubber tree varieties breeding.

Keywords： Hevea brasiliensis; KT/HAK/KUP; gene family; stress; expression analysis

DOI： 10.3969/j.issn.1000-2561.2022.01.001

在植物生長發育的過程中，鉀（K+）離子作為第二信使扮演著至關重要的角色。植物主要通過鉀轉運蛋白來實現對K+的吸收轉運，KT/ HAK/KUP（K+ uptake permease/high-affinity K+/K+ transporter）是植物體內最大的K+轉運蛋白基因家族，在植物養分代謝、生長調控和抵御脅迫等過程中發揮著重要的作用[1]。目前已經從水稻[2]、玉米[3]、番茄[4]、楊樹[5]等植物中克隆得到多個KT/HAK/KUP基因家族成員。研究表明，KT/ HAK/KUP家族成員屬于跨膜蛋白，主要定位于細胞的膜系統，包含10～15個跨膜域。在擬南芥中，鉀饑餓（無K+）可以誘導AtHAK5的表達，在鉀離子濃度小于50 μmol/L時athak5突變體種子萌發緩慢，根生長受抑制，鉀離子吸收能力降低[6]。鉀饑餓同樣可以誘導水稻OsHAK5表達，將OsHAK5在煙草BY2細胞中表達，鹽脅迫條件下細胞大量積累K+而非Na+，表明OsHAK5是對鹽敏感的高親和K+轉運蛋白基因[7]。擬南芥AtKUP1-4在發育時期的莖尖、花序分生組織、葉基部等組織中表達量有不同程度的增加，推測這些基因參與擬南芥的生長發育過程[8]。另外，鹽脅迫和激素刺激均能調控KUP基因的表達，表明KUP在維持細胞K+、Na+平衡和K+信號感知方面具有重要功能[9-10]。

天然橡膠是一種重要的工業原料和軍事戰略物資，巴西橡膠樹是天然橡膠生產的主要來源。目前關于巴西橡膠樹KT/HAK/KUP基因家族的研究尚未見報道，這限制了我們對巴西橡膠樹鉀離子運輸和分配的全面了解。隨著橡膠樹基因組測序的完成和不斷優化，使我們能夠對整個橡膠樹KT/HAK/KUP基因家族進行全面系統的分析。本研究從橡膠樹轉錄組和基因組數據庫中鑒定得到31個KT/HAK/KUP基因家族成員，并從基因結構、系統進化和表達模式等方面對這些家族成員進行全面系統的分析。研究結果將有助于全面了解KT/HAK/KUP基因家族成員在橡膠樹鉀離子轉運和分配，以及生長發育和脅迫應答調控方面的重要功能。

1 ?材料與方法

1.1 ?材料

本研究不同組織轉錄組測序所用材料為巴西橡膠樹（Hevea brasiliensis）‘熱研7-33-97’，除了根來自于‘熱研7-33-97’組培苗外，其他組織（包括膠乳、樹皮、葉片、種子、雌花和雄花）均來自正常割膠橡膠樹（開割兩年以上），葉片不同發育時期的材料來自于一年生的‘熱研7-33- 97’嫁接苗;乙烯利處理的材料為‘熱研7-33-97’正常開割樹（3天一刀，不涂乙烯利刺激），用1.5%乙烯利在0、3、12、24 h等4個不同時間點涂抹橡膠樹割面。以上材料均來自海南省儋州市中國熱帶農業科學院院區實驗基地。

1.2 ?方法

1.2.1 ?橡膠樹KT/HAK/KUP家族成員的鑒定 ?橡膠樹基因組數據（包括基因組fasta文件和gff3文件注釋文件）來自本實驗橡膠樹基因組升級版本（未發表數據）。根據已發表文獻，從NCBI下載擬南芥[11]、水稻[12]、楊樹[5]和木薯[13]的KT/ HAK/KUP蛋白序列，利用HMMER軟件構建KT/ HAK/KUP的HMM模型，然后利用該模型對橡膠樹蛋白數據庫進行檢索，得到橡膠樹KT/ HAK/ KUP家族成員，然后通過Pfam和CDD數據庫，對鑒定出的橡膠樹KT/HAK/KUP進行保守域驗證。

1.2.2 ?基因結構和進化分析 ?根據橡膠樹基因組GFF3文件包含的相關注釋信息對橡膠樹KT/ HAK/KUP家族成員的基因結構和染色體定位進行分析，利用TBtools[14]軟件進行數據可視化作圖。利用MEGA 6.0[15]軟件構建系統進化樹，采用Neighbor-Joining方法進行分子系統學分析，進行1000次bootstrap統計學檢驗，利用軟件Figtree（http：//tree.bio.ed.ac.uk/software/figtree/）對進化樹進行調整修飾。

1.2.3 ?基因的表達模式分析 ?利用solexa轉錄組測序數據[16]對橡膠樹KT/HAK/KUP基因在不同組織、不同葉片發育時期和乙烯利處理下的表達進行分析。首先對原始數據去除低質量序列，然后利用程序RSEM[17]進行表達分析，最后結合進化樹信息，利用TBtools繪制熱圖。

2 ?結果與分析

2.1 ?橡膠樹KT/HAK/KUP家族成員的鑒定

本研究利用已發表的擬南芥、水稻、楊樹和木薯KT/HAK/KUP蛋白氨基酸序列構建HMM模型，對橡膠樹蛋白數據進行檢索，得到31個KT/HAK/ KUP基因家族成員同源序列。通過Pfam和CDD數據庫分析發現，31個成員都含有KT/ HAK/KUP蛋白的所特有的保守結構域，命名為HbKUP1～HbKUP31（表1）。KT/HAK/KUP基因家族31個成員分布在3個Contig和15個染色體上，8號染色體上成員數目較多共8個，其中5個為串聯重復;各基因成員編碼的氨基酸殘基數目在288～881個不等，蛋白分子量分布在31.82～ 98.96 kDa，大多編碼堿性蛋白，等電點分布在5.04～ 9.3之間，其蛋白產物均定位于細胞質膜（表1）。

2.2 ?橡膠樹KT/HAK/KUP家族成員的染色體定位

從31個橡膠樹KT/HAK/KUP家族成員的染色體定位可以看出（圖1，表1），8號染色體上成員數目最多有8個成員，17號染色體上有3個成員，1、6、14和16號染色體上均有2個成員，

3、4、5、9、10、11、13、15和18號染色體，以及3個Contig上面均有1個成員（表1）。其中8號染色體上5個成員成簇分布，6、16和17號染色體上有成員成對分布，這些成員可能是進化中通過基因復制產生的串聯重復，而6和16號染色體上基因的復制可能發生6和16號染色復制之前，這從兩個染色體間成員的同源性高于每個染色體上2個成員之間的同源性可以看出（藍線連接表明有較高同源性）。從圖中可以看出，串聯復制和染色體復制事件是KT/HAK/KUP家族成員擴張的重要因素。

2.3 ?基因結構和進化分析

利用基因組序列及注釋文件，對橡膠樹KT/ HAK/KUP基因的外顯子/內含子結構進行了分析。結果發現，各家族成員內含子數目在5～11之間，在相同進化分支中的各成員在內含子數目

和相對位置上更為相似，部分成員出現了較大內含子，如HbKUP2、HbKUP17和HbKUP18（圖2B）;在蛋白結構域方面，大部分家族成員都具有相似的motif，也有部分成員出現了motif的缺失，如HbKUP12和HbKUP19在蛋白的N端，HbKUP22的C端，以及HbKUP1、HbKUP18和HbKUP27中部有motif的缺失，這部分成員可能在進化過程中產生了功能分化（圖2A）。

為了比較橡膠樹和其他植物KT/HAK/KUP蛋白在進化上的相互關系，選取了楊樹（Populus trichocarpa， Pt）、擬南芥（Arabidopsis thaliana， At）、水稻（Oryza sativa， Os）、木薯（Manihot esculenta， Me）和蓖麻（Ricicus communis， Rc），以及橡膠樹（Hevea brasiliensis， Hb）KT/HAK/KUP蛋白氨基酸序列，利用軟件MEGA 6.0采用Neighbor-Joining法，并進行1000次bootstrap統計學檢驗構建進化樹（圖3）。從圖中可以看出，KT/HAK/KUP家族在進化上分為4個大的分支Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ，其中Ⅰ和Ⅱ又分為Ⅰ- a，Ⅰ-b和Ⅱ-a，Ⅱ-b。在每個分支中橡膠樹和木薯聚在一起，這和二者的親緣關系更近是一致的。在Ⅱ-b中HbKUP27和其他4個成員HbKUP28～ HbKUP31聚在一起，而這5個成員對應的基因成簇出現在8號染色體上，通過串聯復制而來，其中HbKUP27在進化過程中出現基因結構缺失。從后續表達分析可以看出HbKUP27失去功能不表達，而HbKUP30和HbKUP31則主要在膠乳中起作用。

2.4 ?橡膠樹KT/HAK/KUP基因家族成員的表達分析

利用本實驗室已有轉錄組測序數據對31個橡膠樹KT/HAK/KUP基因在不同組織、不同葉片發育時期和乙烯利處理后不同時間點的表達情況進行了分析。其中不同組織包括膠乳、樹皮、葉片、根、種子、雌花和雄花。從圖4可以看出，部分家族成員功能相對比較保守，在各組織中均有表達，如HbKUP3、HbKUP8、HbKUP9、HbKUP18、HbKUP19、HbKUP20和HbKUP22（圖4）;部分成員在膠乳中表達豐度較高，如HbKUP20、HbKUP22和HbKUP30;葉片中HbKUP5和HbKUP9表達豐度相對較高，而樹皮中HbKUP5、HbKUP7、HbKUP9和HbKUP26表達豐度較高。另外，在根中HbKUP9的表達豐度也是最高的，說明HbKUP9在各組織鉀離子運輸中具有重要作用，而在進化過程中又進化出組織特異性表達的新成員。

KT/HAK/KUP基因在葉片發育過程中的表達情況如圖5所示，在葉片發育過程中部分家族成員的表達發生明顯變化，如HbKUP5和HbKUP9明顯上調表達，在穩定態葉中表達豐度達到最高;HbKUP6呈明顯下調表達，在庫葉中表達豐度較高;而HbKUP14的表達呈先上升后下降的趨勢，主要在變色期的葉中表達。以上基因的表達可能參與調節葉片細胞的滲透壓，進而影響葉片的生長發育。

為分析乙烯刺激對膠乳中基因表達的影響，進行了乙烯利刺激實驗。結果表明，在乙烯刺激前后，HbKUP20、HbKUP22和HbKUP30的表達豐度都相對較高，這和前面不同組織表達分析結果一致。HbKUP22、HbKUP30和HbKUP31受乙烯刺激影響，上調表達，HbKUP30和HbKUP31上升趨勢最為明顯（圖6）。從前面基因的染色體定位分析可以看出，HbKUP30和HbKUP31是在8號染色體，通過串聯復制進化而來，這2個基因可能是在橡膠樹進化過程中產生的用來調控乳管滲透壓的特異表達基因。在割膠過程中，乳管細胞將失去大量細胞質，需要補充大量水分和碳源，滲透壓的調節顯得尤為重要。另外，鉀在植

物中還參與多種酶的活化，具有重要的生物學功能。由以上結果可以推測HbKUP30和HbKUP31在橡膠樹乳管膠乳再生過程中具有重要作用。

低溫寒害是制約我國橡膠種植面積的重要因素，已有文獻表明KT/HAK/KUP在植物抗逆方面具有重要功能。因而本研究對KT/HAK/KUP基因在低溫脅迫下的表達情況進行了分析。結果表明，HbKUP5和HbKUP9在葉片中表達相對較高，和前面基因在不同組織中的表達分析結果一致，但HbKUP5和HbKUP9在低溫敏感品種‘熱墾501’與抗寒品種‘93-114’葉片中的表達存在明顯不同，在4℃低溫處理1 h后HbKUP5和HbKUP9在‘熱墾501’中表達呈上升趨勢，而在‘93-114’中表達呈明顯的下降趨勢（圖7），這可能和2種材料對低溫的響應機制不同有關。由以上結果可以推測，HbKUP5和HbKUP9的表達和橡膠樹的抗寒具有一定的相關性。

3 ?討論

天然橡膠是一種重要的工業原料和軍事戰略

物質，巴西橡膠樹是天然橡膠的主要來源。天然橡膠樹的生成需要消耗大量的原料，鉀作為植物生長所必需的三大主要元素之一，在調控植物生長發育和參與植物逆境脅迫應答等方面具有重要作用，鉀離子對于橡膠樹膠乳的再生也必然具有重要作用。本研究從橡膠樹基因組中鑒定出31個KT/HAK/KUP家族基因，在進化上主要分為4個大的分支，從水稻[12]、楊樹[5]、木薯[13]等不同植物的研究可以看出，KT/HAK/KUP家族成員的數目在進化過程中出現了較大幅度的擴增，主要通過染色片段復制和基因的串聯復制實現。但通過分析可以發現，其他植物的串聯重復大多是2～3個成員的串聯重復[18-19]，而在橡膠樹中卻出現了多達5個成員的串聯重復。從基因的表達還可以看出，這5個串聯重復成員中僅2個成員HbKUP30和HbKUP31主要在膠乳中表達，其他成員在各組織中均不表達或表達量很低，在乙烯利處理后HbKUP30和HbKUP31的表達都出現了明顯的上升趨勢，這和乙烯處理后膠乳產量呈上升趨勢一致。從橡膠樹的進化來看，橡膠樹乳管是在進化過程中產生的一種特化組織，乳管中合成了大量的次生代謝產物天然橡膠烴，而這個過程需要大量的原料補充，這其中也包括鉀離子，因而橡膠樹在進化過程中進化出了適應這一功能的基因HbKUP30和HbKUP31，進而保障了乳管中天然橡膠生物合成的順利進行。本研究從基因家族成員的鑒定、染色體定位、基因結構、系統進化和表達模式等方面對橡膠樹KT/HAK/KUP各家族成員進行了系統的分析，從中篩選出橡膠樹乳管和葉片等組織中主要表達的成員。研究結果為深入研究KT/HAK/KUP基因家族的功能和培育高鉀抗逆的橡膠樹品種提供了理論基礎。

參考文獻

[1] LI W H， XU G H， ALLI A， YU L. Plant KT/HAK/KUP K+ transporters： Function and regulation[J]. Seminars in Cell and Developmental Biology， 2018， 74： 133-141.

[2] YANG Z F， GAO Q S， SUN C S， LI W J， GU S L， XU C W. Molecular evolution and functional divergence of HAK potassium transporter gene family in rice （Oryza sativa L.）[J]. Journal of Genetics and Genomics， 2009， 36（3）： 161-172.

[3] ZHANG Z B， ZHANG J W， CHEN Y J， LI R F， WANG H Z， WEI J H. Genome-wide analysis and identification of HAK potassium transporter gene family in maize （Zea mays L.）[J]. Molecular Biology Reports， 2012， 39（8）： 8465-8473.

[4] HYUN T K， RIM Y， KIM E， KIM J S. Genome-wide and molecular evolution analyses of the KT/HAK/KUP family in tomato （Solanum lycopersicum L.）[J]. Genes & Genomics， 2014， 36（3）： 365-374.

[5] HE C Y， CUI K， DUAN A G， ZENG Y F， ZHANG J G. Genome-wide and molecular evolution analysis of the Poplar KT/HAK/KUP potassium transporter gene family[J]. Ecology and Evolution， 2012， 2（8）： 1996-2004.

[6] YOYNG J P， MARKUS G， JULIAN I S， MYEON H C. High-affinity k+ transport in arabidopsis： athak5 and akt1 are vital for seedling establishment and postgermination growth under low-potassium conditions[J]. Plant Physiology， 2010， 153 （2）： 863-875.

[7] TOMOAKI H， MITSUO S， TOMOYUKI O， KOICHIRO T， PULLA K N， MAKI K， ATSUHIKO S， HIDEKI N. Rice sodium-insensitive potassium transporter， OsHAK5， confers increased salt tolerance in tobacco BY2 cells[J]. Journal of Bioscience and Bioengineering， 2011， 111（3）： 346-356.

[8] LI Y， PENG L R， XIE C Y， SHI X Q， DONG C X， SHEN Q R， XU Y C. Genome-wide identification， characterization， and expression analyses of the KT/HAK/KUP potassium transporter gene family reveals their involvement in K+ deficient and abiotic stress responses in pear rootstock seedlings[J]. Plant Growth Regul， 2018， 85 （2）： 187-198.

[9] HU J， MA Q， KUMAR T， DUAN.， ZHANG J， YUAN H， WANG Q， KHAN S， WANG P， WANG S. ZxSKOR is important for salinity and drought tolerance of Zygophyllum xanthoxylum by maintaining K+ homeostasis[J]. Plant Growth Regulation， 2016， 80（2）： 195-205.

[10] ADAMS E， SHIN R. Transport， signaling， and homeostasis of potassium and sodium in plants[J]. Journal of Integrative Plant Biology， 2014， 56（3）： 231-249.

[11] MARKUS G， PASCAL M. Potassium transporters in plants-Involvement in K+ acquisition， redistribution and homeostasis[J]. FEBS Letters， 2007， 581（12）： 2348-2356.

[12] MADHUR G， QIU X H， WANG L， XIE W B， ZHANG C J， XIONG L Z， LIAN X M， ZHANG Q F. KT/HAK/KUP potassium transporters gene family and their whole-life cycle expression profile in rice （Oryza sativa）[J]. Molecular Genetics & Genomics， 2008， 280（5）： 437.

[13] OU W J， MAO X， HUANG C， TIE W W， YAN Y， DING Z H， WU C L， XIA Z Q， WANG W Q， ZHOU S Y， LI K M， HU W. Genome-wide identification and expression analysis of the KUP family under abiotic stress in cassava （Manihot esculenta Crantz）[J]. Frontiers in Physiology， 2018， 9： 17.

[14] CHEN C J， CHEN H， ZHANG Y， HANNAH R T， MARGARET H F， HE Y H， XIA R. TBtools： An integrative toolkit developed for interactive analyses of big biological data[J]. Molecular Plant， 2020， 13（8）： 1194-1202.

[15] KOICHIRO T， GLEN S， DANIEL P， ALAN F， SUDHIR K. MEGA6： molecular evolutionary genetics analysis version 6.0[J]. Molecular Biology & Evolution， 2013， 30（12）： 2725- 2729.

[16] XIAO X H， YANG M， SUI J L， JIYAN QI， YONGJUN FANG， SONGNIAN HU， CHAORONG TANG. The calcium-dependent protein kinase （CDPK） and CDPK-related kinase gene families in Hevea brasiliensis-comparison with five other plant species in structure， evolution， and expression[J]. Febs Open Bio， 2017， 7（1）： 4-24.

[17] LI B， DEWEY C N. RSEM： accurate transcript quantification from RNA-Seq data with or without a reference genome[J]. BMC Bioinformatics， 2011， 12（1）： 323-323.

[18] ZHOU J， ?ZHOU H J， CHEN P， ZHANG L L， ZHUJ T， LI P F， YANG J， KE Y Z， ZHOU Y H， LI J A， DU H. Genome-wide survey and expression analysis of the KT/HAK/ KUP family in Brassica napus and its potential roles in the response to K+ deficiency[J]. international journal of molecular sciences， 2020， 21（24）： 9487.

[19] YANG X， ZHANG J J， WU A M， WEI H L， FU X K， TIAN M M， MA L， LU J H， WANG H T， YU S X. Genome-wide identification and expression pattern analysis of the HAK/KUP/KT gene family of cotton in fiber development and under stresses[J]. Frontiers in Genetics， 2020， 11： 566469.