月季優(yōu)質(zhì)品系的高效繁殖體系研究

楊海牛，何超超，寧國(guó)貴，沙 飛

（1.武漢市花木有限公司，武漢 430000；2.華中農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝林學(xué)學(xué)院，武漢 430070）

月月粉（Rosa chinensis‘Pink China’）為典型的二倍體原始月季變種，花深紫紅色，重瓣，四季開花［1］。月月粉本身不僅具有極高的觀賞價(jià)值，而且其獨(dú)特的開花習(xí)性對(duì)目前大多數(shù)流行月季、玫瑰等薔薇屬植物品種的改良有著廣闊的空間和潛力。對(duì)薔薇屬木本植物成熟器官的再生研究，目前主要集中在月季上［2-5］。盡管專家學(xué)者們?cè)诓煌潭壬蠈?duì)該屬木本植物再生進(jìn)行了較為系統(tǒng)的研究，但就該類植物種類而言缺乏對(duì)其高效的植物再生與繁殖體系的研究。

Oosumit 等［6］通過對(duì)草莓的遺傳轉(zhuǎn)化體系進(jìn)行研究，認(rèn)為草莓基因組小、生長(zhǎng)周期相對(duì)較短，可以作為薔薇科相關(guān)基因功能研究的模式植物，但是草本植物的生長(zhǎng)及開花習(xí)性與木本花卉有很大差別，因此用草莓作為材料進(jìn)行薔薇科相關(guān)基因功能研究具有一定的局限性。另外，雖然月月粉的體胚誘導(dǎo)及再生體系已經(jīng)建立，但其色澤的單調(diào)也給研究薔薇科木本植物的花色、花香相關(guān)代謝物帶來困難。本研究從月月粉自交后代里找到月季品系月月紅粉（Rosa chinensis‘Red and Pink’），其基因組不大，開花特殊、花深紫紅色的月月紅粉有望成為研究薔薇科木本植物的模式植物。為此，本研究利用月月紅粉葉片為外植體，建立了月月紅粉愈傷誘導(dǎo)、體細(xì)胞胚發(fā)生及增殖與萌發(fā)為途徑的高效月季繁殖體系。該體系從體細(xì)胞胚萌發(fā)、小植株形成、植株移栽至開花周期短，繁殖后代變異性少，不僅為月季等薔薇科木本園藝作物的功能基因研究提供平臺(tái)，同時(shí)為月月紅粉的繼續(xù)選育、評(píng)價(jià)與推廣奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料及培養(yǎng)條件

試驗(yàn)材料為月月紅粉的無(wú)菌苗葉片（圖1A）。

基本培養(yǎng)基為MS 和1/2 MS（有機(jī)不變，其余減半），添加不同種類和濃度的植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑，蔗糖30 g/L，瓊脂7.5 g/L，pH 5.8～6.0，121 ℃高壓滅菌 20 min。體細(xì)胞胚的基本培養(yǎng)基BM：MS+3% Glucose+0.3% GEL。培養(yǎng)溫度（24±2）℃；光照條件：黑暗（0 lx）8 h、正常光（1 000～1 500 lx）16 h。

1.2 月月紅粉愈傷組織誘導(dǎo)

以帶小葉柄的無(wú)菌苗單葉為外植體，接種在含有不同類型、不同濃度植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑的BM 培養(yǎng)基上，置于黑暗條件下培養(yǎng)，2 個(gè)月后統(tǒng)計(jì)愈傷組織的誘導(dǎo)率和觀察愈傷的生長(zhǎng)狀態(tài)。愈傷組織誘導(dǎo)率=產(chǎn)生愈傷組織的外植體數(shù)/接種的外植體總數(shù)×100%，統(tǒng)計(jì)標(biāo)準(zhǔn)為愈傷組織長(zhǎng)度≥5 mm。

1.3 體細(xì)胞胚的發(fā)生

將無(wú)菌苗的復(fù)葉自小葉柄基部切成帶小葉柄的單葉并劃傷葉脈，葉正面朝上接種于體細(xì)胞胚誘導(dǎo)培養(yǎng)基上置于黑暗條件下培養(yǎng)，培養(yǎng)4 個(gè)月后后統(tǒng)計(jì)體細(xì)胞胚誘導(dǎo)率。體細(xì)胞胚誘導(dǎo)率=產(chǎn)生體細(xì)胞胚的外植體數(shù)/接種的外植體總數(shù)×100%。

1.4 體細(xì)胞胚的增殖

將誘導(dǎo)所得的月月紅粉體細(xì)胞胚接種到含2，4-D 和 BA 的 BM 培養(yǎng)基上，置于黑暗條件下培養(yǎng)，4 周后觀察體細(xì)胞胚的生長(zhǎng)狀況。

1.5 體細(xì)胞胚的萌發(fā)、壯芽、成苗

將在誘導(dǎo)培養(yǎng)基上成熟體胚剝離，除去多余的愈傷組織，接種到萌發(fā)培養(yǎng)基1/2 MS+3% Glucose+0.3% GEL+1.0 mg/L BA+0.01 mg/L NAA 上光下培養(yǎng)20 d，觀察萌發(fā)情況；剪取不定芽放入壯芽培養(yǎng)基MS+0.1 mg/L BA+0.05 mg/L NAA+3%蔗糖+7.5 g/L瓊脂，待苗長(zhǎng)到2～4 cm，移入生根培養(yǎng)基1/2 MS+0.05 mg/L NAA+3%蔗糖+7.5 g/L 瓊脂。

1.6 數(shù)據(jù)分析

采用SAS 軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析，百分?jǐn)?shù)在分析前進(jìn)行平方根反正弦轉(zhuǎn)化（y=arcsinx1/2）。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑對(duì)月月紅粉愈傷誘導(dǎo)的影響

葉片外植體在黑暗中培養(yǎng)8 周后，觀察到外植體在不同培養(yǎng)基中表現(xiàn)出明顯差異。由表1 的結(jié)果可知，用不同濃度2，4-D 與0.5 mg/L BA 配比能顯著提高愈傷組織的誘導(dǎo)率。而且單獨(dú)添加2，4-D 的愈傷組織生長(zhǎng)狀態(tài)最佳，愈傷組織的顏色光澤、質(zhì)地更利于體細(xì)胞胚發(fā)生（圖1B）。因此，2，4-D 是篩選出的月月紅粉愈傷組織誘導(dǎo)的最佳植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑。

圖1 月月紅粉胚性愈傷誘導(dǎo)、體細(xì)胞胚胎發(fā)生及植株再生

2.2 不同添加物對(duì)月月紅粉體細(xì)胞胚發(fā)生的影響

添加物對(duì)月月紅粉體細(xì)胞胚發(fā)生具有一定的促進(jìn)作用。由表2 可知，單獨(dú)添加L-脯氨酸（L-p）或AgNO3對(duì)體細(xì)胞胚誘導(dǎo)沒有效果；在不含其他添加物的培養(yǎng)條件下，只有4.0 mg/L 的2，4-D 濃度能誘導(dǎo)體細(xì)胞胚的發(fā)生，體細(xì)胞胚誘導(dǎo)率為2.63%；而在同時(shí)添加 L-p 和 AgNO3的培養(yǎng)條件下，2，4-D 濃度為3.0、4.0、5.0 mg/L 均有體細(xì)胞胚發(fā)生，不同濃度梯度的體細(xì)胞胚誘導(dǎo)率之間差異顯著，并且體細(xì)胞胚誘導(dǎo)率隨著2，4-D 濃度的提高而提高，誘導(dǎo)率分別為2.93%、5.41%、5.72%。

表2 不同添加物對(duì)月月紅粉體細(xì)胞胚發(fā)生的影響

2.3 不同外植體對(duì)月月紅粉體細(xì)胞胚發(fā)生的影響

從表3 可以看出，復(fù)葉柄的愈傷誘導(dǎo)率高于小葉，且2，4-D 的濃度不影響其誘導(dǎo)率。但復(fù)葉柄體細(xì)胞胚的誘導(dǎo)產(chǎn)生需要更高濃度的2，4-D，高達(dá)6.0 mg/L。結(jié)果顯示誘導(dǎo)復(fù)葉柄產(chǎn)生的體細(xì)胞胚狀態(tài)較佳，增殖能力也強(qiáng)于小葉。

表3 月月紅粉不同外植體的體細(xì)胞胚發(fā)生

2.4 2，4-D 和BA 不同濃度組合對(duì)月月紅粉體細(xì)胞胚生長(zhǎng)狀態(tài)的影響

從表4 可以看出，在黑暗條件下，月月紅粉體細(xì)胞胚在添加有不同濃度組合的2，4-D 和BA 培養(yǎng)基上均能增殖，但是在不同處理間的體細(xì)胞胚增殖系數(shù)差異顯著。當(dāng) 2，4-D 濃度為 1.0 mg/L，BA 濃度為0.05 mg/L 時(shí)，體細(xì)胞胚的增殖率達(dá)到最高，此濃度處理下的體細(xì)胞胚生長(zhǎng)狀態(tài)良好。因此，適合月月紅粉體細(xì)胞胚增殖的培養(yǎng)基為：MS+1.0 mg/L 2，4-D+0.05 mg/L BA+3%Glucose+0.3%GEL。

表4 2，4-D 和BA 不同濃度組合對(duì)月月紅粉體細(xì)胞胚生長(zhǎng)狀態(tài)的影響

2.5 體細(xì)胞胚的萌發(fā)、壯芽、成苗

將體細(xì)胞胚置于萌發(fā)培養(yǎng)基1/2 MS+3% Glucose+0.3% GEL+1.0 mg/L BA+0.01 mg/L NAA 光照16 h，一周后出現(xiàn)綠色芽點(diǎn)（圖1C），兩周后出現(xiàn)小葉（圖1D）；將芽點(diǎn)切下置于壯芽培養(yǎng)基MS+0.1 mg/L BA+0.05 mg/L NAA+3%蔗糖+7.5 g/L 瓊脂，待苗長(zhǎng)到2～3 cm 高時(shí)（圖1E），將其切下置于生根培養(yǎng)基1/2 MS+0.05 mg/L NAA+3% 蔗糖+7.5 g/L 瓊脂，15～20 d開花（圖1F），待根長(zhǎng)到3～5 cm，將其移入營(yíng)養(yǎng)缽。

3 小結(jié)與討論

目前，雖然已有月季的再生及轉(zhuǎn)化的有關(guān)報(bào)道［3，7-10］，但是對(duì)于月月粉的研究尚在起步階段，缺乏對(duì)原始特色月季變種等進(jìn)行再生和轉(zhuǎn)化的研究。本試驗(yàn)利用 2，4-D 并同時(shí)添加了 L-p 和 AgNO3，系統(tǒng)地建立了月月紅粉愈傷誘導(dǎo)、體細(xì)胞胚發(fā)生及增殖與萌發(fā)為途徑的再生體系。

在不同外植體誘導(dǎo)體胚過程中，復(fù)葉柄誘導(dǎo)產(chǎn)生體細(xì)胞胚的效率比小葉高，而且體細(xì)胞胚生長(zhǎng)狀態(tài)更好，增殖率更高。可能原因是其發(fā)育階段不一致，導(dǎo)致其在內(nèi)源激素種類和濃度并不一樣。通過研究不同種類及其濃度梯度組合的激素對(duì)愈傷組織誘導(dǎo)率的影響，發(fā)現(xiàn)2，4-D 是月月紅粉誘導(dǎo)的最佳植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑。2，4-D 的添加提高了愈傷組織誘導(dǎo)率，同時(shí)為體細(xì)胞胚的發(fā)生提供更多的愈傷組織，經(jīng)過2，4-D 誘導(dǎo)產(chǎn)生的愈傷組織有著更高的體細(xì)胞胚發(fā)生的可能性，這個(gè)現(xiàn)象與其他木本植物種類已有的相關(guān)報(bào)道一致［11，12］。此外，L-p 和 AgNO3的添加可以在誘導(dǎo)階段改善愈傷組織的生長(zhǎng)狀態(tài)，提高體細(xì)胞胚發(fā)生的頻率。與其相對(duì)應(yīng)的解釋可能為L(zhǎng)-p作為氮源對(duì)體細(xì)胞胚的發(fā)生有一定的促進(jìn)作用。此外，加入一定濃度的AgNO3對(duì)培養(yǎng)環(huán)境形成了Ag+脅迫，促進(jìn)體細(xì)胞胚的發(fā)生。此現(xiàn)象與報(bào)道的在培養(yǎng)基中加入金屬離子可以提高體細(xì)胞胚的發(fā)生頻率，防止愈傷組織褐化和玻璃化相似［13］。

通過研究添加不同濃度梯度組合的2，4-D 和BA 對(duì)月月紅粉體細(xì)胞胚生長(zhǎng)狀態(tài)及增殖的影響，發(fā)現(xiàn)BA 與2，4-D 組合對(duì)體細(xì)胞胚增殖的效果要優(yōu)于僅分別單獨(dú)添加2，4-D 或者BA 的培養(yǎng)基，這與在其他物種上報(bào)道的體細(xì)胞胚增殖的影響結(jié)果一致［14-16］。

利用月月紅粉建立的體細(xì)胞胚植株再生體系從外植體到再生植株開花所需時(shí)間為6 個(gè)月左右，是目前報(bào)道的再生周期最短的木本植物。其再生模式不僅為月月紅粉自身的改良，而且為用其作為模式材料進(jìn)行薔薇科相關(guān)基因功能的轉(zhuǎn)基因研究奠定了基礎(chǔ)。