苦瓜多糖對小鼠淋巴細胞免疫調節作用的影響

阿爾祖古麗·阿卜力米提，李敬雙，金 鑫，于 洋?

（1. 錦州醫科大學 食品科學與工程學院，遼寧 錦州 121001；2. 錦州醫科大學 畜牧獸醫學院，遼寧 錦州 121001）

苦瓜是葫蘆科苦瓜屬植物（Momordica charantia L.）果實，是傳統的藥食兩用植物，具有多種藥理活性。從苦瓜果實中提取的苦瓜多糖（Momordica charantia polysaccharide，MCP）是一類雜多糖，主要含有半乳糖醛酸、半乳糖以及葡萄糖等單糖，是苦瓜的主要有效成分，具有提高免疫力、抗腫瘤[1]、降血糖[2]、抗疲勞[3]、抗氧化損傷[4]等功效?？喙现泻卸喾N有益成分，其中多糖是目前研究的熱點之一，多糖廣泛應用在臨床、農業、食品領域中。目前對MCP活性作用的研究也越來越多，杜國豐等[5]對比MCP及其鐵絡合物對四氧嘧啶致高血糖小鼠模型的降血糖作用，結果表明，MCP及其鐵絡合物給藥組都能顯著降低高血糖模型小鼠的血糖水平，且MCP鐵降血糖效果更顯著。于志江等[6]研究MCP對一次性力竭運動后小鼠疲勞緩解及氧化損傷影響。結果表明，MCP具有顯著的抗疲勞功效，可減輕大強度運動后自由基造成的氧化損傷，促進機體功能恢復。然而，目前還缺乏對MCP的功能作用及各種機制的研究，MCP的研究方向在降血糖作用和抗氧化功能方面較多，鮮有關于MCP免疫調節作用及其機制方面的報道，在MCP活性研究中還存在待研究的問題。因此，本實驗從細胞增殖、巨噬細胞吞噬能力、細胞因子以及mRNA表達方面觀察 MCP對小鼠脾淋巴細胞的影響，從而闡述MCP免疫調節活性及其作用機制，為MCP的開發研究及其在功能食品以及各領域中的廣泛利用提供有力的依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

Balb/c小鼠SPF級，體重（18±22）g，6～8周齡：錦州醫科大學生命科學院（生產許可證號SCXK（遼）2014-0004）；苦瓜多糖（MCP）：晨光生物技術有限公司提供；胎牛血清，無噬菌體、內毒素含量極低，適合于細胞株的保藏及組織器官培養，單抗研制：浙江天杭生物科技有限公司；甲基噻唑藍（MTT）、臺盼藍、RPMI-1640、二甲基亞砜（DMSO）、PBS和氯仿：京索萊寶科技有限公司；Trizol：碧云天生物技術；小鼠IL-4、IL-6、IFN-γ和IL-12細胞因子檢測試劑盒：上海酶聯生物科技有限公司。

1.2 儀器與設備

Varioskan FlashT多功能酶標儀：Thermo Fisher Scientific；SW-CJ-1F型超凈工作臺：蘇州凈化設備有限公司；CKX41SF倒置顯微鏡：日本OLYMPUS公司；TD5A低速離心機：湖南赫西儀器裝備有限公司；TDL80-2B 96孔或24孔板臺式離心機：上海安亭；CO2培養箱：美國SHELLAB；FA2004型電子天平：上海精密科學儀器有限公司；實時熒光定量PCR儀：德國Eppendorf公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 苦瓜多糖制備

精選原料-原料清洗-濃縮提取-濃縮干燥-粉碎滅菌等步驟，經純化制取，純度≥90%。

1.3.2 淋巴細胞懸液制備

小鼠用頸部斷髓法處死后取脾，無菌分離收集其淋巴細胞于離心管中離心，棄上清，裂解其中紅細胞，配置淋巴細胞懸液，進行細胞計數并檢測其活力，使細胞活力達95%以上，調整細胞密度為 5×106個/mL。

1.3.3 分組及處理

實驗設空白組、左旋咪唑組、MCP處理組，每組均設5個重復，每孔加入淋巴細胞懸液。空白組每孔加入完全培養基，陽性對照組每孔加入含有左旋咪唑（終濃度為 5 μg/mL）和完全培養基；MCP處理組每孔加入含不同濃度 MCP（終濃度為終濃度為40、80、160、320 μg/mL）和完全培養基。

1.3.4 MTT法檢測MCP對淋巴細胞增殖的影響

按 1.3.3實驗分組及處理各濃度組后，使用96孔細胞培養板，37 ℃、5% CO2培養后，加入MTT液，用酶標儀測定OD570值，進一步判斷小鼠脾淋巴細胞增殖率。

1.3.5 檢測小鼠腹腔巨噬細胞的吞噬能力

小鼠斷頸處死后，腹腔注射5 mLPBS，輕柔腹部，收集腹腔液，離心后棄上清，用臺盼藍檢測細胞活力，用RPMI-1640完全培養基使細胞懸浮，調整細胞濃度。將調整好的細胞接種于96孔板中，37 ℃、5% CO2培養條件下培養4 h，去除未貼壁的細胞，按照1.3.3加入不同濃度的MCP繼續培養24 h后，棄上清，每孔加入1%的中性紅溶液100 μL，繼續培養1 h，加細胞裂解液V（無水乙醇）∶V（冰乙酸）=1∶1后 4 ℃裂解12 h，用酶標儀540 nm處測定吸光度。

1.3.6 ELISA法檢測 MCP對淋巴細胞分泌細胞因子的影響

按1.3.3實驗分組及處理各濃度組，37 ℃、5% CO2培養后，按照小鼠ELISA試劑盒說明書的操作檢測上清液中細胞因子IL-4、IFN-γ、IL-6和IL-12的分泌量。

1.3.7 MCP對 IL-4、IFN-γ、IL-6和 IL-12mRNA表達的影響

按1.3.3實驗分組及處理各濃度組，37 ℃、5% CO2培養后，用trizol法提取RNA，用核酸蛋白檢測儀測定OD值，OD260/OD280的比值在1.8～2.1之間，可鑒別提取的RNA純度較好，質量較高。按試劑盒的說明操作反轉錄合成 cDNA，根據說明書進行PCR體系和參數設置及下一步進行擴增程序。選用β-actin作為內參，用相對定量的分析方法 2-ΔΔCT分析基因的相對表達量。引物序列及擴增長度見表1。

表1 實驗中小鼠IL-4、IFN-γ、IL-6和IL-12和內參ACTB引物序列Table 1 Mouse IL-4、IFN-γ、IL-6 and IL-12 and internal reference ACTB primer sequences in the experiment

1.4 數據分析

實驗數據用 SPSS 20.0軟件進行分析，數值以平均數±標準差（±s）表示，采用單因素方差分析，以LSD法進行顯著性差異分析。

2 結果與分析

2.1 MCP對淋巴細胞增殖的影響

MCP對淋巴細胞增值的影響如表2所示，與空白組相比，作為陽性對照組的左旋咪唑能顯著地促進小鼠脾淋巴細胞的增殖（P＜0.05），且比MCP處理組最高濃度組的促進作用大；與空白組相比，不同濃度的MCP淋巴細胞刺激指數顯著升高（P＜0.05），說明MCP對淋巴細胞的增殖能力有不同程度的促進作用，淋巴細胞增殖趨勢隨MCP濃度的升高而升高，兩者之間呈良好的量-效關系；MCP濃度升到一定程度，淋巴細胞增殖數反而顯著下降，呈現出MCP雙向調節作用，但相對于空白組仍然有顯著增加。與左旋咪唑組相比，MCP各濃度組淋巴細胞刺激指數顯著下降（P＜0.05），MCP 在 80 μg/mL 濃度時無統計學意義（P＞0.05）。

表2 MCP對淋巴細胞增值的影響（±s，n=5）Table 2 Effect of MPC on lymphocyte proliferation (±s，n=5)

表2 MCP對淋巴細胞增值的影響（±s，n=5）Table 2 Effect of MPC on lymphocyte proliferation (±s，n=5)

注：用不同小寫字母表示有顯著性差異(P＜0.05)。下面的表格用同樣方法標注。Note: Different lower-case letters showed statistical significance(P＜0.05)。The following table is marked in the same way.

組別 淋巴細胞增殖指數空白組 1.00±0.00d左旋咪唑組 2.08±0.08a 40 μg/mLMCP 組 1.26±0.24c 80 μg/mLMCP 組 2.06±0.07a 160 μg/mLMCP 組 1.75±0.17b 320 μg/mLMCP 組 1.45±0.05c

2.2 檢測小鼠腹腔巨噬細胞的吞噬能力

MCP對小鼠腹腔巨噬細胞吞噬能力的影響如圖1顯示，與正常對照組而言，陽性對照組和MCP處理組巨噬細胞吞噬中性紅能力顯著增加（P＜0.05），說明MCP能促進巨噬細胞的吞噬能力；與陽性對照組相比，MCP各濃度處理組的小鼠巨噬細胞吞噬能力顯著下降（P＜0.05），且在MCP 80 μg/mL 時，差異不顯著（P＞0.05）。

圖1 MCP對小鼠腹腔巨噬細胞吞噬能力的影響Fig.1 Effect of MCP on phagocytosis of mice macrophages

2.3 MCP對淋巴細胞分泌細胞因子的影響

MCP對淋巴細胞IL-4、IFN-γ、IL-6和IL-12分泌的影響由表3可知，與空白組相比，左旋咪唑組和 MCP處理組淋巴細胞 IL-4、IFN-γ、IL-6和IL-12分泌量均顯著升高（P＜0.05），說明左旋咪唑和MCP能夠誘導淋巴細胞IL-4、IFN-γ、IL-6和IL-12的分泌；淋巴細胞IL-4、IFN-γ、IL-6和IL-12分泌量隨MCP濃度的升高而逐漸升高且呈雙向調節作用。與左旋咪唑組相比，MCP為 80 μg/mL 濃度組淋巴細胞 IL-4、IFN-γ、IL-6 和 IL-12的分泌量差異不顯著（P＞0.05），其余各濃度組均有統計學意義（P＜0.05）。

表3 MCP對淋巴細胞IL-4、IFN-γ、IL-6和IL-12分泌的影響（±s，n=5）Table 3 Effect of MPC on the secretion of IL-4、IFN-γ、IL-6 和 IL-12 in lymphocytes (±s, n=5) pg/mL

表3 MCP對淋巴細胞IL-4、IFN-γ、IL-6和IL-12分泌的影響（±s，n=5）Table 3 Effect of MPC on the secretion of IL-4、IFN-γ、IL-6 和 IL-12 in lymphocytes (±s, n=5) pg/mL

組別 IL-4含量 IFN-γ含量空白組 179.86±0.014e 741.37±0.03d左旋咪唑組 252.47±0.04a 861.63±0.01a 40 μg/mL MCP 組 190.62±0.01d 750.28±0.02d 80 μg/mL MCP 組 256.73±0.03a 874.83±0.04a 160 μg/mL MC 組 224.08±0.02b 844.39±0.01b 320 μg/mL MC 組 206.53±0.05c 809.83±0.02c IL-6含量 IL-12含量133.71±0.03d 124.02±0.09e 167.17±0.01a 160.51±0.07a 135.05±0.05d 132.48±0.09d 170.90±0.01a 160.43±0.05a 158.50±0.07b 152.38±0.05b 145.15±0.13c 140.86±0.03c

2.4 MCP 對淋巴細胞 IL-4、IFN-γ、IL-6 和 IL-12 mRNA的影響

由表4和圖2～5可知，左旋咪唑組和 MCP處理組淋巴細胞IL-4、IFN-γ、IL-6和 IL-12 mRNA表達均高于空白組（P＜0.05），由此說明MCP促進IL-4、IFN-γ、IL-6和IL-12的分泌可能是通過增加IL-4、IFN-γ、IL-6和IL-12 mRNA表達量來調節的。淋巴細胞 IL-4、IFN-γ、IL-6和 IL-12 mRNA表達量隨MCP濃度的升高而逐漸升高，當濃度為80 μg/mL 時 IL-4、IFN-γ、IL-6 和 IL-12 mRNA 表達量最佳，同左旋咪唑組IL-4、IFN-γ、IL-6和IL-12 mRNA表達量相當，與左旋咪唑組相比沒有顯著性差異（P＞0.05）；當繼續升高濃度至一定程度時淋巴細胞IL-4、IFN-γ、IL-6和IL-12 mRNA表達有下降的趨勢，說明 MCP對誘導淋巴細胞 IL-4、IFN-γ、IL-6和IL-12 mRNA表達呈雙向調節作用。

表4 MCP對淋巴細胞IL-4、IFN-γ、IL-6和IL-12 mRNA的影響（n=5）Table 4 Effect of MPC on the secretion of IL-4、IFN-γ、IL-6 和 IL-12 mRNA in lymphocytes (±s, n=5)

表4 MCP對淋巴細胞IL-4、IFN-γ、IL-6和IL-12 mRNA的影響（n=5）Table 4 Effect of MPC on the secretion of IL-4、IFN-γ、IL-6 和 IL-12 mRNA in lymphocytes (±s, n=5)

組別 IL-4 mRNA相對表達量 IFN-γmRNA相對表達量 IL-6mRNA相對表達量 IL-12mRNA相對表達量空白組 1.00±0.00d 1.00±0.00d 1.00±0.00e 1.00±0.00e左旋咪唑組 8.23±0.86a 7.53±0.32a 8.84±0.43b 8.61±0.61a 40 μg/mL MCP 組 2.02±0.13d 4.35±0.29c 6.67±0.31c 6.98±0.22b 80 μg/mL MCP 組 9.18±0.39a 7.17±0.49a 9.37±0.73 a 8.95±0.18a 160 μg/mL MC 組 5.16±0.47b 5.09±0.53b 9.10±0.26a 4.49±0.30c 320 μg/mL MC 組 3.97±0.36c 2.72±0.34d 4.85±0.35d 2.30±0.27d

圖2 IL-4 mRNA電泳圖譜Fig.2 Electrophoresis results of IL-4 mRNA

圖3 IL-6 mRNA電泳圖譜Fig.3 Electrophoresis results of IL-6 mRNA

圖4 IFN-γ mRNA電泳圖譜Fig.4 Electrophoresis results of IFN-γ mRNA

圖5 IL-12 mRNA電泳圖譜Fig.5 Electrophoresis results of IL-12 mRNA

3 討論

3.1 MCP對淋巴細胞增殖的影響

細胞的增殖在生物體生長、發育、繁殖以及遺傳功能上起重要的作用。淋巴細胞的增殖對于維持器官的結構和正常的免疫功能至關重要。細胞增殖伴隨著許多基因的轉錄和許多細胞因子的表達[7]。魯振國等[8]研究表明，玉竹多糖和板藍根多糖對環磷酰胺造模形成免疫抑制雛雞免疫系統具有調節功能，可增強外周淋巴細胞增殖。相關研究中，張逸等[9]發現MCP在100～500 μg/mL濃度范圍內，能明顯的促進小鼠淋巴細胞增殖，具有顯著的免疫增強和腫瘤抑制的活性。袁華等[10]體外實驗證實 MCP能夠抑制人乳腺癌MDA-MB-231細胞的增殖及生長以及促進MDA-MB-231細胞凋亡，從而實現抑瘤作用，并出現藥物濃度依賴性。同樣，本次試驗以左旋咪唑為陽性對照，觀察MCP對體外培養小鼠脾淋巴細胞增殖功能的影響，發現在40～320 mg/mL范圍內，MCP能顯著提高小鼠脾淋巴細胞體外增殖，濃度為80 μg/mL時效果最為明顯，且與左旋咪唑組差異不顯著（P＞0.05），MCP與左旋咪唑均能刺激小鼠脾淋巴細胞的增殖。

3.2 MCP對小鼠腹腔巨噬細胞的吞噬能力的影響

免疫系統的吞噬細胞主要由巨噬細胞和中性粒細胞組成。這些細胞代表了非特異性宿主防御和炎癥的主要細胞效應。中性粒細胞和巨噬細胞通過吞噬外來物質并釋放細胞毒性和促炎介質的能力，保護機體免受各種病原體和外源性物質的侵襲，并在宿主對組織損傷的反應中發揮核心作用[11]。巨噬細胞是免疫必不可少的細胞，需要建立和調節先天反應。參與吞噬和殺死致病微生物，清除受損和衰老[12]。大蒜素對對脂多糖誘導小鼠腹腔巨噬細胞的影響這個研究中報道[13]，大蒜素能提高巨噬細胞的吞噬能力，能顯著抑制LPS誘導的小鼠腹腔巨噬細胞的炎癥反應，其機制可能與抑制NF-κB信號通路激活有關。王瑩[14]等研究不同分子量枸杞多糖對RAW264.7巨噬細胞的免疫調節作用時，發現其對巨噬細胞的增殖、吞噬能力和mRNA等均有促進作用。本試驗中，MCP不同處理組與陽性對照組對腹腔巨噬細胞吞噬能力均有促進作用，增強吞噬活性來發揮其免疫調節作用。

3.3 MCP 對淋巴細胞 IL-4、IFN-γ、IL-6 和 IL-12分泌細及mRNA表達的影響

細胞因子（cytokine，CK）細胞因子不僅在維持動態平衡方面很重要，而且是癌癥、自身免疫、肥胖和急慢性炎癥等一系列疾病過程中的重要介質。體內幾乎每一個細胞的生存和活動都受到生長因子的調節。細胞因子的產生是由通過細胞內和細胞外病原體識別受體（PRRs）感知危險信號而產生的上游信號驅動的。細胞因子是維持體內平衡以及先天和適應性免疫反應的關鍵因素，而調節失調的細胞因子的產生則對個體產生影響。因此，調節細胞因子的產生，使特定的細胞群體和機體保持平衡。按細胞因子類型和生物學功能的不同可以分成兩類：一類是促炎癥細胞因子（如 IL-2，IL-1，IFN-γ，TFN）；二類是/抗炎癥細胞因子（如IL-4，IL-6，IL-10），這兩種細胞因子的比例失衡會造成對機體的一些損害[15]。類似實驗報道，檀新珠[16]等研究不同質量濃度的太子參莖葉多糖對小鼠脾細胞增殖及細胞因子的影響，結果太子參莖葉多糖能刺激淋巴細胞增殖，能升高細胞因子 IL-2、IL-4、IL-6和 IFN-γ的含量，且有一定的劑量依賴性，證實太子參莖葉多糖具有提高免疫的能力。崔旻等[17]對正常小鼠及糖尿病模型小鼠脾臟細胞進行體外培養，ELISA檢測培養上清的細胞因子時發現 MCP可能通過調節Th1和Th2細胞亞群之間的平衡，改善糖尿病模型小鼠Th1和Th2細胞亞群之間嚴重的失衡狀態。因此，本試驗判斷 MCP對淋巴細胞 IL-4、IFN-γ、IL-6和IL-12均有不同程度的誘導分泌作用，調節失調的細胞因子，維持平衡。

IL-4由Th2細胞分泌并發揮多種功能，在免疫病理學中的作用不可小覷，IL4的一個重要特性是其在體外促進 Th2分化的能力[18]。IFN-γ是一種由Th1和NK細胞響應白介素-12產生的細胞因子，可促進Th1免疫反應的進行和巨噬細胞的活化，在許多細胞系統中具有與Th2型細胞因子拮抗的生物學功能[19]。IFN-γ具有抗病毒[20]、免疫調節及抗腫瘤特性[21]。IL-6是一種由多種由免疫細胞和非免疫細胞產生的[22]，具有多效性和冗余性，IL-6在多種細胞類型的分化中發揮重要作用，可以增強免疫反應。IL-6能抑制Th1的分化，IL-6存在下分化的Th1細胞產生的IFN-γ會減少。在免疫反應中，IL-12作為先天免疫系統和適應性免疫系統之間的紐帶發揮著核心作用[23]。因此，本試驗觀察MCP對這幾種細胞因子的分泌和mRNA表達的影響判斷免疫活性。其他研究也有證實，猴頭菇多糖研究了猴頭菇多糖對小鼠體外脾淋巴細胞分泌Th1、Th2細胞因子的量及mRNA表達量的影響，結果顯示，猴頭菇多糖在25～400 mg/L濃度范圍內能顯著刺激 T細胞亞群 Th1細胞因子（IL-2、IFN-γ、TNF-α）和 Th2 細胞因子（IL-4、IL-6）的分泌及mRNA的表達，通過調節Th1/Th2平衡，發揮雙重免疫調節作用[24]。朱建飛[25]等通過MTT法檢測，菜籽多糖WPS-1對淋巴細胞具有明顯的增殖活性，并表現出明顯的劑量-效果關系。采用半定量RT-PCR進一步研究WPS-1對淋巴細胞分泌的細胞因子 1L-2、IL-4、IL-6、IFN-γmRNA表達的影響。結果顯示 WPS-1可以提高淋巴細胞相關因子 mRNA表達水平，這是WPS-1能提高免疫系統功能的作用機制之一。綜上可見，在本試驗中不同濃度的MCP處理可以在不同程度上促進淋巴細胞 IL-4、IFN-γ、IL-6和IL-12的分泌和上調mRNA表達，進一步調節免疫活性。

4 結論

MCP可提高小鼠脾淋巴細胞免疫活性，其作用機制可能是通過上調IL-4、IFN-γ、IL-6和IL-12 mRNA表達，誘導IL-4、IL-6、IFN-γ和IL-12細胞因子的分泌，促進細胞增殖，增強巨噬細胞吞噬活性，從而發揮其免疫調節作用提高免疫功能，其作用機制待深入研究，在今后的研究中會更詳實地驗證和完善。