蠶蛹粉對紅酵母發酵生產類胡蘿卜素的影響

陳 欣，王欣蕾，林蘭萍，曹麗彬，張 凱，譚曉錫

（江蘇科技大學 生物技術學院，江蘇 鎮江 212100）

類胡蘿卜素（Carotenoid）是一類呈黃色、橙紅色或紅色的多烯類化合物，主要包括β-類胡蘿卜素、蝦青素、葉黃素和蕃茄紅素等[1-3]，除具有轉化為 VA的生物活性外，還具有預防癌癥和心血管疾病等多種生理功能，因此多被應用于功能營養品、化妝品、食品添加劑、動物飼料等領域[4-6]。類胡蘿卜素的生產方法主要有動植物材料提取法、化學合成法以及微生物發酵法。動植物材料提取法受到季節、材料品種、生長環境等因素影響很大，而且工藝復雜，成本較高；由于易產生多種副產物，導致化學合成法的安全性受到質疑；微生物發酵法由于成本低，而且合成的類胡蘿卜素在構型、活性等方面同天然的類胡蘿卜素相一致，因而越來越受到大家的關注[7-13]。隨著微生物代謝工程領域及合成生物學的迅速發展，微生物法制造類胡蘿卜素的發展及普及將如虎添翼[8-11]。

利用工、農業副產物進行發酵可以降低成本、促進產量提高[14-19]，蠶蛹是蠶繭抽絲后的副產物，我國的蠶蛹年產量超過30萬t，約占世界總產量的80%[20]。蠶蛹中富含油脂、蛋白質、甲殼素、糖類、維生素、嘌呤以及豐富的微量元素，具有較高的營養保健價值，但由于致敏性以及食用后會引起部分人頭暈、惡心、嘔吐等不良反應，因而目前食品領域內未見到成熟且商業化的蠶蛹相關產品[21]。蠶蛹粉在作為動物飼料原料時易發生腐敗和惡臭，添加劑量不當時，還易使雞蛋、豬肉和雞肉帶有不良氣味，豬肉脂肪變黃；所以長期以來蠶蛹利用率較低，資源浪費較多[22]。

研究表明：細胞積累脂質是提高類胡蘿卜素產量的方法之一[12]，但類胡蘿卜素含量過高會影響細胞生長，所以提高酵母中油脂含量，不僅可以降低產物對細胞生長的影響，同時還可以為類胡蘿卜素的合成提供更多的前體[8]；酵母如果將過多的葡萄糖用于油脂的合成以提高類胡蘿卜素產量，將使原料轉化率減低，所以適當添加有機氮源，有利于葡萄糖的充分利用和類胡蘿卜素產量的提高[23]。基于以上原因，探索在培養基中添加蠶蛹粉，促進紅酵母類胡蘿卜素產量的提高，為桑蠶副產物的綜合利用和類胡蘿卜素的發酵生產工藝優化提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

紅酵母（Rhodotorulasp.）：江蘇科技大學生物工程實驗室保存；蠶蛹，粉碎備用：中國農科院蠶業研究所提供；葡萄糖、蛋白胨、酵母膏，分析純：國藥集團化學試劑有限公司。

1.2 儀器與設備

超凈工作臺（SW-C-J-1F）；蘇州安泰空氣技術有限公司；精密臺式pH計（310P-03）：上海杰晟科學儀器有限公司；搖擺粉碎機（HK-20B）：杭州旭朗機電有限公司；立式壓力蒸汽滅菌器（LDZX-40BI）：上海申安醫療器械廠；紫外/可見光分光光度計（UV-9100）：北京瑞利分析儀器公司；高速臺式離心機（TGL-16G）：上海安亭科學儀器廠；恒溫搖瓶柜（HYG-A）：金壇市精達儀器制造有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 培養基制備

斜面活化及發酵培養基：酵母膏10 g/L，蛋白胨20 g/L，葡萄糖20 g/L；若配置固體培養基，加入2%（w/v）瓊脂粉；121 ℃，15 min滅菌。

1.3.2 單因素實驗

在 250 mL的三角瓶中配制發酵培養基50 mL，分別添加不同濃度蠶蛹粉 0、2.5、5.0、7.5、10.0、12.5 g/L（其它單因素實驗選擇7.5 g/L），不同葡萄糖濃度15、20，25、30、35 g/L（其它單因素實驗選擇30 g/L），不同培養時間2、2.5、3、3.5、4、4.5 d（其它單因素實驗選擇4.0 d），發酵液不同初始pH 5.0、6.0、7.0、8.0、9.0（其它單因素實驗pH 7.0），接入活化的紅酵母1環，200 r/min振蕩培養，各3個平行，檢測生物量及類胡蘿卜素產量，結果取平均值。

1.3.3 正交實驗

選擇蠶蛹粉濃度、葡萄糖濃度、發酵時間、培養基初始 pH四個因素，每個因素選擇三個水平進行正交實驗（見表1），各3個平行，檢測生物量及類胡蘿卜素含量，結果取平均值。

表1 正交實驗設計Table 1 Orthogonal test design

1.3.4 細胞生物量（Biomass）的測定

將發酵液轉入離心管中，8 000 r/min離心3 min，棄上清液，菌體用無菌水洗后再離心，50 ℃左右烘干稱重。

1.3.5 類胡蘿卜素含量及產量的測定

類胡蘿卜素含量參照文獻[24]的方法測定，計算公式如下：

式中：Aλmax為類胡蘿卜素最大波長處的吸光度；D為色素浸提液稀釋倍數；V為浸提所用丙酮的總體積，mL；W為提取所用的發酵培養物重量，g；0.16為胡蘿卜素的摩爾消光系數。

類胡蘿卜素產量計算方法參照公式：

1.4 數據分析

采用Microsoft Excel軟件對實驗數據進行分析及繪圖，每組實驗重復3次，結果以（平均值±標準差）表示。

2 結果與分析

2.1 單因素實驗結果

2.1.1 蠶蛹粉濃度對類胡蘿卜素產量的影響

蠶蛹粉濃度對類胡蘿卜素發酵影響的結果見圖1，從圖1可以看出隨著蠶蛹粉濃度的上升，生物量和類胡蘿卜素呈先升高后降低的趨勢。在蠶蛹粉濃度從0 g/L提高到7.5 g/L時，生物量和類胡蘿卜素含量分別從19.23 g/L和513.62 μg/g升高至最大值22.54 g/L和643.67 μg/g，類胡蘿卜素產量達到 14.51 mg/L，比蠶蛹粉濃度為 0 g/L時提高了 46.9%。從蠶蛹粉濃度對類胡蘿卜素發酵影響的結果看出，不同蠶蛹粉濃度條件下生物量的差異不明顯，但是對類胡蘿卜素的生產有一定的促進作用。當蠶蛹粉濃度超過7.5 g/L時，生物量和葡糖胺均略有下降，這可能是因為蠶蛹粉濃度過高，對細胞產生一定的抑制作用，所以添加 7.5 g/L的蠶蛹粉對類胡蘿卜素的合成促進作用最大。

圖1 蠶蛹粉對類胡蘿卜素發酵的影響Fig.1 Effects of silkworm pupae powder on carotenoid production

2.1.2 葡萄糖濃度對類胡蘿卜素產量的影響

葡萄糖濃度對類胡蘿卜素發酵影響的結果見圖2，從圖2可以看出隨著葡萄糖濃度的上升，生物量和類胡蘿卜素呈先升高后降低的趨勢。在葡萄糖濃度從15 g/L提高到30 g/L時，生物量和類胡蘿卜素含量分別從13.50 g/L和537.80 μg/g升高至最大值21.58 g/L和654.12 μg/g，類胡蘿卜素產量達到14.12 mg/L，是葡萄糖濃度為15 g/L時產量的1.94倍，且生物量和類胡蘿卜素含量差異明顯。葡萄糖對生物量和類胡蘿卜素的生產均有一定的影響，當葡萄糖濃度超過30 g/L時，由于生物量出現下降趨勢從而導致了類胡蘿卜素產量的下降，這是因為葡萄糖濃度過高，對細胞生長產生一定的影響，所以添加30 g/L的葡萄糖對類胡蘿卜素的生產較為合適。由于紅酵母對纖維素的利用能力有限[25]，所以添加還原糖對促進紅酵母生物量的提高作用明顯，在生物量提高的基礎上，通過添加富含蛋白和脂肪的蠶蛹粉將有利于提高紅酵母細胞中油脂的含量，而較高的油脂含量將為類胡蘿卜素的合成提供更多的前體乙酰輔酶 A，因此促進了胡蘿卜素的合成，說明葡萄糖和蠶蛹粉是紅酵母發酵生產類胡蘿卜素的良好的碳源和氮源。

圖2 葡萄糖濃度對類胡蘿卜素發酵的影響Fig.2 Effects of glucose concentration on carotenoid production

2.1.3 培養時間對類胡蘿卜素產量的影響

培養時間對類胡蘿卜素發酵影響的結果見圖3，從圖3可以看出隨著培養時間的延長，生物量和類胡蘿卜素呈先升高后降低的趨勢。培養時間從2延長到4 d時，生物量和類胡蘿卜素含量分別從 5.70 g/L和 303.09 μg/g提高至最大值20.33 g/L和 632.45 μg/g，類胡蘿卜素產量達到12.86 mg/L，是培養時間2 d時的7.43倍。生物量和類胡蘿卜素含量隨著培養時間的延長增加較為明顯，說明培養時間對生物量和類胡蘿卜素的生產均有較大的影響。這是由于類胡蘿卜素是次生代謝產物，培養時間太短不利于生物量的提高和類胡蘿卜素的積累。當培養時間繼續延長，生物量和類胡蘿卜素含量略有下降，所以培養時間為4 d時對類胡蘿卜素的生產較為合適。

圖3 培養時間對類胡蘿卜素發酵的影響Fig.3 Effects of cultural time on carotenoid production

2.1.4 培養基初始pH對類胡蘿卜素產量的影響

培養基初始 pH對類胡蘿卜素發酵影響的結果見圖4，從圖4可以看出隨著培養基初始pH從5.0升高至9.0，生物量和類胡蘿卜素含量呈先增加后降低的趨勢。培養基初始 pH從 5.0升高至7.0時，生物量和類胡蘿卜素含量分別從9.77 g/L和 379.02 μg/g提高至最大值 19.69 g/L和614.27 μg/g，類胡蘿卜素產量達到 12.09 mg/L，是培養基初始pH5.0時的3.27倍。生物量和類胡蘿卜素的產量受培養基初始 pH的影響也較大。這一方面是由于培養基初始 pH影響菌體生長，另一方面，pH也可能影響菌體對蠶蛹粉的利用，結果表明中性略偏酸有利于紅酵母生物量和類胡蘿卜素產量的提高，培養基初始pH7.0時對類胡蘿卜素的生產較為合適。

圖4 培養基初始pH對類胡蘿卜素發酵的影響Fig.4 Effects of initial pH of fermentation medium on carotenoid production

2.2 正交實驗結果

正交實驗結果見表2，從表2可以看出培養時間對類胡蘿卜素的產量影響最大，蠶蛹粉濃度次之，而培養基初始 pH對類胡蘿卜素的產量影響最小，即各因素對類胡蘿卜素發酵產量的影響大小順序為：培養時間＞蠶蛹粉濃度＞葡萄糖濃度＞培養基初始pH。從極差R可知，最佳提取條件組合為A2B2C2D1，即蠶蛹粉濃度0.75%、葡萄糖濃度30 g/L、培養時間4.0 d、培養基初始pH 6.0時，類胡蘿卜素產量最大達到14.70 mg/L。在此條件下進行發酵實驗驗證，類胡蘿卜素產量為14.88 mg/L，較單因素實驗最高產量提高0.37 mg/L。

表2 正交實驗結果Table 2 Results of orthogonal experiments

3 結論

（1）單因素實驗結果表明：葡萄糖和蠶蛹粉是紅酵母發酵生產類胡蘿卜素的良好碳源和氮源，添加7.5 g/L的蠶蛹粉和30 g/L的葡萄糖時，類胡蘿卜素產量最高；培養時間太短不利于生物量的提高和類胡蘿卜素的積累，當培養時間達到4 d時，類胡蘿卜素的產量最高；菌體生長受培養基初始 pH影響較大，中性略偏酸有利于紅酵母生物量和類胡蘿卜素產量的提高。

（2）正交實驗結果顯示：各因素對類胡蘿卜素發酵產量的影響大小順序為：培養時間＞蠶蛹粉濃度＞葡萄糖濃度＞培養基初始 pH。從極差R可知，最佳提取條件組合為A2B2C2D1，即蠶蛹粉濃度7.5 g/L、葡萄糖濃度30 g/L、培養時間4.0 d、培養基初始pH6.0時，類胡蘿卜素產量最大達到14.70 mg/L。

（3）在正交實驗結果的條件下進行實驗驗證，類胡蘿卜素產量為14.88 mg/L，較單因素實驗最高產量提高0.37 mg/L，實驗結果為桑蠶副產物的綜合利用和類胡蘿卜素的發酵生產工藝優化提供實驗依據。