基于mtDNA D-Loop區和Cytb基因的清水江斑鱖群體遺傳多樣性分析

麻智芳，潘秋芝，安 苗，李 珊，黃 勝，余 科

(1.貴州大學動物科學學院，貴陽 550025；2.貴州農業職業學院，貴陽 551499)

斑鱖(Sinipercascherzeri)隸屬于鱸形目(Perciformes),鮨科(Sinipercidae),鱖屬，俗稱花鱸、黑鱖等，是東亞特有的淡水經濟魚類，也是鱖類分布最廣的群體之一，南起越南紅河，北至遼寧南部、朝鮮半島均有分布[1]。斑鱖分布廣、個體較大、數量也較為豐富，是我國鱖屬主要的經濟種類之一[2]。20世紀90年代學者研究發現，野生斑鱖資源由于不合理捕撈和生境遭到破壞而呈現下降趨勢[3-4]。近年來，由于野生資源量驟減和人工定向繁育等原因，鱖類的種質資源呈現退化現象[5-6]。因此,開展野生斑鱖的遺傳多樣性調查對斑鱖的種質資源保護與合理開發利用具有重要的意義。

清水江位于苗嶺山脈東段北面的云貴高原向湘桂丘陵過渡的斜坡地帶上，是長江流域洞庭湖水系沅江的上游，在貴州省境內長459 km，流域面積17 157 km2，是貴州省境內第二大河流，其干流在貴州境內由上至下以黃平縣重安江匯口和錦屏六洞河匯口為界劃分為上、中和下游。20世紀末，伍律[7]、王大忠等[8]、辜永河和黎道洪[9]等先后對清水江魚類資源狀況展開了調查，進入21世紀，代應貴和陳毅峰[10-11]采取實地調查與文獻查閱相結合的方法調查表明清水江共有魚類86種(亞種)，其中有鱖(S.chuatsi)、大眼鱖(S.kneri)、斑鱖、波紋鱖(S.undulata)、暗鱖(S.obscura)、長體鱖(S.roulei)、中國少鱗鱖(C.whiteheadi)和漓江少鱗鱖(C.loona)等鱖類8種，斑鱖是清水江的優勢種，具有一定的漁業利用價值。因此，掌握清水江野生斑鱖的遺傳結構及多樣性水平，能夠為該流域野生斑鱖資源的可持續利用提供科學數據。

由于魚類線粒體具有DNA分子小、結構簡單、進化速度快、不同區域進化速度不同等特點，使其作為分子標記在魚類進化遺傳學、群體遺傳結構、分子生態學和保護生物學等研究領域中取得了很多有意義的成果[12]。其中細胞色素b(cytochromeb,Cytb)和線粒體控制區(control region displacement loop, D-Loop)變異速率快且存在差異，是檢測水生生物的遺傳多樣性和系統發育的常用分子手段[13-16]。因此，本研究基于mtDNA D-Loop區和Cytb基因測序技術，來探究清水江野生斑鱖群體的遺傳結構、遺傳多樣性和群體歷史動態，以期為斑鱖種質資源的保護和開發利用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

2015年3月至2017年11月在清水江干流設置了下司、凱里、旁海、柳川、錦屏和遠口6個站點，支流設置了臺盤、南哨、小江和大同4個站點。10個站點共采集野生斑鱖287尾(圖1，表1)。每尾魚測定其基礎生物數據后，取背部肌肉3～5 g用無水乙醇固定于離心管中，置于-80 ℃冰箱中保存待用。

表1 清水江野生斑鱖樣本信息

圖1 清水江野生斑鱖采樣點

1.2 DNA提取

采用(肌肉、血液、組織)基因組DNA提取試劑盒(北京天根)提取野生斑鱖基因組DNA。然后用微量紫外分光光度計檢測其濃度及吸光值，1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢驗其完整性，最后將成功提取的DNA置于-20 ℃保存備用。

1.3 PCR擴增及測序

野生斑鱖線粒體D-Loop控制區和Cytb基因的擴增引物參考LEE等[17]和CAO等[18]。引物均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。PCR體系為25 μL：模板DNA 2 μL；1×TaqPCR Master Mix 15 μL；正反引物各1 μL；其余用超純水補足。PCR反應條件為：94 ℃預變性3 min；35 個循環，每個循環包括94 ℃變性40 s，58.6 ℃(D-Loop)/49.6 ℃(基因Cytb)退火1min，72 ℃延伸50 s；最后72 ℃延伸7 min。兩者產物都在1%瓊脂糖凝膠電泳中檢測，以每個PCR產物2 μL為模板，用marker標記對擴增片段長度進行驗證。

把目標條帶清晰的產物送至生工生物(上海)股份有限公司進行純化和雙向測序，測序引物與擴增引物一致。

1.4 數據處理

利用DNAStar(DNAS-tar，Inc)軟件包中SeqMan、EditSeq程序對測序結果進行拼接，Cytb和D-Loop基因序列分別參考Genebank中的斑鱖序列(DQ648645和AP014527)手動校正，保留有效片段。采用Mega6.0軟件分別統計兩個基因區的堿基組成，基于Kimura 雙參數法(Kimura 2-parameter, K2p)模型計算群體內(genetic distance within populations)和群體間的遺傳距離(genetic distance among populations)，利用鄰接法(neighbor-joining，NJ)，Bootstrap 1 000次自舉檢驗構建單倍型間的系統發育樹。使用DnaSP5.0進行遺傳多樣性相關分析。使用Network10.2軟件以中介鄰接網絡算法(median-joining networks, MJ)分別按照兩個基因的單倍型比例繪制網絡圖。運用Arlequin3.5進行群體分子遺傳變異分析(analysis of molecular variance，AMOVA)和群體間遺傳分化指數(genetic differentiation,Fst)計算，并對種群進行中性檢驗及核苷酸不配對分析，判斷種群變動情況。利用式(1)[19]估算種群擴張時間，式(2)為基因流計算公式。

T=t×(代時數)；τ= 2ut

(1)

式(1)中：T為種群擴張時間，t為每個世代種群的擴張時間；其中,τ(Tau)為種群擴張參數，由Arlequin3.5計算得出；斑鱖的代時數取3；u=μk；k表示序列長度；μ為魚類 mtDNA 基因的變異速率, 按每百萬年2%[20]計。

Nm≈(1-Fst)/(4Fst)

(2)

式(2)中,Nm為基因流，Fst為遺傳分化系數。

2 結果與分析

2.1 清水江斑鱖群體mtDNA兩個基因的序列變異

287尾斑鱖樣品的D-Loop區序列有840 bp和841 bp兩種長度類型，序列中A、T、G和C 4種堿基的平均含量分別為34.0%、30.1%、15.8%和20.1%(表2)。A+T的含量(64.1%)明顯高于G+C(35.9%)的含量，呈堿基偏倚性。287條D-Loop區同源序列共定義了43種單倍型(表3)，有44個多態位點(表4)，其中單一多態位點5個，簡約信息位點39個，有3個堿基缺失，無堿基插入，堿基的轉換/顛換比值為10.19，上游河段群體(upper reaches of Qingshui River, UQ)(37)、中游河段群體(middle reaches of Qingshui River, MQ)(37)和下游河段群體(lower reaches of Qingshui River, LQ)(38)3個群體的變異位點數相差也基本持平(表4)。

表2 斑鱖群體線粒體D-Loop區和Cytb基因序列的堿基組成

Cytb基因序列長度為1 141 bp，序列中A、T、G和C 4種堿基的平均含量分別為24.3%、27.3%、15.5%和32.4%。A+T的含量(51.6%)略高于G+C(48.4%)的含量。287條Cytb同源序列共定義了25種單倍型(表3)，有23個多態位點(表4)，其中單一多態位點7個，簡約信息位點16個，無堿基的插入或缺失，堿基的轉換/顛換比值為4.60，UQ(15)、MQ(17)和LQ(15)3個群體的變異位點數相差不大(表4)。

3個群體單倍型數量及其分布情況見表3。D-Loop區的43個單倍型中，有一半以上(22個)為UQ、MQ和LQ 3個群體獨有，10個為其共享，11個為兩兩共享，hap1(18.81%)和hap2(17.07%)為3個群體共享的頻率最高單倍型，MQ的單倍型最多(28種)，LQ(23)和UQ(22)次之。Cytb基因的25個單倍型中，有一半以上(14個)為3個群體獨有，8個為其共享，3個為兩兩共享，共享的hap1頻率最高(36.93%)，其次是hap4(13.94%)和hap3(11.15%)，UQ、MQ和LQ 3個群體單倍型數相差不大。上、中和下游3個群體單倍型無地理分布格局。

表3 斑鱖3個群體線粒體基因的單倍型分布

2個基因的單倍型多樣性指數(Hd)和核苷酸多樣性指數(π)等遺傳多樣性參數統計結果見表4。斑鱖群體mtDNA D-Loop區的Hd、π和K分別為0.919、0.008 3和6.968；Cytb基因為0.821、0.002 0和2.311。上游、中游和下游3個群體的D-Loop區遺傳多樣性呈UQ > MQ> LQ遞減趨勢，而Cytb基因以MQ遺傳多樣性最高，大小順序為MQ>LQ >UQ。

2.2 清水江斑鱖群體線粒體DNA的遺傳結構

群體內和群體間的遺傳距離見表5。群體內，D-Loop區上游、中游和下游3個群體內遺傳距離從0.009 2±0.001 7遞減到0.007 4±0.001 5，其遺傳變異程度也逐漸變低；而Cytb基因以MQ的變異最高，UQ和LQ的變異程度相同。群體間，D-Loop區的UQ與MQ的遺傳差異最大，MQ與LQ的遺傳差異最??；而Cytb基因3個群體間和群體間的差異程度相近。

表5 斑鱖群體的遺傳距離

群體間的遺傳分化指數(Fst)和基因流(Nm)見表6，UQ和LQ之間的Fst明顯高于UQ-MQ和MQ-LQ，而Nm明顯低于后者。總的來說，基于Fst和Nm2個參數，清水江上游群體與下游的分化程度要高于其他2個河段群體間，這與地理距離遠近一致。

表6 斑鱖群體間的遺傳分化指數和基因流

基于AMOVA分析(表7)，結果顯示,斑鱖群體內的遺傳變異占97.32%(Cytb為97.54%)，而10個站點群體間的變異占2.95%(Cytb為2.47%)。這說明清水江野生斑鱖的遺傳變異主要來源于群體內個體間。

表7 斑鱖群體的分子方差

2.3 清水江斑鱖群體線粒體DNA單倍型的神經網絡圖和系統樹

基于MJ法，Cytb基因單倍型構建的神經網絡圖顯示(圖2-A)，hap1和hap4兩個中心單倍型間因3個節點(或單倍型缺失)而分為2個區域，它們分別進化出17個和6個單倍型，進化的單倍型呈星狀散射分布；D-Loop區的43個單倍型構建的神經網絡圖(圖2-B)未呈現出單一星狀散射分布，但以Hap1為中心進化出分支節點復雜、突變步驟長的42個單倍型。

圖2 斑鱖群體單倍型的神經網絡圖(A: Cytb；B: D-Loop)

總體來看，清水江斑鱖群體2個基因的單倍型缺乏明顯的地理分布格局。

以中國少鱗鱖為外群(Cytb: JN315581; D-Loop: KJ149811)，基于K2p模型構建的2個基因單倍型NJ進化樹見圖3和圖4,顯示Cytb和D-loop基因均聚為2支，樹枝上的單倍型沒有形成明顯的地理劃分，Cytb樹上顯示清水江斑鱖與長江流域的洞庭湖水系斑鱖具有較高親緣性。

圖3 斑鱖群體mtDNA Cytb基因單倍型的NJ進化樹

圖4 斑鱖群體mtDNA D-Loop區單倍型的NJ進化樹

2.4 清水江斑鱖的種群動態

鑒于上文，清水江野生斑鱖群體并沒有發生明顯的遺傳分化現象，所以從整體角度分析清水江斑鱖的群體動態。mtDNACytb和D-Loop區的Fu’sFs值見表4，其中Cytb呈顯著負值，檢測出了種群擴張，其核苷酸不配對分析圖呈現單峰(圖5)，進一步說明清水江斑鱖群體在近期發生過群體擴張。據公式推算出清水江斑鱖于0.176Ma年前發生了擴張，隨后處于相對穩定狀態。D-Loop區符合中性進化的假設，未檢測到種群擴張。

表4 斑鱖群體的遺傳多樣性和中性檢驗

3 討論

3.1 遺傳多樣性

遺傳多樣性是指群體之間以及群體內部的遺傳差異[21]，是物種進化和環境適應的基礎，遺傳多樣性水平較低可能會使該物種的資源衰退甚至瀕臨滅絕，而較高的遺傳多樣性能夠為該物種進化提供充足的潛力，以確保物種的延續[22]。清水江野生斑鱖群體mtDNA D-Loop區和Cytb基因的Hd和π分別為0.919/0.82 1和0.008 3/0.002 0。根據WAS和 BOWEN[23]制定的單倍型多樣性0.5和核苷酸多樣性0.005為界的分類標準，D-Loop區屬高Hd和高π，Cytb基因為高Hd和低π，依據mtDNA D-Loop區的高Hd高π遺傳多樣性特點，預示清水江斑鱖群體是一個大而穩定的種群，經過長時間演化積累了豐富的遺傳多樣性。

從整體來看，D-Loop區多樣性水平要明顯高于Cytb基因。2個基因在遺傳多樣性分析上的差異，與D-loop 區為非編碼序列、其進化速率比Cytb基因更快有關，因而在遺傳多樣分析上，其靈敏度高于Cytb基因[12]。但也存在控制區D-Loop變異速率低于Cytb的現象，比如在陳康等[22]對大獺蛤(Lutrariamaxima)的5個不同地理群體的遺傳多樣性研究中Cytb單倍型多樣性指數(0.834 5±0.030 3)大于D-Loop區(0.445 6±0.049 8)。從河段來看，3個群體的Cytb基因序列遺傳多樣性水平呈MQ> LQ>UQ的現象，而D-Loop區則呈UQ>MQ> LQ的趨勢，由于mtDNA 不同區域的進化速率不同，所以采用 mtDNA 不同區域分析得到的序列遺傳變異特征會存在差異[24]。

3.2 遺傳分化

清水江野生斑鱖群體內的遺傳距離為(0.007 4±0.001 5)～(0.009 2±0.001 7)(D-Loop)和(0.001 9±0.000 7)～(0.002 1±0.000 7)(Cytb)，群體間的遺傳距離為(0.007 4±0.001 5)～(0.008 6±0.001 6)(D-Loop)和(0.001 9±0.000 6)～(0.002 1±0.000 7)(Cytb)，群體內和群體間的遺傳距離十分接近，且遠低于2%的種間遺傳分化界限[25]，沒有發生明顯遺傳分化。AMOVA分析結果也得到同樣的結論，其遺傳變異絕大部分來源于群體內個體間，只有少量來源于群體間和河段間。其河段間的遺傳分化指數分別為Fst=0.001 15～0.009 07(Cytb)和Fst= 0.007 21～0.025 53(D-Loop)，處于0～0.05的無分化范圍內[26]，整條清水江的斑鱖存在較頻繁的基因交流。通常來說，魚類的遺傳分化和地理隔離有關[27]，人類修建的水利工程會使河流中的原物種的有效群體縮小和孤立，起到地理隔離的作用，從而影響其遺傳多樣性[28-29]。清水江3個群體的遺傳多樣性水平十分接近，可能是清水江干流中的梯級電站建成的時間沒有足夠長，對斑鱖種質資源的影響尚未顯現。但是相對而言，上游群體(UQ)和下游群體(LQ)之間的基因交流更少，出現這種現象的原因可能有以下兩點：一是上下游之間的地理距離遙遠；二是沅江的三座大型梯級電站三板溪、白市和掛治均位于下游，斑鱖無法自由向上游或者下游遷移，從而影響其遺傳分化[30]。此外，清水江上游主要是產優質杉木的林業區，而下游則主要為農業區[31]，下游人類活動更為頻繁，人為因素的影響使得中上游的斑鱖群體遺傳多樣性高于下游群體。

清水江是長江流域中洞庭湖水系的支流沅江的上游，從進化樹上看，Cytb基因顯示和長江上游的洞庭湖水系具有較高的親緣性，但其又單獨于洞庭湖中的野生斑鱖獨立成支，遺傳分化表現明顯。王偉偉等[32-33]利用線粒體Cytb基因和D-Loop區分析結果表明，我國不同地理斑鱖群體可以根據地理屏障劃分為南北兩個群體，CHU 等[34]則將我國斑鱖分為長江群和珠江群，而LIANG等[35]認為前者的研究樣本量太少，南北群體劃分和長江群珠江群的劃分都過于簡化，他的研究結果表明我國斑鱖存在兩大譜系，但不能簡單地按照地理屏障劃分，根據他的劃分，清水江斑鱖群體屬于長江譜系，但在長江譜系內部存在一定的分化。從Cytb基因和D-Loop區定義的單倍型的分布來看，清水江沒有形成明顯的地理劃分，這一點，在NJ系統進化樹和神經網絡圖上也有體現，但是其向不同譜系進化的趨勢較為明顯，其結果與李珊[36]的研究結論相同。

3.3 群體歷史動態

單倍型神經網絡圖可以用來簡單判斷某群體是否發生過種群擴張，如單倍型神經網絡圖呈單一星狀散射分布，說明該群體曾經在越到瓶頸后迅速擴增。更為準確的種群動態檢測方法通常有兩種：一種是基于無限位點模式(infinite-site model)的堿基不配對分析，當堿基不配對分布曲線呈明顯的單峰形時被認為群體歷史有擴張現象；第二種是Tajima’sD和Fu’sFs中性檢驗，二者呈負值且差異顯著的話則表明該群體有群體擴張史[37]，其中Tajima’sD檢驗是檢測早期的種群事件，而Fu’sFs檢驗則是對最近的種群事件更為敏感[38]。本研究中，斑鱖群體的mtDNACytb的單倍型神經網絡圖呈現以hap1和hap4為中心的兩個星狀輻射，顯示清水江斑鱖群體在歷史上曾發生過局部擴張；而且其Tajima’sD和Fu’sFs值均呈負值，但Tajima’sD不顯著，Cytb的Fu’sFs值呈顯著負值和核苷酸不配對分析圖呈單峰均表明了清水江斑鱖近期發生過種群擴張。D-Loop區則符合中性進化的假設，未檢測到種群擴張。據平均τ值估算，清水江斑鱖約在0.176百萬年前發生了擴張，這個時期屬于更新世中晚期，而更新世冰期與間冰期的更迭產生的氣候波動對許多動植物的遺傳多樣性和分布格局產生了影響[39]。

總的來說，清水江斑鱖群體遺傳多樣性高，雖向著不同譜系進化，但未形成明顯的地理分布格局，群體分化不明顯。綜合比較長江水系其他斑鱖群體，清水江斑鱖群體擁有較高的遺傳多樣性，可作為一個管理保護單位。近年來，沅江梯級電站的開發勢必對清水江生態環境造成巨大的影響，從而對斑鱖的種質資源形成潛在的威脅。因此，有必要對該地區的野生斑鱖資源進行保護，以期得到合理的開發利用。