鴨綠江口貝類(lèi)養(yǎng)殖區(qū)供餌力水平研究

付 杰，宋 倫，于旭光，宋廣軍，王 昆，劉 印，劉蘇萱

(1.遼寧省海洋水產(chǎn)科學(xué)研究院,遼寧省海洋生物資源與生態(tài)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,遼寧大連 116023; 2.大連海洋大學(xué),遼寧大連 116023)

遼寧丹東鴨綠江口海域是菲律賓蛤仔(Ruditapesphilippinarum)的主要增養(yǎng)殖區(qū)，2020年貝類(lèi)養(yǎng)殖面積為4.5萬(wàn)hm2，產(chǎn)量為24萬(wàn)t，占遼寧省菲律賓蛤仔總產(chǎn)量的20%、占全國(guó)的6%，對(duì)漁業(yè)碳匯貢獻(xiàn)較大[1-2]。但近兩年發(fā)現(xiàn)菲律賓蛤仔出現(xiàn)肥滿(mǎn)度降低、生長(zhǎng)周期延長(zhǎng)、種質(zhì)退化、病害增多和死亡率升高等現(xiàn)象，引起了養(yǎng)殖企業(yè)和科研工作者的關(guān)注[3]。初步分析，上述現(xiàn)象應(yīng)為內(nèi)因(種質(zhì)退化)和外因(生態(tài)演變)共同作用。有學(xué)者發(fā)現(xiàn)，濾食性貝類(lèi)對(duì)餌料微藻粒徑大小有攝食選擇性，而海洋微藻有小型化和甲藻化趨勢(shì)[4-6]。宋廣軍等[7]利用全粒級(jí)微藻生物量測(cè)算2012年鴨綠江口海域貝類(lèi)養(yǎng)殖容量為春季1 480 g·m-2、夏季320 g·m-2、秋季1 100 g·m-2。張雪等[8]利用大粒級(jí)微藻(粒徑>10μm)生物量測(cè)算2019年黃海北部菲律賓蛤仔養(yǎng)殖容量為春季100 g·m-2、夏季34 g·m-2、秋季63 g·m-2，修正的養(yǎng)殖容量明顯偏低，同時(shí)研究發(fā)現(xiàn)，黃海北部海域微藻粒級(jí)偏小，春、夏、秋季大粒級(jí)微藻生物量占比分別為(39±10)%、(35±14)%、(38±11)%。餌料微藻供應(yīng)能力春季最高，秋季次之，夏季最低。對(duì)于濾食性貝類(lèi)，餌料基礎(chǔ)中實(shí)際被利用的那一部分即是供餌力，其對(duì)揭示貝類(lèi)營(yíng)養(yǎng)能量及免疫水平至關(guān)重要。而有效餌料微藻(大粒級(jí)藻類(lèi))的比例、總量及存在周期可反映濾食性貝類(lèi)增養(yǎng)殖區(qū)的供餌力水平。

過(guò)往研究微藻粒級(jí)結(jié)構(gòu)主要利用葉綠素a分級(jí)法對(duì)微藻生物量進(jìn)行粗略區(qū)分[9-12]，由于大孔徑濾膜截留率較高導(dǎo)致小粒級(jí)微藻的貢獻(xiàn)被嚴(yán)重低估，而高估了大粒級(jí)微藻(粒徑>10μm)即有效餌料的貢獻(xiàn)，進(jìn)而會(huì)使研究區(qū)內(nèi)的貝類(lèi)養(yǎng)殖容量被高估。隨著高通量測(cè)序-分子鑒定技術(shù)的發(fā)展，通過(guò)真核微藻分子鑒定獲取的序列數(shù)可極大提高小粒級(jí)微藻的檢出率，用于微藻全粒級(jí)結(jié)構(gòu)的統(tǒng)計(jì)分析，可客觀(guān)表征有效餌料微藻生物量大小。本文采用該技術(shù)對(duì)鴨綠江口海域16個(gè)站位的微藻粒級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行了逐月研究，采用反距離權(quán)重插值模型進(jìn)行了餌料微藻供餌力分布圖繪制，同時(shí)測(cè)算了該海域貝類(lèi)養(yǎng)殖容量，以期對(duì)鴨綠江口菲律賓蛤仔可持續(xù)健康增養(yǎng)殖提供技術(shù)指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 研究海域與采樣站位

2020年，在丹東東港鴨綠江口海域垂岸布設(shè)16個(gè)站位(圖1)，于3—12月每個(gè)月采集1次海水過(guò)濾樣品，鑒定真核微藻種類(lèi)、檢測(cè)葉綠素a含量。每個(gè)站位采集表層海水1 L，首先現(xiàn)場(chǎng)用200 μm篩絹過(guò)濾去除大型浮游生物，然后用0.22 μm微孔濾膜收集全部微藻，最后將濾膜轉(zhuǎn)移至1.5 mL無(wú)菌離心管中，置于-80 ℃冷凍保存、運(yùn)輸，用于真核微藻分子鑒定，同期進(jìn)行葉綠素a指標(biāo)監(jiān)測(cè)。調(diào)查、檢測(cè)和質(zhì)量控制方法均參照《海洋調(diào)查規(guī)范》(GB/T 12763—2007)[13]和《海洋監(jiān)測(cè)規(guī)范》(GB 17378—2007)[14]執(zhí)行。

圖1 采樣站位示意

1.2 分析方法

1.2.1 餌料微藻分子鑒定

提取濾膜上真核微藻宏基因組18S rDNA，檢測(cè)18S rDNA濃度及純度，提取采用CTAB法(十六烷基三甲基溴化銨)，利用SEQ ID NO.1～2所述的核苷酸序列分別作為上游引物和下游引物，以提取的18S rDNA為模板，進(jìn)行可變區(qū)V4的PCR(聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng))擴(kuò)增，對(duì)于PCR擴(kuò)增引物，構(gòu)建DNA文庫(kù)，對(duì)于構(gòu)建的文庫(kù)，使用Hiseq2500 PE250模式進(jìn)行上機(jī)測(cè)序，測(cè)序得到的原始數(shù)據(jù)經(jīng)拼接、截取、過(guò)濾，得到可操作分類(lèi)單元(operational taxonomic units,OTUs)，使用 Uparse 軟件(http://drive5.com/uparse/)對(duì)有效數(shù)據(jù)進(jìn)行聚類(lèi)和物種分類(lèi)，采用樸素貝葉斯分類(lèi)方法與數(shù)據(jù)庫(kù)(https://www.arb-silva.de/,Version 108)對(duì)OTUs代表序列進(jìn)行物種注釋[15]，最終得到微藻注釋信息[2]。

1.2.2 數(shù)據(jù)分析

由于不同真核生物中rDNA的拷貝數(shù)差異較大，因此rDNA擴(kuò)增子測(cè)序所獲的序列數(shù)并不能表征環(huán)境樣本中真核微藻的豐度[16-17]，但相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，rDNA序列多態(tài)性與細(xì)胞中rDNA的拷貝數(shù)成正比，而真核微藻細(xì)胞體積與rDNA的拷貝數(shù)成正比，因此，真核微藻分子鑒定獲取的序列數(shù)可表征其生物量大小，用于微藻全粒級(jí)結(jié)構(gòu)研究是可行的[16-18]。將16個(gè)站位所獲得的優(yōu)勢(shì)度超過(guò)0.1%的種類(lèi)均作為整體優(yōu)勢(shì)種參與粒級(jí)生物量比例統(tǒng)計(jì)，參照相關(guān)文獻(xiàn)將篩查出的優(yōu)勢(shì)種粒徑按微微型(<3 μm)、微型(3～20 μm)、小型(>20 μm)進(jìn)行篩檢分級(jí)[16-22]，研究微藻粒級(jí)結(jié)構(gòu)，同時(shí)由于大部分濾食性貝類(lèi)對(duì)10 μm以上餌料微藻截留效率較高[6]，為研究微藻對(duì)貝類(lèi)的供餌能力，再將優(yōu)勢(shì)種按粒徑大小劃分為2組，即大粒級(jí)(>10 μm)和小粒級(jí)(<10 μm)。根據(jù)各粒徑真核微藻序列數(shù)占比統(tǒng)計(jì)其粒級(jí)組成結(jié)構(gòu)，同時(shí)利用其序列數(shù)占比和總?cè)~綠素a含量測(cè)算某種粒級(jí)微藻的葉綠素a含量，計(jì)算公式[8]：

(1)

式(1)中，DBi為某粒徑微藻的葉綠素a濃度，單位：μg·L-1；NBi為總?cè)~綠素a濃度，單位：μg·L-1；DC為某粒徑微藻的序列數(shù)；NC為所有微藻的序列數(shù)。

物種生物量?jī)?yōu)勢(shì)度(Y)表示微藻群落中某一物種質(zhì)量所占的優(yōu)勢(shì)程度[4]：

(2)

式(2)中，ni為第i種微藻種類(lèi)的OTUs數(shù)，N為OTUs總數(shù)，fi為第i種微藻種類(lèi)在各樣品中出現(xiàn)的頻率。

由于菲律賓蛤仔對(duì)大粒級(jí)餌料微藻攝食效率較高，根據(jù)供餌力含義，即有效餌料微藻供應(yīng)能力，本文供餌力指數(shù)(Ai)專(zhuān)指大粒級(jí)微藻生物量與其占比乘積[8]：

Ai=Bi·Ci%

(3)

式(3)中，Bi為第i站位大粒級(jí)微藻生物量，Ci%為第i站位大粒級(jí)微藻占比。

根據(jù)PARSONS-TAKAHASHII營(yíng)養(yǎng)動(dòng)態(tài)模型對(duì)東港鴨綠江口海域菲律賓蛤仔養(yǎng)殖容量進(jìn)行估算，利用海域初級(jí)生產(chǎn)者微藻的生產(chǎn)量和生態(tài)效率，估算菲律賓蛤仔的現(xiàn)存生物量[23]。

Q=(BEn)·k

(4)

式(4)中，Q為貝類(lèi)的生物量；B為微藻的生物量；E為生態(tài)效率；n為貝類(lèi)營(yíng)養(yǎng)階層；k為貝類(lèi)帶殼鮮質(zhì)量與軟組織鮮質(zhì)量比值。

1.2.3 插值方法

鴨綠江口海域月際及平均供餌力分布圖采用反距離權(quán)重(inverse distance weight,IDW)模型進(jìn)行空間插值，即以16個(gè)站位供餌力指數(shù)的測(cè)算值推算未測(cè)海域供餌力指數(shù)，不同站位的供餌力指數(shù)對(duì)距它不同遠(yuǎn)近的點(diǎn)影響大小不同，距離越近影響越大。而且IDW插值計(jì)算有高效、便捷等諸多優(yōu)點(diǎn)，常被用于生態(tài)環(huán)境評(píng)價(jià)中。供餌力指數(shù)插值計(jì)算結(jié)果僅跟周邊監(jiān)測(cè)點(diǎn)的樣本數(shù)據(jù)有關(guān)，插值過(guò)程中，還要顧及采樣數(shù)據(jù)的空間異質(zhì)性。計(jì)算模型如下：

(5)

式(5)中，Z(x)為插值結(jié)果，待插值點(diǎn)的屬性值；zi為監(jiān)測(cè)站位供餌力指數(shù)；Di為監(jiān)測(cè)站位與待插值點(diǎn)之間的歐氏距離；n為冪指數(shù)；m為參與插值運(yùn)算的監(jiān)測(cè)站位數(shù)。

對(duì)上述公式計(jì)算、數(shù)據(jù)分析、分布圖均通過(guò)WPS Office、SPSS 22.0、ArcGIS軟件完成。

2 結(jié)果與分析

2.1 微藻粒級(jí)結(jié)構(gòu)

為了解鴨綠江口海域微藻粒徑結(jié)構(gòu)分布規(guī)律，按照微藻粒級(jí)分級(jí)習(xí)慣，方便與之前和之后的研究結(jié)果進(jìn)行對(duì)比，對(duì)微藻粒徑按微微型、微型、小型進(jìn)行生物量占比分析(表1)，并用餅狀圖大小代表各站位微藻生物量(圖2)。微型微藻在春、夏季占優(yōu)勢(shì)，小型微藻在秋、冬季占優(yōu)勢(shì)，而微微型微藻只在春、夏季生物量較高，秋、冬季生物量極低。其中位于11號(hào)站位總生物量最多，微型微藻在各站位占比均較高。

圖2 鴨綠江口海域微藻粒級(jí)分布圖

表1 鴨綠江口各月份微藻粒級(jí)分布

2.2 貝類(lèi)供餌力分布

由于濾食性貝類(lèi)對(duì)大粒級(jí)微藻(>10 μm)利用率較高，通過(guò)對(duì)微藻粒徑重新劃分，發(fā)現(xiàn)大粒級(jí)微藻基本為微型微藻和小型微藻。鴨綠江口海域大粒級(jí)餌料微藻生物量春季占20%、夏季占29%、秋季占63%、冬季占56%，在秋、冬季占優(yōu)勢(shì)；小粒級(jí)微藻(<10 μm)生物量春季占80%、夏季占71%、秋季占37%、冬季占44%，在春、夏季占優(yōu)勢(shì)。每個(gè)月供餌力指數(shù)平均數(shù)的分布規(guī)律見(jiàn)圖3，根據(jù)數(shù)值分布供餌力指數(shù)可劃分3個(gè)級(jí)別，其中高供餌力組平均指數(shù)>6，中供餌力組平均指數(shù)在3～6，低供餌力組平均指數(shù)<3。春、秋季供餌力較高，分別在4月和10月形成2個(gè)高峰(圖4)。

圖3 鴨綠江口海域供餌力指數(shù)月際站位分布

圖4 鴨綠江口海域供餌力指數(shù)月際變化

鴨綠江口海域平均供餌力指數(shù)平面分布見(jiàn)圖5。各月份供餌力空間分布不盡相同，整體來(lái)看，鴨綠江口海域月際整體處于中供餌力水平，其中，10月供餌力最高，7月供餌力最低。

圖5 鴨綠江口海域平均供餌力指數(shù)分布圖

鴨綠江口海域供餌力指數(shù)與環(huán)境因子關(guān)聯(lián)性見(jiàn)圖6。在空間尺度上，鴨綠江口東側(cè)海域(1～6#站位)供餌力指數(shù)與葉綠素a、溶解氧、無(wú)機(jī)氮磷比正相關(guān)，與鹽度負(fù)相關(guān)；中部海域(7～10#站位)供餌力指數(shù)與葉綠素a、無(wú)機(jī)氮、硝酸鹽、總氮正相關(guān)，與鹽度負(fù)相關(guān)；西側(cè)海域(11～16#站位)供餌力指數(shù)與葉綠素a、無(wú)機(jī)氮磷比、無(wú)機(jī)氮、硝酸鹽、總氮正相關(guān)，與鹽度負(fù)相關(guān)?？傮w而言，空間尺度上，鴨綠江口海域供餌力指數(shù)與葉綠素a、無(wú)機(jī)氮磷比、無(wú)機(jī)氮、硝酸鹽、總氮正相關(guān)，與鹽度負(fù)相關(guān)(圖6-A)。

在時(shí)間序列上，各站位供餌力指數(shù)4、12月受環(huán)境因素影響最多，主要受總氮、總磷、COD、無(wú)機(jī)磷、硅酸鹽、硝酸鹽、亞硝酸鹽、無(wú)機(jī)氮、有機(jī)氮、葉綠素a正向影響，受pH、溶解氧、無(wú)機(jī)氮磷比負(fù)向影響(圖6-B)。

圖6 供餌力指數(shù)與環(huán)境因子關(guān)聯(lián)(*P≤0.05，**P≤0.01)

2.3 貝類(lèi)養(yǎng)殖容量估算

由于大部分濾食性貝類(lèi)對(duì)10 μm以上餌料微藻截留效率較高[6,24-25]，參照PARSONS-TAKAHASHII營(yíng)養(yǎng)動(dòng)態(tài)模型[11]，利用10 μm以上粒級(jí)微藻生物量估算菲律賓蛤仔養(yǎng)殖容量。圖7顯示，鴨綠江口海域月際實(shí)際可承載菲律賓蛤仔養(yǎng)殖容量為41～338 g·m-2，平均為195 g·m-2。其中，春季為248 g·m-2、夏季為117 g·m-2、秋季為262 g·m-2、冬季為67 g·m-2，貝類(lèi)養(yǎng)殖容量主要為春、秋季的貢獻(xiàn)。其中10月份最高，5月份次之。

圖7 基于大粒級(jí)微藻生物量估算的月際貝類(lèi)養(yǎng)殖容量

3 討論

宋倫等[26]研究發(fā)現(xiàn)，2019年黃海北部鴨綠江口臨近海域(靠近10號(hào)站位)春季(5月)微型微藻生物量占比最大，秋季(10月)小型微藻生物量占比最大，本研究結(jié)果與其一致。但2019年夏季(8月)微微型微藻生物量占比最大，2020年則為微型微藻占比最大，出現(xiàn)差異的原因是優(yōu)勢(shì)種發(fā)生改變，2019年夏季鴨綠江口臨近海域(靠近10號(hào)站位)第一優(yōu)勢(shì)種為青綠藻(Mamiellagilva)，第二優(yōu)勢(shì)種為劇毒卡羅藻(Karlodiniumveneficum)。LIU等[30]研究發(fā)現(xiàn)，鴨綠江口海域菲律賓蛤仔主動(dòng)選擇攝食微型微藻，避食微微型微藻，但秋、冬季對(duì)微微型微藻的選擇性指數(shù)相對(duì)春、夏季較高，對(duì)于微藻類(lèi)群，菲律賓蛤仔避食硅藻、金藻、隱藻，主動(dòng)選擇甲藻、綠藻。本研究區(qū)域劇毒卡羅藻(Karlodiniumveneficum)生物量較高，該種為微型甲藻，也是供餌力主要貢獻(xiàn)微藻，可能會(huì)影響貝類(lèi)衛(wèi)生質(zhì)量安全。劇毒卡羅藻是一種有毒甲藻，近年來(lái)在我國(guó)沿海海域已經(jīng)暴發(fā)過(guò)赤潮。營(yíng)養(yǎng)鹽作為微藻生長(zhǎng)的基礎(chǔ)，對(duì)鴨綠江口海域全年的優(yōu)勢(shì)種劇毒卡羅藻毒性也起調(diào)控作用，有研究發(fā)現(xiàn)，高濃度氮可刺激劇毒卡羅藻的毒性作用，隨著氮濃度的升高，毒力也逐漸增強(qiáng)[31-32]，本研究區(qū)域?yàn)榉坡少e蛤仔的主要增養(yǎng)殖區(qū)，養(yǎng)殖面積為4.5萬(wàn)hm2，年產(chǎn)量為24萬(wàn)t，占遼寧省菲律賓蛤仔總產(chǎn)量20%、占全國(guó)6%，貝類(lèi)衛(wèi)生質(zhì)量安全應(yīng)引起重視[33-35]。

利用葉綠素a分級(jí)法研究發(fā)現(xiàn)[27]，2016年夏季(8月)鴨綠江口鄰近海域微藻以大粒級(jí)(小型)為主(55%)，小粒級(jí)(微微型)次之(28%)，中粒級(jí)(微型)最少(17%)，本文高通量測(cè)序-分子鑒定分級(jí)法研究結(jié)果與其差異較大。葉綠素a分級(jí)法由于大孔徑濾膜截留率較高導(dǎo)致小粒級(jí)微藻的貢獻(xiàn)被嚴(yán)重低估，SONG等[28]利用分子鑒定微藻粒級(jí)分級(jí)法和葉綠素a分級(jí)法對(duì)比結(jié)果顯示，同一種微藻在分級(jí)濾膜上均有檢出，在不同濾膜上截留率不同，不同種類(lèi)在同一濾膜上截留率也有所差異，微微型浮游植物在20 μm和3 μm濾膜上的截留率均較高，在20 μm濾膜上最高截留86.2%，在3 μm濾膜上最高截留99.5%，分子鑒定分級(jí)法修正結(jié)果顯示，遼東灣四季微微型浮游植物占有絕對(duì)優(yōu)勢(shì)，其次是微型浮游植物，相反，粒徑較大的小型浮游植物總生物量貢獻(xiàn)率四季始終最低，葉綠素a分級(jí)法對(duì)微微型浮游植物的測(cè)算誤差春季最高達(dá)到(82±8)%。孫軍等[29]對(duì)顯微測(cè)量粒徑分析、葉綠素a分級(jí)、電子粒度分析儀這3種浮游植物粒級(jí)結(jié)構(gòu)研究方法進(jìn)行了分析比較，發(fā)現(xiàn)使用葉綠素a分級(jí)法、電子粒度分析儀法會(huì)低估小粒徑種類(lèi)，20 μm孔徑的篩絹對(duì)微型浮游植物的截留率高達(dá)85.63%，顯微測(cè)量粒徑分析修正后<20 μm的浮游植物(微微型+微型)組分占82.27%，分子鑒定技術(shù)極大的提高了小粒級(jí)微藻檢出率，為微藻粒級(jí)研究提供了新思路。

影響供餌力指數(shù)的正相關(guān)環(huán)境因子主要為氮、磷、硅等營(yíng)養(yǎng)元素，尤其是無(wú)機(jī)氮、磷影響更為顯著，而有機(jī)氮、磷影響相對(duì)較小，可能是無(wú)機(jī)氮、磷的輸入提高了大粒級(jí)微藻的占比和生物量[25-26]。當(dāng)然，微藻供餌力指數(shù)可能還受浮游動(dòng)物等上級(jí)食物網(wǎng)的下行控制影響[36]，今后需要應(yīng)加強(qiáng)關(guān)注。

本文對(duì)該海域菲律賓蛤仔養(yǎng)殖容量評(píng)估結(jié)果低于之前的測(cè)算結(jié)果進(jìn)行了評(píng)估[7]，主要是對(duì)用于評(píng)估的營(yíng)養(yǎng)動(dòng)態(tài)模型中微藻生物量參數(shù)進(jìn)行了優(yōu)化，篩選了可被貝類(lèi)利用的大粒級(jí)微藻生物量進(jìn)行測(cè)算，使得貝類(lèi)養(yǎng)殖容量測(cè)算結(jié)果偏低，但更加符合實(shí)際。另外，近些年也可能由于微藻粒級(jí)結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，粒級(jí)變小，導(dǎo)致實(shí)際的貝類(lèi)養(yǎng)殖容量降低，另外，各營(yíng)養(yǎng)級(jí)生物群落間相互影響等還需后續(xù)繼續(xù)研究[37-38]。