獸用化學藥品血藥濃度法生物等效性試驗技術指導原則簡述

李 丹，董義春，蘇富琴，徐 倩，楊大偉，劉艷華，汪 霞，梁先明

(中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所，北京 100081)

生物等效性(Bioequivalence，BE)指含有相同活性物質的兩種產品藥學等效或藥劑學可替代，在相同條件下以相同摩爾劑量給藥，活性成分的吸收程度和速度無顯著差異。生物等效性研究的臨床意義在于確定藥品的可處方性和藥品之間的可互換性。為科學規(guī)范獸用化學藥品生物等效性研究，保障獸藥安全、有效、質量可控，2009年農業(yè)部第1247號公告發(fā)布《獸藥化學藥品生物等效性試驗指導原則》[1]，EMA于2022年1月28日實施最新的獸藥生物等效性(血藥法)指導原則，為緊跟國際評審發(fā)展腳步，守住“研好藥、產好藥、用好藥”的關鍵一環(huán)，我中心緊緊把握指導原則的“科學性、前瞻性和可操作性”原則，結合國內獸藥研究現狀組織修訂發(fā)布《獸用化學藥品血藥濃度法生物等效性試驗技術指導原則》，并于2023年1月1日執(zhí)行。該指導原則主要修訂了生物等效判定標準、細化了生物樣品的定量分析方法驗證、增加了生物等效性試驗評審中常見問題(如半片給藥、嘔吐剔除等)的技術要求。另外，由于該指導原則僅適用于新獸藥注冊，因此參比制劑限定為原研制劑這一種情形。再者，該指導原則配套了試驗報告撰寫要求，對研發(fā)和評審的可參考性更強。該指導原則由概述、試驗設計、試驗報告及附錄四個部分組成，本文重點針對獸用化學藥品血藥濃度法生物等效性試驗的適用范圍、試驗設計涉及的分析方法、普通制劑的生物等效性評價、內服緩控釋制劑、復方制劑等內容進行簡單闡述，旨在加強研發(fā)單位或相關臨床試驗機構對此指導原則的理解，并對生物等效性試驗的有效開展提供指導和幫助。

1 適用范圍

本指導原則的適用范圍僅限于獸用化學藥品注冊，獸用中藥根據產品的具體情況可酌情參考本指導原則。本指導原則不包含難以取血的物種(如蜂、蠶)，血藥濃度無法代表作用部位藥物濃度的情形(如局部給藥發(fā)揮局部作用的制劑、乳房注入劑、子宮注入劑、靜脈特殊給藥系統(tǒng)靶位點釋放藥物)，微生物發(fā)酵產品，治療用蛋白或多肽，預混劑，藥效學終點的生物等效性試驗，臨床終點的生物等效性試驗。

下列產品可豁免血藥濃度法生物等效性試驗：靜脈、皮下或肌內注射給藥的水性溶液；內服溶液或其他溶解的劑型；內服不吸收的產品(如抗酸劑，透視介質)；揮發(fā)性吸入麻醉溶液。

2 試驗設計

2.1 分析方法 合適、可靠的分析方法是血藥濃度法生物等效性研究的關鍵。全血、血漿、血清等生物樣品具有取樣量少，藥物濃度低，內源性物質(如無機鹽、脂質、蛋白質、代謝物以及其他藥物)干擾多，個體差異大等特點。因此，必須根據被測物的結構、性質、濃度范圍和樣品介質等具體情況，建立適宜的生物樣品定量分析方法，并對方法進行驗證，相關要求參見配套發(fā)布的《生物樣本定量分析方法驗證指導原則》。方法驗證項目包括：選擇性、殘留、定量下限、標準曲線、準確度、精密度、稀釋可靠性、基質效應和穩(wěn)定性。在分析方法驗證后，應根據已驗證的分析方法處理試驗樣品、質控樣品和校正標樣，以保證分析批被接受。值得研發(fā)單位和相關臨床試驗機構特別注意的是，新版指導原則正式實施后對生物等效性試驗最主要的變化是明確了對分析批的具體要求。分析批的操作和處理是注冊申報資料中的重點審查內容，在此簡要闡述具體試驗過程中分析批的六個關注點：(1)一個分析批應該包括空白樣品和零濃度樣品，包括至少6個濃度水平的校正標樣，至少3個濃度水平質控樣品(低、中、高濃度雙重樣品，或至少試驗樣品總數的5%，兩者中取數目更多者)，以及被分析的試驗樣品。(2)所有樣品(校正標樣、質控和試驗樣品)應按照它們將被分析的順序，在同一樣品批中被處理和提取。一個分析批包括的樣品應在同一時間，由同一分析者使用相同的試劑相繼處理，保持條件的一致性，而且質控樣品應該分散到整個批中，以此保證整個分析批的準確度和精密度。同時，應該注意，對于生物等效性試驗，建議一個受試動物的全部樣品在同一分析批中分析，減少結果的變異。(3)在分析試驗計劃或標準操作規(guī)程中，應執(zhí)行下列接受標準：校正標樣測定回收濃度一般應在標示值的±15%范圍內，定量下限應在±20%范圍內，不少于6個校正標樣，至少75%標樣應符合這些標準。質控樣品的準確度值應該在標示值的±15%范圍內，至少67%質控樣品，且每一濃度水平至少50%樣品符合這一標準。另外，在同時測定幾個分析物的情況下，對每個分析物都要有一條標準曲線。如果一個分析批對于一個分析物可以接受，而對于另一個分析物不能接受，則接受的分析物數據可以被使用，對被拒絕的分析物應該重新提取和分析。如果使用多重校正標樣，其中僅一個定量下限或定量上限標樣不合格，則校正范圍不變。在此需要特別指出的是，所有接受的分析批，每個濃度質控樣品的平均準確度和精密度均應該列表，并在分析報告中給出。如果總平均準確度和精密度超過15%，則需要進行額外的考察，并說明該偏差的理由。(4)在試驗樣品分析開始前，如果已知或預期試驗樣品中的分析物濃度范圍窄，則推薦縮窄標準曲線范圍，調整質控樣品濃度，或者適當加入質控樣品新的濃度，以充分反映試驗樣品的濃度。如果看起來很多試驗樣品的分析物濃度高于定量上限，在可能的情況下，應該延伸標準曲線的范圍，加入額外濃度的質控樣品或改變其濃度，至少2個質控樣品濃度應該落在試驗樣品的濃度范圍內。如果標準曲線范圍被改變，則生物分析方法應被重新驗證(部分驗證)，以確認響應函數并保證準確度和精密度。(5)應該在試驗計劃或標準操作規(guī)程中預先確定重新分析試驗樣品的理由以及選擇報告值的標準，而且在試驗報告中應該提供重新分析的樣品數目以及所占樣品總數的比例。特別指出的是，給藥前樣品陽性結果或者由于藥動學原因進行重新分析的情況下，資料中應該提供重新分析樣品的身份、初始值、重新分析的理由、重新分析獲得值、最終接受值以及接受理由。在儀器故障的情況下，如果已經在方法驗證時證明了重新進樣的重現性和進樣器內穩(wěn)定性，則可以將已經處理的樣品重新進樣。但對于拒絕的分析批，則需要重新處理樣品。(6)在標準操作規(guī)程中應描述色譜的積分以及重新積分。任何對該標準操作規(guī)程的偏離都應在分析報告中討論。實驗室應該記錄色譜積分參數，在重新積分的情況下，記錄原始和最終的積分數據。

2.2 普通制劑的生物等效性評價

2.2.1 試驗設計 生物等效性研究一般按自身交叉對照的方法設計。首選2×2交叉設計，根據受試制劑的個數還可分別采用3×3交叉、4×4交叉或部分交叉等設計。其他設計，如序貫設計、四處理雙周期設計(受試制劑/受試制劑、參比制劑/參比制劑、受試制劑/參比制劑和參比制劑/受試制劑)或多周期設計在某些情形下也是合適的，但應根據藥物特點進行試驗設計。

2.2.2 試驗制劑 參比制劑和受試制劑含量的差別不能超過5%。應按產品標示的而不是檢驗的濃度或含量給藥，給藥量不得按檢驗的結果做校正。生物等效性數據及其衍生參數也不應按參比制劑和受試制劑含量的差別做校正。

2.2.3 動物 采用參比制劑標簽規(guī)定的靶動物。每種靶動物均需單獨進行生物等效性試驗。

2.2.4 給藥方案

2.2.4.1 單次/多次給藥 大多數情況，采用單次給藥。在下列情況下，可進行多次給藥的生物等效性研究：藥物作用取決于血中被測物的穩(wěn)態(tài)濃度，活性成分是非線性和/或時間依賴性動力學，生物利用度個體差異大，吸收程度相差不大但吸收速度相差大，單次給藥后被測物濃度過低、分析方法不能準確測得，治療指數小，吸收延長或推遲，吸收速度小于消除速度，控、緩釋制劑，分析方法的靈敏度不夠、不能定量測得峰濃度后3個消除半衰期以后的濃度等。

2.2.4.2 給藥劑量 一般，沒有證明線性動力學的受試制劑應采用參比制劑批準的劑量，劑量是標簽的標示量，而不是實測值，受試制劑和參比制劑的劑量應相同。若參比制劑同一靶動物中批準了多個給藥劑量，則應選用批準的最高劑量。如果能夠證明參比制劑在標簽標示范圍內藥動學特征(PK)呈線性，也可采用標簽低劑量。為達到有效的可測藥物濃度，安全指數大且PK呈線性的藥物，也可選用比批準劑量高2～3倍的劑量，但需提供劑量選擇支持數據和靶動物的耐受性數據。

2.2.4.3 給藥途徑 受試制劑和參比制劑應采用相同的給藥途徑和給藥部位。

2.2.4.4 飼喂和禁食 所有種屬動物，飼喂應符合動物福利。犬貓及非反芻動物用的內服普通制劑，應進行禁食的生物等效性試驗，除非參比制劑標簽中明確標示僅用于飼喂后動物。對要求與飼料一起給藥的獸藥，動物應先行飼喂。對飼喂可能影響吸收的獸藥，受試動物應禁食。對于某些藥物如腸溶制劑或內服緩釋制劑，由文獻或預試驗得知飼喂條件下藥物的生物利用度有較大變化時，必須同時在飼喂和禁食條件下證明生物等效性。

具有線性動力學產品，應選擇合適的給藥方案(劑量、給藥間隔時間、給藥次數)以獲得穩(wěn)態(tài)濃度。要測定連續(xù)的3個峰濃度(Cmax)或谷濃度(Ctrough)，或者通過在一個給藥間隔內收集大約10份樣品(包括剛好在下次給藥之前采集的樣品)以證明達穩(wěn)態(tài)。達穩(wěn)態(tài)后，應由末次給藥的藥-時曲線計算AUC和需關注的藥動學參數。對于受晝夜節(jié)律影響的藥物，應連續(xù)24 h取樣。

對于內源性物質，采樣方案應該能夠對每個受試動物在每個周期表征內源性基線。通常從2～3個給藥前樣品中測得基線。在其他情況下，可能需要給藥前1～2 d周期性采樣，以獲得時辰節(jié)律造成的內源性基線波動。

2.2.6 檢測物質 一般原則：母體化合物的Cmax通常對檢測產品間吸收速率的差異比代謝物的Cmax更敏感，因此，評價生物等效性應該基于母體化合物的濃度。

非活性前藥：即使是非活性前藥，也推薦證明母體化合物的生物等效性，不必測量活性代謝物。但是某些前藥可能血漿濃度很低，并且快速清除，導致難于證明母體化合物的生物等效性。在此情形下，可以接受用主要活性代謝物來證明生物等效性。

使用代謝物替代活性母體化合物：只有在例外情況下，才會考慮以一個代謝物代替活性母體化合物。當使用代謝物替代活性母體化合物時，申請人應提交任何可得到的數據，以支持代謝物的暴露能反映母體化合物吸收，且證明該代謝物的生成在治療劑量下不飽和。

對映異構體：一般可以接受使用非手性生物分析方法評價生物等效性。但是當滿足以下全部條件或未知時，則應該測定單一對映體：對映異構體的藥動學有差異；對映異構體的藥效學差異顯著；對映異構體的暴露(AUC)比值在不同吸收速率下發(fā)生變化。

如果一個對映體是藥理活性的，另一個是非活性的，或對活性的貢獻很小，則用活性對映體就足以證明生物等效性。

內源性物質：對于內源性藥物的生物等效性試驗，可以考慮超治療劑量給藥。

2.2.7 藥動學參數計算 一般用非房室數學模型分析方法來估算藥代動力學參數。在生物等效性研究中，其主要測量參數Cmax和tmax均以實測值表示。AUC0→t以梯形法計算，故受數據處理程序影響不大。

在測定單劑量給藥后的生物等效性試驗中，應當測定受試制劑和參比制劑的AUC0→t、AUC0→∞、Cmax和tmax等參數。

在穩(wěn)態(tài)下測定普通制劑生物等效性的試驗中，提供受試制劑和參比制劑的3次谷濃度數據(Ctrough)，達穩(wěn)態(tài)后的AUCτ、Cmax.ss、Ctrough、tmax.ss、DF 等參數。

2.2.8 等效判斷標準 在單劑量給藥測定生物等效性的試驗中，參比制劑和受試制劑Cmax和AUC幾何均值比的90%置信區(qū)間應該落在可接受范圍80.00%～120.00%(AUC未做對數轉換)或80.00%～125.00%(AUC做過對數轉換)范圍內。為了落在接受范圍內，下限舍入后保留兩位小數應≥80.00%，上限舍入后保留兩位小數應≤125.00%。

AUC0→t至少應覆蓋AUC0→∞的80%，如果覆蓋小于80%的受試動物超過總數的20%，則需要討論該試驗的有效性。

2.2.9 數據處理與統(tǒng)計分析

2.2.9.1 數據表達 BE研究必須提供所有個體濃度測定數據和藥代動力學參數，并提供匯總數據。如所有受試動物各個時間點受試制劑和參比制劑的藥物濃度測定數據、每一時間點的平均濃度(Mean)及其標準差(SD)，提供每個受試動物的濃度-時間曲線(C-T 曲線)、平均C-T 曲線以及C-T 曲線各個時間點的標準差。對于需進行統(tǒng)計分析的藥代動力學參數，應提交對受試制劑和參比制劑比值的點估計及90%置信區(qū)間。對于單次給藥研究，應報告每周期每只動物的AUC0→t占AUC0→∞的百分比。不能隨意剔除任何數據。脫落動物的數據一般不可用其他數據替代。

2.2.9.2 分析中數據剔除 應該盡量避免剔除數據，否則，可評價的受試動物數量會減少，剔除數據后試驗效力會下降。試驗方案中應有剔除標準，如內服制劑存在嘔吐風險，因嘔吐導致丟失的部分或全部給藥劑量，因此，試驗方案中預先設定與嘔吐有關的數據剔除標準。此外，試驗中可選擇在動物嘔吐后重復給藥，其標準也應在試驗方案中預先說明。對此的例外是，由于受試動物未按規(guī)定給藥，或者清洗期不夠，此時可以質疑該試驗的有效性。從統(tǒng)計分析中剔除的受試動物樣本仍然需要測定，并列出結果。

2.2.9.3 統(tǒng)計分析 評價生物等效性的最合適方法是雙單側t檢驗法和(1-2a)%置信區(qū)間法。該法可用于各參數如AUC、Cmax，包括做自然對數轉換或未做自然對數轉換的數據。

AUC是AUC0→t與AUCt→∞之和。AUCt→∞是最后一次采樣到無窮時間藥-時曲線下面積，按AUCt→∞=Ct/λz計算。

AUC0→t采用線性曲邊梯形法計算。如果采樣時間落在消除相，則需考慮用對數曲邊梯形法或其他方法。

AUC、Cmax和tmax一般用實測值而不用理論值。AUC和Cmax應經對數轉換后用多因素方差分析法(ANOVA)進行顯著性檢驗，然后再用雙單側t檢驗法和90%可信區(qū)間法判斷獸藥的生物等效性。

AUC0→τ是評價多次給藥生物等效性的主要參數，平均穩(wěn)態(tài)濃度(Css)是另一評價吸收程度的重要指標。

測定Cmax.ss和tmax.ss，還要測定藥物濃度在Cmax.ss和Cmin.ss之間的波動范圍(DF)，也可用于評價多次給藥的生物等效性，但要結合臨床做具體分析。

3 內服緩、控釋制劑

緩、控釋制劑改變了藥物釋放和吸收的過程，這些制劑的生物等效性試驗與普通制劑有所不同。一般要求同時進行單次給藥和多次給藥研究，必要時還應考慮飼喂的影響。

3.1 單次給藥 試驗設計基本同普通制劑。生物等效性評價標準同普通制劑。若以緩、控釋制劑為參比制劑，AUC、Cmax、tmax均符合生物等效性統(tǒng)計學要求的，可認定兩制劑于單次給藥條件下是生物等效的。若以普通制劑為參比制劑，AUC符合生物等效性的一般要求但Cmax明顯降低、tmax明顯延遲，則說明該制劑具有緩釋或控釋動力學特征。

3.2 多次給藥 等效性評價一般同緩、控釋制劑的單次給藥，但Ctrough是需要考慮的重要參數。當以普通制劑為參比制劑時，對于波動系數的評價，應結合緩、控釋制劑本身的特點做具體分析。

另外，對于不同的緩、控釋劑型，還應根據劑型的特殊性進行試驗設計，增加相應考察指標，以體現劑型的特點。

4 復方制劑

一個組分的體內行為不可能完全代表其它組分的體內行為，故原則上應證實每一個主要有效成分的生物等效性。試驗設計時應盡量兼顧各個成分的特點。

5 結 語

綜上所述，新修訂的《獸用化學藥品血藥濃度法生物等效性試驗技術指導原則》是在農業(yè)部公告第1247號發(fā)布的《獸用化學藥品生物等效性試驗指導原則》基礎上，結合國內外獸藥研究現狀修訂的，其基本原則與WHO[2-3]、VICH GL52[4]、FDA[5]、EMA[6]、CFDA[7]的相同，該指導原則的發(fā)布實施將為進一步規(guī)范我國獸藥生物等效性研究試驗提供技術指導，對獸藥行業(yè)水平的整體提升也將起到積極地促進作用。