基于響應面法優化黑參酸乳工藝研究

尹智彥，韓 梅，林紅梅，楊利民

（吉林農業大學中藥材學院，吉林 長春 130118）

功能性食品是指具有特定營養保健功能的食品，被譽為“21世紀食品”。酸奶作為一款發酵乳制品，因具有改善睡眠[1]、維護腸道菌群的生態平衡[2]等功效而受到消費者的青睞。黑參作為人參炮制品，經九蒸九曬工藝所得。轉變為黑參的生曬參，不僅表面色澤有所改變，其有效成分和藥理活性也發生了變化，形成特有皂苷。研究發現，黑參中的單體皂苷Rg5具有使乳腺癌細胞凋亡[3]和保護心功能的潛力[4]，并且Park等[5]就黑參對飲食誘導的肥胖小鼠非酒精性脂肪性肝病（NAFLD）的影響研究發現，黑參可能為預防NAFLD的一種潛在藥物。基于黑參特有的活性成分，以及保健品消費市場的擴大，黑參食品種類也有所增多。高雪峰等[6]以20%黑參濃縮液、30%桑椹濃縮液、10%黃精濃縮液和20%蜂蜜研制出一款新型黑參飲品，該產品不僅具有黑參與桑椹的混合香味，并且營養價值高，可作為一款日常飲品。郭勁廷等[7]以黑參和黑蒜為原料，研制了一款營養豐富且受大眾喜愛的天然抗疲勞飲料。本研究通過單因素試驗、Plackett-Burman（PB）試驗及Box-Benhnken（BBD）響應面試驗研制黑參酸乳，以期促進人參及其炮制品在食品領域的應用，同時將中草藥的有效成分與具有保健功能的酸奶相結合，為新型保健品的開發提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與設備

1.1.1 材料與試劑

黑參：選取根須完整的生曬參，參考喬雪[8]的黑參炮制工藝制得；菌粉：10菌型（由保加利亞乳桿菌、嗜熱鏈球菌、開菲爾菌、乳雙歧桿菌、長雙歧桿菌和嬰兒雙歧桿菌等加麥芽糊精混合組成），昆山佰生優生物科技有限公司；白砂糖、牛奶、礦泉水，均為市售。

石英砂、無水乙醇、氫氧化鈉、硫酸銅、硫酸鉀、濃硫酸、硼酸、鹽酸、乙酸鋅、亞鐵氰化鉀、冰乙酸、酒石酸鉀鈉、氯化鈉、甲醇、乙腈（色譜純），結晶紫中性紅膽鹽瓊脂、MRS培養基、MC培養基（海博生物）、改良MRS微生物檢測配套試劑，廣東環凱微生物科技有限公司。

1.1.2 儀器與設備

K9860型全自動凱氏定氮儀、DL-820E型智能超聲波清洗器，上海之信儀器有限公司；AUY220型電子天平，日本島津公司；GZX-9070 MBE型數顯鼓風干燥箱、HH-6型數顯恒溫水浴鍋、GI54DWS型高壓蒸汽滅菌鍋，廈門致微儀器有限公司；PharmaSpec UV-1700型可見分光光度計、1260 infinityⅡ型高效液相色譜儀，美國Agilent公司。

1.2 方法

1.2.1 工藝流程

純牛奶300 mL→預熱（60℃、3 min）→冷卻后加入混勻的白砂糖及黑參粉→均質（均質帶）充分混勻→滅菌（60℃，30 min）→冷卻→添加菌粉→恒溫發酵→后熟（4℃，12 h）→成品

1.2.2 單因素試驗設計

結合大量文獻與預試驗初步確定黑參酸乳的工藝基礎條件為：1.5 g黑參粉，1.0 g菌粉，24 g白砂糖，于39℃發酵6 h。在此基礎上選取不同黑參粉添加量（1.5、3.0、4.5、6.0、7.5、9.0 g）、菌粉添加量（0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 g）、白砂糖添加量（6、12、18、24、30、36 g）、發酵時間（4、6、8、10、12、14 h）及發酵溫度（35、37、39、41、43、45℃）進行單因素試驗，采用主成分分析法對酸乳脂肪、微生物和感官品質評分等9個生化指標進行綜合分析，從而確定各因素的適宜值。

1.2.3 Plackett-Burman試驗設計

將菌粉添加量、白砂糖添加量、黑參粉添加量、發酵時間和發酵溫度作為考察因素，感官品質評分作為響應值，進行Plackett-Burman試驗并設計高低2個水平，試驗因素水平參見表1。

表1 Plackett-Burman試驗因素水平表Table 1 Plackett-Burman test factors and levels table

1.2.4 響應面試驗設計

以單因素和PB試驗為基礎，將因素發酵溫度（A）、黑參粉添加量（B）和白砂糖添加量（C）作為自變量，感官評分（Y）作為因變量進行BBD試驗，因素水平見表2。

表2 BBD試驗因素水平表Table 2 BBD test factors and levels table

1.2.5 測定項目與方法

1.2.5.1 理化指標

脂肪含量：參照GB 5009.6—2016[9]中的方法測定；蔗糖含量：參照GB 5009.8—2016[10]中的方法測定；酸度：參照GB 5413.34—2010[11]中的方法測定；蛋白質含量：參照GB 5009.5—2016[12]中的方法測定；持水力：參考畢宇[13]的測定方法；非脂乳固體含量：參照GB 5413.39—2010[14]中的方法測定。

1.2.5.2 微生物指標

參照GB 4789.35—2016[15]中的方法測定。

1.2.5.3 人參皂苷

采用超聲提取-高效液相色譜法[16]測定。樣品前處理：精密稱取30 mL人參粉水溶液（7.2 g黑參粉加入300 mL水中）或人參酸乳置于錐形瓶中，加入30 mL甲醇，90 Hz超聲提取30 min，將上層清液過濾，重復3次，合并濾液，轉移至蒸發皿中，于60℃水浴蒸發，定容至5 mL棕色容量瓶，過0.22μm針孔濾膜，用于高效液相檢測，每個樣品重復3次。

1.2.6 感官品質評價

由10位同學組成感官評定小組，根據表3分別對黑參酸乳的色澤、組織狀態、滋味和氣味進行綜合評分。將酸乳從冰箱取出，靜置15 min后取適量置于透明杯中，于自然光下觀察其色澤和組織狀態，聞其味后用溫開水漱口品其味，并根據標準進行評分，結果取平均值。

表3 黑參酸奶感官品質評分標準Table 3 Sensory scoring criteria of black ginseng yoghurt

1.2.7 數據處理

應用IBM SPSS Statistics 25.0進行主成分分析，Design-Expert 8.0.6進行Plackett-Burman試驗和Box-Benhnken試驗的設計、分析，應用WPS Office繪制圖表。

2 結果與分析

2.1 單因素試驗結果

2.1.1 白砂糖添加量的篩選

主成分分析是利用降維的方式，在保證數據損失最少的前提下，將多個指標轉化為少數綜合指標的一種多變量數據的最佳綜合簡化的統計方法[17]。由表4可知，對不同白砂糖添加量酸乳的生化指標進行主成分分析后，前2個主成分的累積貢獻率達到89.97%，即能夠解釋89.97%的信息。其中主成分1的貢獻率為57.28%，特征值為5.16；主成分2的貢獻率為32.69%，特征值為2.94。在表4的基礎上根據綜合指標的隸屬函數值、權重求得各添加量的綜合評價值，綜合評價值（D值）越高產品品質越好，各單因素的適宜添加量均按此方法計算。根據圖1可知，確定36 g白砂糖為適宜添加量。

圖1 不同白砂糖添加量綜合評價值Fig.1 Comprehensive evaluation values of different white granulated sugar additions

2.1.2 菌粉添加量的篩選

由表5可知，主成分1和主成分2的貢獻率分別為51.03%、27.92%，特征值分別為4.59和2.51，其中主成分1所占比重較大，代表了脂肪、持水力、蔗糖、蛋白質、乳桿菌和感官評分。根據圖2綜合評價值的大小，將1.0 g菌粉確定為適宜添加量。

圖2 不同菌粉添加量的綜合評價值Fig.2 Comprehensive evaluation values of different bacterial powder additions

表5 不同菌粉添加量各綜合指標系數及貢獻率Table 5 Comprehensive indicator coefficients and contribution rates of different bacterial powder additions

2.1.3 發酵溫度的篩選

如表6所示，主成分1的貢獻率為48.19%，主成分2的貢獻率為34.21%，由二者可知不同發酵溫度對于蛋白質、持水力、嗜熱鏈球菌以及乳桿菌有較大的影響。根據圖3確定選擇39℃為適宜發酵溫度。

圖3 不同發酵溫度綜合評價值Fig.3 Comprehensive evaluation values of different fermentation temperatures

表6 不同發酵溫度各綜合指標系數及貢獻率Table 6 Comprehensive indicator coefficients and contribution rates of different fermentation temperatures

2.1.4 發酵時間的篩選

由表7可知，主成分1和主成分2的貢獻率分別為56.25%和21.83%，累積貢獻率達到78.08%。主成分1代表了酸度、持水力、蔗糖、嗜熱鏈球菌、雙歧桿菌、乳桿菌和感官評分。根據圖4的綜合評價值，將10 h確定為適宜發酵時間。

圖4 不同發酵時間綜合評價值Fig.4 Comprehensive evaluation values of different fermentation time

表7 不同發酵時間各綜合指標系數及貢獻率Table 7 Comprehensive indicator coefficients and contribution rates of different fermentation time

2.1.5 黑參粉添加量的篩選

如表8所示，主成分1、主成分2和主成分3的貢獻率分別為43.68%、24.81%和13.83%，其中主成分1和主成分2所占比重較大，可知不同黑參粉添加量對于酸度、乳桿菌、持水力、蛋白質和感官評分有較大影響。根據圖5確定適宜黑參粉添加量為7.5 g。

圖5 不同黑參粉添加量綜合評價值Fig.5 Comprehensive evaluation values of different black ginseng powder additions

表8 不同黑參粉添加量各綜合指標系數及貢獻率Table 8 Comprehensive indicator coefficients and contribution rates of different black ginseng powder additions

2.2 Plackett-Burman試驗結果

PB試驗設計及結果見表9，方差分析見表10。由表10可知，該模型的P＜0.05，達到顯著水平，表明該模型具有統計學意義。發酵溫度和黑參粉添加量的P值分別為0.019 3和0.020 8，表明該因素對酸乳品質影響顯著（P＜0.05）。根據P值進行顯著性排序：發酵溫度＞黑參粉添加量＞白砂糖添加量＞發酵時間＞菌粉添加量。結合單因素試驗結果及各因素的P值大小，綜合選擇發酵溫度、黑參粉添加量和白砂糖添加量進行響應面試驗。

表9 Plackett-Burman試驗設計及結果Table 9 Plackett-Burman test design and results

表10 Plackett-Burman試驗結果方差分析Table 10 Variance analysis of Plackett-Burman test results

2.3 響應面優化試驗結果

2.3.1 響應面試驗結果與分析

將因素A、B和C作為自變量，感官品質評分為因變量進行響應面試驗，試驗結果如表11所示。通過分析得出方程Y=86.30+1.99A-0.075B-0.24C-1.55AB-0.98AC+0.6BC-2.46A2-2.79B2-2.21C2。由表12可知，模型極顯著（P＜0.000 1），失擬項不顯著（P=0.149 5），表明模型誤差較小。模型R2=0.977 2，R2adj=0.947 9，表明模型擬合度較高，可以解釋94.79%響應值的變化，適用于黑參酸乳發酵工藝的優化。

表11 響應面試驗設計與結果Table 11 BBD test design and results

表12 響應面試驗結果方差分析Table 12 Variance analysis of BBD experiment results

2.3.2 各因素交互作用的響應面分析

響應面圖和等高線圖可進一步反映因素間交互作用對酸乳感官品質的影響。由圖6可知，響應曲面皆開口向下，表明試驗范圍內的感官品質評分呈現先增大后減小的趨勢，并且等高線圖基本呈橢圓形，表明因素A與B、A與C間的交互作用顯著，且等高線中心也位于考察區域中心，表明回歸方程具有極大值。

圖6 各因素交互作用對黑參酸乳感官品質影響的響應面和等高線圖Fig.6 Response surface and contour plots showing the interaction effects of different factors on the sensory qualities of black ginseng yogurt

2.3.3 最佳工藝驗證試驗結果

根據響應面試驗結果得到黑參酸乳的預測工藝條件及感官品質評分的預測值，即黑參粉7.24 g、白砂糖34.89 g，于39.99℃下發酵，酸乳的感官評分預測值為86.919 4分。結合實際情況，將條件調整為黑參粉7.2 g、白砂糖34.9 g、發酵溫度41℃，并進行3次驗證試驗，該工藝所得酸乳不僅口感細膩、酸甜適宜，且具有類似于咖啡的滋味和色澤。黑參酸乳的實際評分值與預測值相近，為86.5分，表明響應面結果具有較高的可信度及應用價值。

2.4 產品品質評價

將同條件下未添加參粉的酸乳作為對照（CK），與黑參酸乳進行品質對比。由表13可知，黑參酸乳的脂肪含量為3.89 g/100 g（＞3.1 g/100 g），蛋白質含量為3.23 g/100 g（＞2.9 g/100 g），蔗糖含量為10.50 g/100 g，非脂乳固體含量為9.33 g/100 g（＞8.1 g/100 g），酸度為92°T（＞70°T），相較于對照，黑參酸乳的營養成分有所增加，但增幅較小。綜上所述，黑參酸乳的理化指標不僅高于我國發酵乳食品安全標準，而且優于同等條件下的對照酸乳。可見，黑參酸乳的營養價值有所提高，并且黑參粉的添加賦予了酸乳額外的健康特性。

表13 黑參酸乳理化指標對比Table 13 Comparison of physicochemical indicators in black ginseng yogurt

益生菌為已確認功效因子，主要為乳酸菌類。由表14可知，黑參酸乳的嗜熱鏈球菌數、雙歧桿菌數和乳桿菌數分別為2.67×109CFU/mL、5.30×108CFU/mL和3.45×106CFU/mL，而對照酸乳的嗜熱鏈球菌數、雙歧桿菌數和乳桿菌數為9.40×108CFU/mL、3.30×108CFU/mL和1.15×106CFU/mL，黑參酸乳的益生菌數不僅達到國家標準且顯著高于標準量。相較于對照，黑參酸乳的含菌量均極顯著增加（P＜0.01），其中嗜熱鏈球菌數,相較對照增加了184.04%，與梁海艷[18]和王銀平[19]在人參酸奶的研究中得到的結果相同。黑參酸乳中益生菌的增加，可能是黑參含有的營養物質為益生菌的增殖提供了能量。

表14 黑參酸乳微生物數對比Table 14 Comparison of microbial numbers in black ginseng yogurt

2.5 酸乳皂苷含量

人參皂苷為人參主要藥效成分，具有抗抑郁、促進皮膚創傷組織修復等功效。如表15所示，黑參水溶液的皂苷種類包括Rf、Rd、Rb3、Rg3和Rh2，皂苷含量分別為0.08、0.89、0.66、2.81、0.10 mg/g。黑參酸乳中的皂苷種類包括Rf、Rb3、Rg3、Rh2和Rd，皂苷含量分別為0.03、0.39、2.50、0.07、0.95 mg/g。發酵前后的皂苷變化可能與益生菌中存在的某些酶類有關[20]。陳麗艷等[21]在人參豆豉發酵工藝以及人參皂苷的生物轉化研究中也發現微生物發酵可實現多種人參皂苷的體外轉化，轉化率達60%以上。

表15 皂苷含量對比Table 15 Comparison of ginsenoside contents 單位：mg·g-1

3 結論與討論

本研究以黑參為原料，通過添加白砂糖和菌粉經恒溫發酵得到一款黑參酸乳。在單因素試驗的基礎上，利用Plackett-Burman試驗和Box-Behnken試驗得到酸乳優化工藝為：黑參粉7.2 g，白砂糖34.9 g，菌粉1.0 g，發酵溫度41℃，發酵時間10 h。

本試驗將黑參與酸乳結合研制黑參酸乳，其各項生化指標均符合發酵乳國家標準，而且兼具中藥活性成分，增加了酸乳的營養保健價值，為人參及其制品的進一步開發利用提供了理論依據。根據《中華人民共和國食品安全法》和《新資源食品管理辦法》規定人參食用量為≤3 g/d，因此建議黑參酸乳的推薦食用量≤120 mL/d。孕婦、哺乳期婦女及14周歲以下的兒童不宜食用。