銀杏內酯B通過MMP9/STAT3信號通路對肺癌細胞A549增殖、遷移、侵襲和凋亡的影響

靳彩玲，趙樹鵬，姬穎華，王犖楠，楊軍，張清琴，牛紅蕊

（新鄉醫學院第一附屬醫院，河南 新鄉 453000）

肺癌是全世界最常見的惡性腫瘤，發病率和病死率高，每年約有180 萬新發病例，約有160 萬患者死于肺癌，占所有患癌癥死亡病例的19%［1］。根據組織學特征可將肺癌分為非小細胞肺癌和小細胞肺癌，非小細胞肺癌約占所有肺癌病例的80%，在診斷時，近70%的非小細胞肺癌患者已處于晚期，5年存活率極低［2］。手術、化療和放療是肺癌的主要治療策略，盡管近年來治療方式有了很大的進步，但大多數肺癌患者由于局部浸潤和遠處轉移，預后仍不理想。因此，迫切需要開發新的抗癌藥。

銀杏內酯B（ginkgolide B，GB）是提取自銀杏葉的銀杏二萜內酯類化合物，是迄今發現的最強的血小板活化因子拮抗劑，具有抗氧化、抗炎、抗腫瘤、抗休克和清除自由基等藥理作用，臨床上多用于治療血栓形成、急性胰腺炎和心血管疾病等［3?4］。已有研究表明，銀杏內酯B 可以對肺腺癌A549 細胞產生抗腫瘤細胞毒性作用［5］，但銀杏內酯B 對肺癌的具體作用機制仍不清楚。本文旨在探究銀杏內酯B 對肺癌細胞A549 惡性生物學行為的影響。

1 材料和方法

1.1 試驗藥物和主要試劑

銀杏內酯B（批號：110863-201611，中國食品藥品檢定研究院，化學式：C20H24O10，分子量：424.40，純度≥95.6%）；人非小細胞肺癌株A549（美國典型培養物保藏中心）；RRPMI 1640 培養基、胎牛血清（fetal bovine serum，FBS）、胰蛋白酶和青-鏈霉素（美國賽默飛世爾科技公司）；MTT 細胞增殖及細胞毒性檢測試劑盒（批號：C0009M）、Annexin V-FITC 細胞凋亡檢測試劑盒（批號：C1062L）、BCA 試劑盒（批號：P0012）、辣根過氧化物酶標記山羊抗兔IgG（批號：A0208）（上海碧云天生物技術研究所）；Transwell（批號：3450，美國Corning Costar 公司）；一抗Ki67（批號：ab15580）、PCNA（批號：ab18197）、Bax（批號：ab104156）、Bcl-2（批號：ab194583）、Caspase-3（批號：ab4051）、Cleaved Caspase-3（批號：ab2302）、MMP-9（批號：ab38898）、STAT3（批號：ab31370）、p-STAT3（批號：ab76315）和β-actin（批號：ab8227）（英國Abcam 公司）。

1.2 細胞培養

A549 細胞于37 ℃，5% CO2恒溫培養箱用高糖RMPI 1640 培養基（含10% FBS 和1%青-鏈霉素）培養，取對數生長期細胞用于實驗，0.25%胰蛋白酶消化。

1.3 細胞處理及分組

將A549 細胞隨機分為對照組、銀杏內酯B 低劑量組、銀杏內酯B 中劑量組和銀杏內酯B 高劑量組，共4 組，分別采用25、50、100 μmol/L 劑量的銀杏內酯B 處理銀杏內酯B 低、中、高劑量組的A549細胞。

1.4 MTT法檢測細胞增殖

取對數生長期的A549 細胞，接種于96 孔板（5 000 個/孔）培養24 h 后，按方法“1.3”項下分組處理后，每孔加入100 μL MTT溶液，孵育4 h后棄去MTT溶液，每孔加入100 μL 二甲基亞砜室溫避光振蕩10 min，于酶聯免疫檢測儀下測定各孔波長為570 nm處的吸收值。

1.5 Transwell法檢測細胞侵襲

Transwell上室加入無血清培養基稀釋的人工基底膜后，取轉染后的各組A549 細胞，上室中加入100 μL的細胞懸液，下室中加入600 μL 的含FBS 的RMPI 1640 培養液。培養24 h 后用脫脂棉花擦掉基質膠和上室細胞，4%多聚甲醛溶液固定20 min，0.1%結晶紫染色。于光學顯微鏡下計數并拍照，每個樣本隨機選取5個視野。

1.6 劃痕愈合實驗檢測細胞遷移情況

將細胞接種于6 孔板，按“1.3”項下的方法分組處理A549細胞后，當細胞長滿約80%時用中槍頭垂直于6 孔板水平劃線，PBS 緩沖液清洗3 次后，于培養箱中培養24 h后取樣拍照。

劃痕愈合率（%）=（0 h 劃痕寬度-24 h 劃痕寬度）/0 h劃痕寬度

1.7 流式細胞儀檢測細胞凋亡情況

取轉染后的各組A549 細胞接種于6 孔板，培養48 h 后，室溫下加入5 μL Annexin V FITC 混勻，最后加入碘化丙啶（propidium iodide，PI）10 μL 避光孵育15 min，流式細胞儀上機檢測。

1.8 Western Blot法檢測各項細胞因子水平

各組A549 細胞加入含蛋白酶抑制劑的細胞裂解液提取總蛋白，BCA 試劑盒檢測蛋白含量。10%SDS-PAGE凝膠電泳分離蛋白，200 mA恒流點轉移至PVDF 膜。加入一抗Ki67（1∶1 000）、PCNA（1∶1 000）、Bax（1∶1 000）、Bcl-2（1∶1 000）、Caspase-3（1∶1 000）、MMP-9（1∶1 000）、STAT3（1∶1 000）和p-STAT3（1∶1 000）4 ℃孵育過夜，TBST 緩沖液清洗后加入辣根過氧化物酶標記的IgG（1∶10 000），膜上滴加電化學發光顯影液顯色。ImageJ V 軟件分析各組A549 細胞目的蛋白與β-actin比值。

1.9 統計學分析

采用SPSS 20.0 統計軟件進行數據分析，計量資料以均數±標準差（±s）表示。多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用SNK-q檢驗。以P＜0.05代表差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 銀杏內酯B對A549細胞活力的影響

與對照組相比較，銀杏內酯B中、高劑量組細胞活力顯著降低（P＜0.05），說明銀杏內酯B 可以降低A549細胞活力。見表1。

表1 各組A549細胞活力的比較（±s）

表1 各組A549細胞活力的比較（±s）

注：與對照組比較，*P ＜0.05。

細胞活力（%）100.66±7.34 87.28±6.50 45.27±7.25*24.32±6.88*組別對照組銀杏內酯B低劑量組銀杏內酯B中劑量組銀杏內酯B高劑量組劑量（μmol/L）0 25 50 100

2.2 銀杏內酯B對A549細胞Ki67、PCNA蛋白表達水平的影響

與對照組相比較，銀杏內酯B 中、高劑量組Ki67、PCNA 蛋白水平顯著降低（P＜0.05），說明銀杏內酯B能夠下調A549 細胞Ki67、PCNA 蛋白表達水平。見圖1、表2。

表2 各組A549細胞Ki67、PCNA蛋白表達水平的比較（±s）

表2 各組A549細胞Ki67、PCNA蛋白表達水平的比較（±s）

注：與對照組比較，*P ＜0.05。

組別對照組銀杏內酯B低劑量組銀杏內酯B中劑量組銀杏內酯B高劑量組PCNA 0.42±0.04 0.32±0.02 0.07±0.01*0.03±0.01*劑量（μmol/L）0 25 50 100 Ki67 0.26±0.04 0.18±0.03 0.06±0.02*0.01±0.01*

圖1 各組A549細胞Ki67、PCNA蛋白表達水平的比較

2.3 銀杏內酯B對A549細胞侵襲情況的影響

與對照組相比較，銀杏內酯B中、高劑量組侵襲細胞數顯著降低（P＜0.05），說明銀杏內酯B能夠抑制細胞侵襲。見圖2、表3。

圖2 各組A549細胞侵襲細胞數比較（×200）

表3 各組A549細胞侵襲細胞數的比較（±s）

表3 各組A549細胞侵襲細胞數的比較（±s）

注：與對照組比較，*P ＜0.05。

侵襲細胞數122.50±11.22 108.78±14.25 37.24±11.22*11.76±8.16*組別對照組銀杏內酯B低劑量組銀杏內酯B中劑量組銀杏內酯B高劑量組劑量（μmol/L）0 25 50 100

2.4 銀杏內酯B對A549細胞遷移情況的影響

與對照組相比較，銀杏內酯B中、高劑量組劃痕愈合率顯著降低（P＜0.05），說明銀杏內酯B 能夠抑制A549細胞遷移。見圖3、表4。

圖3 各組A549細胞劃痕愈合情況比較（×200）

表4 各組A549細胞劃痕愈合率比較（±s）

表4 各組A549細胞劃痕愈合率比較（±s）

注：與對照組比較，*P ＜0.05。

劃痕愈合率（%）84.78±3.98 72.25±3.03 46.35±2.11*22.57±2.24*組別對照組銀杏內酯B低劑量組銀杏內酯B中劑量組銀杏內酯B高劑量組劑量（μmol/L）0 25 50 100

2.5 銀杏內酯B對A549細胞凋亡情況的影響

與對照組相比較，銀杏內酯B中、高劑量組細胞凋亡率顯著升高（P＜0.05），說明銀杏內酯B 能夠促進A549細胞凋亡。見圖4、表5。

表5 各組A549細胞的細胞凋亡率比較（±s）

表5 各組A549細胞的細胞凋亡率比較（±s）

注：與對照組比較，*P ＜0.05。

細胞凋亡率（%）5.78±1.98 12.36±3.64 22.23±6.94*38.77±5.11*組別對照組銀杏內酯B低劑量組銀杏內酯B中劑量組銀杏內酯B高劑量組劑量（μmol/L）0 25 50 100

圖4 各組A549細胞細胞凋亡情況比較

2.6 銀杏內酯B 對A549 細胞Bax/Bcl-2、Cleaved Caspase/Caspase-3比值的影響

與對照組相比較，銀杏內酯B 中、高劑量組的Bax/Bcl-2、Cleaved Caspase/Caspase-3 比值顯著升高（P＜0.05）。見圖5、表6。

表6 各組A549細胞Bax、Bcl-2、Caspase-3蛋白表達水平變化比較（±s）

表6 各組A549細胞Bax、Bcl-2、Caspase-3蛋白表達水平變化比較（±s）

注：與對照組比較，*P ＜0.05。

組別對照組銀杏內酯B低劑量組銀杏內酯B中劑量組銀杏內酯B高劑量組Cleaved Caspase/Caspase-3 0.48±0.04 0.60±0.08 1.12±0.10*1.68±0.15*劑量（μmol/L）0 25 50 100 Bax/Bcl-2 0.16±0.04 0.19±0.07 0.47±0.05*0.63±0.06*

圖5 各組A549細胞Bax、Bcl-2、Caspase-3蛋白表達水平比較

2.7 銀杏內酯B 對A549 細胞MMP-9 蛋白水平和p-STAT3/STAT3比值的影響

與對照組相比較，銀杏內酯B 中劑量組和銀杏內酯B 高劑量組MMP-9 蛋白表達水平、p-STAT3/STAT3 比值顯著降低（P＜0. 05）。見圖6、表7。

圖6 各組A549細胞MMP-9、STAT3、p-STAT3蛋白表達水平比較

表7 各組A549細胞MMP-9、STAT3、p-STAT3蛋白表達水平變化比較（±s）

表7 各組A549細胞MMP-9、STAT3、p-STAT3蛋白表達水平變化比較（±s）

注：與對照組比較，*P ＜0.05。

組別對照組銀杏內酯B低劑量組銀杏內酯B中劑量組銀杏內酯B高劑量組p-STAT3/STAT3 1 0.83±0.06 0.51±0.09*0.43±0.08*劑量（μmol/L）0 25 50 100 MMP-9 1 0.96±0.04 0.67±0.05*0.44±0.05*

3 討論

由于西醫治療肺癌的預后較差，許多患者選擇通過替代療法來提高治療效果、減少不良反應和改善生活質量。運用中藥及其提取物治療已經成為肺癌的一種流行替代療法，尤其是在治療晚期非小細胞肺癌的老年患者中［6］。

癌細胞的過度增殖是腫瘤發生與發展的重要因素之一。PCNA和Ki67是與細胞增殖相關的核抗原，近年來被廣泛應用于檢測細胞增殖，PCNA為DNA聚合酶輔助蛋白，與細胞增殖密切相關［7?8］。JIANG 等［9］研究發現，銀杏內酯B可通過抑制細胞增殖增加耐藥卵巢癌細胞對順鉑的敏感性。本文研究發現，經銀杏內酯B處理后，A549細胞的細胞活力和Ki67、PCNA蛋白表達水平降低。提示銀杏內酯B可抑制A549細胞增殖。

腫瘤細胞的侵襲及遷移能力是直接決定惡性腫瘤是否發生轉移的關鍵因素，肺癌細胞多呈侵襲性生長，這是肺癌轉移和復發的主要原因。研究發現銀杏內酯B 可通過上調miR-223-3p 表達抑制膀胱癌細胞的侵襲和遷移。本文研究發現，銀杏內酯B 具有減少A549 細胞侵襲細胞數和降低劃痕愈合率的作用。提示銀杏內酯B能夠抑制A549細胞侵襲和遷移。

細胞凋亡屬于程序性細胞死亡，可通過消除舊的及受損的細胞維持生物機體內生理平衡。Caspase-3屬于凋亡蛋白，抑制Caspase-3 蛋白活性可阻斷凋亡途徑，起到抑制凋亡的作用［10］。與細胞凋亡相關的基因Bax 升高能夠誘導細胞凋亡，Bcl?2 則能抑制細胞凋亡，Bax/Bcl-2 的比值能反應細胞凋亡狀況［11］。楊彬等［12］研究發現，銀杏內酯B 可能通過抑制Mfn1 的表達，調節促凋亡蛋白Bax 活性，降低抗凋亡蛋白Bcl-2 的表達，促進結直腸癌細胞的凋亡。CHAN 等［13］研究發現銀杏內酯B 可誘導乳腺癌細胞MCF-7 凋亡。本文研究發現，經銀杏內酯B 處理后，A549 細胞細胞凋亡率和Bax/Bcl-2、Cleaved Caspase/Caspase-3比值升高。提示銀杏內酯B能夠促進A549細胞凋亡。

基質金屬蛋白酶-9（matrix metalloproteinase-9，MMP-9）與腫瘤血管生成和侵襲轉移能力有關，相關研究表明MMP-9過表達會促進各種癌細胞包括肺癌細胞的轉移擴散，MMP-9 表達與肺癌惡性程度呈正相關［14］。STAT3 是一種致癌轉錄因子，其過度激活可導致肺癌細胞異常增殖和惡性轉移，并抑制細胞凋亡［15?16］。LI 等［17］研究發現中藥扶正抗癌方可通過STAT3/MMP-9 途徑抑制肺癌細胞的轉移。本文研究發現，銀杏內酯B 具有降低A549 細胞MMP-9 蛋白水平和p-STAT3/STAT3 比值的作用。提示銀杏內酯B可能通過MMP9/STAT3 通路調控肺癌細胞A549 惡性生物學行為。

綜上所述，銀杏內酯B 能夠抑制A549 細胞增殖、侵襲和遷移，并促進其細胞凋亡過程。本文為臨床應用銀杏內酯B治療肺癌提供了一定實驗依據。