涼血通瘀方對腦出血大鼠腸黏膜屏障修復及神經功能改善作用的研究

張子健，李建香，周雨，過偉峰

（1. 南京中醫藥大學附屬醫院，江蘇 南京 210029；2. 南京中醫藥學大學代謝病中醫研究重點實驗室，江蘇 南京 210023；3. 南京中醫藥大學附屬南京中醫院，江蘇 南京 210022）

長期以來，依靠甘露醇脫水降低顱內壓以及外科清除血腫等治療方法，并不能為腦出血（intracerebral hemorrhage，ICH）患者帶來令人滿意的預后，其高病死率和高致殘率的特點意味著ICH仍是困擾著醫患雙方的一大難題［1］。腦實質自發性出血導致的后果并不局限于腦組織的直接損傷，還包括其他器官和組織的繼發性損傷。普遍認為，腸道是重大應激后多種并發癥的起始部位，在受到諸如腦事件、器官移植、重大燒傷等嚴重損傷后，人體內環境劇烈變化，腸道應激性受創，腸黏膜結構完整性缺失，通透性增高，黏膜表面的病原體及有害物質透過腸黏膜屏障進入血液循環，進而誘發菌血癥、毒血癥，甚至出現全身炎癥反應和多器官功能障礙等一系列嚴重并發癥［2］。腸黏膜屏障（intestinal mucosal barrier，IMB）主要包括機械屏障、生物屏障、化學屏障以及免疫屏障，其中機械屏障被認為是最重要的部分，主要由腸黏膜上皮細胞以及細胞之間的緊密連接等構成，以此阻斷外來病原體的定植和入侵，維持腸黏膜的選擇通透性［3］。緊密連接蛋白主要包括閉合蛋白（Occludin）、密封蛋白（Claudin）和閉鎖連接蛋白（ZO），多項研究表明，緊密連接蛋白表達的上調會導致腸黏膜通透性降低［4］。當腸黏膜損傷時，緊密連接蛋白Occludin、Claudin-1 和ZO-1 表達水平下降，腸黏膜通透性增大，從而導致內毒素脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）易位，二胺氧化酶（diamine oxidase，DAO）、D-乳酸（D-lactic acid，DLA）等有害物質隨之進入血液循環［5-6］，其中外周血LPS水平升高是IMB 功能障礙的關鍵特征之一［7］，也是腸道通透性增加的間接指標［8］。

ICH 在中醫學中屬“出血性中風”范疇，急性期多以標實為主，常表現出風陽痰火郁閉之象。國醫大師周仲瑛認為，卒中（中風）急性期之風火相煽、痰瘀閉阻，究其根本，乃瘀熱為患，由瘀血同火熱搏結所致［9］，由此創制涼血通瘀方，以奏涼血散瘀、通腑泄熱之效。經前期觀察評價，本方臨床療效確切［10］，但其改善神經功能缺損的作用機制目前仍不明確。本實驗通過構建ICH 動物模型，研究涼血通瘀方對ICH 大鼠IMB 的組成結構、選擇通透性以及神經功能的影響，以期為ICH的中醫藥治療提供思路與方法。

1 材料

1.1 動物

SPF 級SD 大鼠，雄性，30 只，體質量（200 ± 20）g，由江蘇省青龍山動物繁育中心提供，許可證號：SCXK（蘇）2017-0001，飼養于南京中醫藥大學實驗動物中心，許可證號：SYXK（蘇）2018-0049。實驗方案由南京中醫藥大學實驗動物倫理委員會審核通過（審批號：201905A041）。

1.2 藥物

涼血通瘀方由大黃10 g，水牛角30 g，生地黃20 g，赤芍15 g，牡丹皮10 g，石菖蒲10 g 組成，中藥材由南京中醫藥大學附屬南京中醫院提供并代為煎制。10倍水浸泡2 h，水牛角先煎30 min后下入其他藥材煮沸，過濾后再次加水煮沸，合并2 次濾液，濃縮后藥液中生藥含量為1.15 g/mL。雙歧桿菌三聯活菌膠囊（上海上藥信誼藥廠有限公司，批號：S10950032）。1.3 主要試劑與儀器

異氟烷（深圳市瑞沃德生命科技有限公司，規格：100 mL）；Occludin、Claudin-1、ZO-1、脂多糖/內毒素LPS、二胺氧化酶DAO、D-乳酸酶聯免疫吸附測定（ELISA）檢測試劑盒（上海酶聯生物科技有限公司，批號分別為20200119Y6、20200120Z7、20200118S5、20200121F6、20200117W2和20190102C5）。

腦立體定位儀（深圳市瑞沃德生命科技有限公司，型號：68045）；小動物麻醉機（深圳市瑞沃德生命科技有限公司，型號：R540）；微型正反轉調速電磨（上海美耐特實業有限公司，型號：MNT-070400）；微量進樣器（上海高鴿工貿有限公司，規格：50 μL，尖頭）；實驗室微量單推注射泵（保定蘭格恒流泵有限公司，型號：TJ-1A）；電子精密天平（德國Sartorius 公司，型號：CPA1003P、CPA225D、CPA224S）；球磨儀（德國Retsch公司，型號：MM400）；多功能酶標儀（美國PerkinElmer公司，型號：EnSpire）。

2 方法

2.1 動物分組及處理

SD 大鼠適應性飼養1 周后，隨機分正常組、假手術組、模型組、涼血通瘀組和益生菌組。正常組大鼠繼續正常飼養；模型組、涼血通瘀組和益生菌組大鼠采用注射泵控制器注血/二次退針法［11］制備ICH 模型；假手術組大鼠空針留置于右側尾狀核，其余操作同模型組。造模完成后3 h，涼血通瘀組和益生菌組分別給予涼血通瘀方藥液（劑量為12 g/kg）和雙歧桿菌三聯活菌（劑量為175 mg/kg）灌胃，每天1次，連續3 d。給藥劑量按成人與大鼠體表面積換算，給藥體積均為1.0 mL/100 g，其余各組則分別給予等體積生理鹽水灌胃。

2.2 ICH大鼠模型制備方法

采用注射泵控制器注血/二次退針法［11］制備ICH模型。術前禁食；調整定位儀門齒鉤，使其低于耳間線2.4 mm；大鼠由異氟烷吸入麻醉后固定，備皮、消毒，沿頭正中線縱切，定位前囟點，向右旁開3 mm，冠狀縫前0.2 mm下6 mm即是右側尾狀核；電磨鉆通顱骨；于尾部縱切暴露動脈，微量進樣器抽取50 μL 動脈血后固定于注射泵上，沿鉆孔緩慢進針，以5 μL/min的速度向顱內注血，完成后留針10 min，退針2 mm 隨即再次留置5 min，結束后緩慢退出顱腔；骨蠟封閉鉆孔，縫合，消毒。按照Longa 五級評分法［12］，留取評分為1～3分的動物進行后續實驗。

2.3 行為學評分

依據Longa五級評分法，由2名研究人員進行評分后取平均值［13］。評分標準如下：無神經功能障礙計0分；對側前爪不能完全伸展計1分；輕搖尾巴，向對側轉圈計2分；向對側傾倒計3分；不能自發行走，有意識喪失計4分。

2.4 ELISA 法檢測腸組織中IMB 蛋白Occludin、Claudin-1、ZO-1的表達水平

切割腸組織標本，球磨儀勻漿，離心后取上清。按說明書操作，于酶標包被板中稀釋待測樣本，加入酶標試劑，孵育，洗滌，避光顯色，終止反應后于酶標儀450 nm波長測得各孔光密度值，計算樣品濃度。

2.5 ELISA法檢測血清LPS、DAO、DLA的含量

血液于室溫下自然凝固，離心后取上清。按說明書操作，步驟如前。

2.6 統計學方法

數據采用SPSS 25.0軟件分析；計量資料采用均數±標準差（±s）表示，多重比較，滿足正態分布及方差齊性的樣本采用LSD-單因素ANOVA 檢驗，不滿足則采用秩和檢驗，以P＜0.05表示差異具有統計學意義。

3 結果

3.1 各組大鼠行為學評分比較

正常組與假手術組大鼠行為學評分均為0，無神經功能障礙。與模型組比較，涼血通瘀組評分顯著降低（P＜0.01），益生菌組評分改變不明顯（P=0.070）；涼血通瘀組與益生菌組評分差異無統計學意義（P＞0.05）。見表1。

表1 各組大鼠行為學評分比較（±s，分）

表1 各組大鼠行為學評分比較（±s，分）

注：與模型組比較，##P ＜0.01。

組別正常組假手術組模型組涼血通瘀組益生菌組n55555 Longa五級評分00 1.90±0.42 1.00±0.35##1.40±0.42

3.2 各組大鼠IMB 蛋白Occludin、Claudin-1、ZO-1的表達水平比較

與正常組比較，模型組Occludin、Claudin-1、ZO-1蛋白的表達水平顯著降低（P＜0.01），涼血通瘀組和益生菌組Claudin-1、ZO-1 蛋白的表達水平明顯降低（P＜0.05）；與假手術組比，模型組Claudin-1、ZO-1蛋白的表達水平顯著降低（P＜0.01），涼血通瘀組ZO-1蛋白的表達水平明顯降低（P ＜0.05）；與模型組比較，涼血通瘀組Claudin-1、ZO-1 蛋白的表達水平明顯上升（P＜0.05），益生菌組Occludin、Claudin-1、ZO-1 蛋白的表達水平均顯著上升（P＜0.01）。由于Occludin 蛋白表達水平的檢測結果方差不齊，經秩和檢驗后，模型組與假手術組之間差異不顯（P=0.078），與涼血通瘀組之間差異也不明顯（P=0.078）。見表2。

表2 各組大鼠IMB蛋白Occludin、Claudin-1、ZO-1的表達水平比較（±s，ng/mL）

表2 各組大鼠IMB蛋白Occludin、Claudin-1、ZO-1的表達水平比較（±s，ng/mL）

注：與正常組比較，*P ＜0.05，**P ＜0.01；與假手術組比較，&P ＜0.05，&&P ＜0.01；與模型組比較，#P ＜0.05，##P ＜0.01。

ZO-1 148.49±13.59 144.19±16.84 92.68±16.29**&&116.01±18.87*|.90±13.61*##組別正常組假手術組模型組涼血通瘀組益生菌組n55555 Occludin 7.09±0.16 6.90±0.31 5.78±0.66**6.74±0.84 7.18±0.18##Claudin-1 1.09±0.05 1.00±0.16 0.71±0.10**&&0.90±0.11*#0.94±0.10*##

3.3 各組大鼠血清LPS、DAO、DLA的含量比較

與正常組比較，模型組、涼血通瘀組大鼠血清LPS、DAO、DLA 的含量均顯著上升（P＜0.01），益生菌組LPS、DLA 含量顯著上升（P＜0.01），DAO 含量明顯上升（P＜0.05）；與假手術組比較，模型組、涼血通瘀組血清LPS、DAO、DLA 的含量顯著上升（P＜0.01），益生菌組血清LPS 顯著上升（P＜0.01）；與模型組比較，涼血通瘀組與益生菌組血清LPS、DAO、DLA 的含量顯著降低（P＜0.01）；益生菌組血清DLA 水平顯著低于涼血通瘀組（P＜0.01）。見表3。

表3 各組大鼠血清LPS、DAO、DLA的含量比較（±s）

表3 各組大鼠血清LPS、DAO、DLA的含量比較（±s）

注：與正常組比較，*P ＜0.05，**P ＜0.01；與假手術組比較，&&P ＜0.01；與模型組比較，##P ＜0.01；與涼血通瘀組比較，$$P ＜0.01。

DLA（μmol/L）22.87±2.75 25.24±2.41 40.56±2.36**&&33.01±2.08**&&##28.05±2.49**##$$組別正常組假手術組模型組涼血通瘀組益生菌組n55555 LPS（EU/L）303.59±34.24 307.14±32.80 630.54±66.33**&&406.91±24.73**&&##437.00±46.56**&&##DAO（ng/mL）11.39±1.35 12.47±0.94 21.20±1.17**&&14.97±0.32**&&##13.43±1.81*##

4 討論

ICH 是臨床常見的腦血管病亞型，雖然其發病率較缺血性腦卒中低，但通常驟然發病且迅速進展，急性期致死率高達30%～40%，是急性腦血管意外中病死率最高的一種［14］。目前ICH 的治療方法較為單一，治療費用高昂但臨床療效卻不盡如人意，肢體偏癱等后遺癥亦是向患者家庭及社會施加的重擔，而中醫藥治療簡便驗廉的特點不應被忽視。“腦腸同病”是卒中陽明腑實證的重要特征，卒中后便秘的發生率達29%～76%，在出血性卒中患者中尤為常見［15］。運用通腑泄熱法治療卒中肇始于金元，以三化湯為代表，后世應用廣泛。周仲瑛教授集眾家所長，針對出血性卒中急性期瘀血與火熱搏結的特點創制涼血通瘀方，方以大黃、水牛角為君，大黃通腑瀉熱逐瘀，“上病下取，以下為清”，加之水牛角清熱涼血，兩藥相合重在涼血通瘀；生地黃為臣，以助君藥涼血清熱；佐以赤芍、牡丹皮，加強涼血活血散瘀之功；石菖蒲為使，開竅豁痰，引藥上行。通下瘀熱，順降氣血，給邪以出路，是本方的功效特點［16］。

腸黏膜結構的完整性是IMB 防御功能的保障，CHENG 等［17］的研究表明，ICH 的發生會造成腸黏膜組織結構改變、緊密連接蛋白表達水平降低、IMB功能障礙、通透性增高，以致血清腸源性內毒素水平上升。本實驗結果表明，涼血通瘀方與益生菌制劑均可有效提高IMB緊密連接蛋白Occludin、Claudin-1和ZO-1的表達水平（Occludin 蛋白表達檢測樣本間方差不齊，組內標準差較大，P= 0.078，考慮模型組與涼血通瘀組組間差異不顯是由操作誤差所致，結合相關文獻［2，17］，筆者認為該差異應具有顯著性），改善腸黏膜通透性，減少LPS、DAO及DLA等有害物質入血，從而達到減輕ICH 并發癥的目的，且益生菌制劑在恢復IMB 功能的效果上甚至強于涼血通瘀方。但行為學評分結果提示，涼血通瘀方可以明顯改善ICH 后神經功能缺損癥狀，益生菌制劑對此療效不顯（P= 0.070），而兩組間卻并不存在明顯差異（P= 0.138）。由于實驗中各組動物的數量較少，個體差異客觀存在，且行為學評分具有一定的主觀性，故益生菌組大鼠的行為學評分與模型組和涼血通瘀組之間是否存在顯著差異，筆者查閱相關文獻后做出如下討論。

血腦屏障（Blood brain barrier，BBB）的破壞是ICH發生后的一個普遍而重要的病理生理變化，可引起血管源性腦水腫，造成水腫區域大量神經元的死亡［18］。有研究報道，BBB 的破壞被認為是由LPS所誘導的［19］，LPS可與廣泛分布在小膠質細胞膜上的Toll樣受體-4（TLR4）結合，使小膠質細胞通過TLR4/MyD88 途徑激活，釋放炎性因子，進而導致腦損傷［20］。NING 等［21］研究表明，在LPS 處理后8 h 的小鼠腦組織中，促炎細胞因子TNF-α、TNF-β 和IL-1 細胞因子水平明顯升高。根據LUKIW［22］報道，胃腸道和神經生物屏障的通透性降低以及LPS 通過受損的胃腸道和BBB 轉運，在中樞神經系統炎癥中發揮著重要作用。據ZHAO 等［23］研究，在AD 動物模型的大腦新皮質和海馬提取物中發現了大量LPS 存在，而這些區域正是疾病過程中發生嚴重神經炎癥的靶區。上述證據表明，ICH 后BBB功能障礙，通透性增加，LPS 在加劇屏障結構破壞的同時還能夠穿透BBB，從而引發或加重腦損傷后的神經炎癥反應，對腦組織造成二次打擊。根據本課題組前期實驗結果［24］，涼血通瘀方能抑制TLR4 和NF-κB p65 蛋白的表達，減輕中樞神經系統炎癥反應。筆者據上述證據進一步推測，涼血通瘀方能夠明顯改善ICH 大鼠神經功能的原因主要在于其不僅能修復IMB緊密連接結構，阻擋LPS、DAO、DLA 等有害物質進入血液，還可以改善BBB受損所致的LPS的滲透，抑制炎癥反應對腦組織的進一步損害；與之比較，益生菌制劑的作用靶點主要在腸道，可以更為有效地恢復IMB 功能、抑制LPS等有害物質易位入血，間接發揮神經保護作用。因此，筆者認為，涼血通瘀方與益生菌制劑均可以改善ICH 后的神經功能缺損癥狀，但涼血通瘀方療效更為顯著，即益生菌組大鼠的行為學評分與模型組和涼血通瘀組之間均存在差異，而這有待于進一步實驗研究給予驗證。