黃芪甲苷抑制內質網應激及CHOP信號通道改善衣霉素誘導的系膜細胞凋亡*

王增四，高文，陳丹，陳菁，黃丹

(1.武漢市中西醫結合醫院腎病內科，武漢 430022；2.華中科技大學同濟醫學院附屬同濟醫院，武漢 430030)

糖尿病腎病是歐美發達國家終末期腎病(end stage renal disease，ESRD)發生的主要原因，也是我國慢性腎臟病(chronic kidney disease，CKD)的第二大病因，目前對糖尿病腎病的防治措施包括控制血糖和血壓、抑制RAS系統激活，而很大一部分患者最終仍將進入ESRD，因此，研發新的治療藥物顯得尤為重要。

內質網是真核細胞中重要的膜性結構細胞器，在脂類物質、蛋白質的合成和運輸過程中起核心作用，是調控炎癥反應、細胞凋亡的重要病理通路[1-3]。當錯誤蛋白質或未折疊蛋白質在腔內過度堆積、固醇和脂質代謝失調，導致嚴重或持久的未折疊蛋白反應(unfolded protein response，UPR)，將影響特定基因表達，如果內質網功能持續激活，最終啟動細胞凋亡程序，誘發糖尿病、腫瘤、神經退行性病變等疾病[4-7]。C/EBP同源蛋白(C/EBP homologous protein，CHOP)是UPR信號通道共同的下游信號分子，在正常生理狀態下低表達，而在內質網應激狀態下可大量表達，是內質網應激過程中關鍵的促凋亡因子[8-10]。系膜細胞過度凋亡是造成糖尿病腎病腎小球系膜細胞缺失、基質增多的重要原因[11-13]。在高濃度葡萄糖的刺激下，系膜細胞內CHOP及其下游信號分子Caspase-3被激活，進而啟動系膜細胞凋亡[14]。改善內質網折疊功能的伴侶分子可緩解內質網應激，從而延緩糖尿病腎病進展，這種效應依賴于其對CHOP蛋白活化的抑制，證實了CHOP誘導的系膜細胞凋亡在糖尿病腎病進展中的關鍵作用[15-17]。衣霉素可通過抑制UDP-N-乙酰氨基葡萄糖在真核細胞內質網的轉移，阻斷N-連接糖基化，破壞蛋白質的成熟，通過調控CHOP等相關基因表達促進細胞凋亡[18]。本課題組前期研究發現，黃芪的活性成分黃芪甲苷能改善鏈脲佐菌素誘導的糖尿病腎病大鼠蛋白尿，延緩腎功能惡化，并能抑制衣霉素誘導的足細胞凋亡，上述效應與黃芪甲苷抑制內質網應激的生物學活性有關[19-20]。鑒于對CHOP在內質網應激介導的系膜細胞凋亡作用的認識，結合前期對黃芪甲苷改善大鼠內質網應激緩解糖尿病腎病進展的工作基礎，筆者在本研究將觀察黃芪甲苷對衣霉素誘導的大鼠腎臟系膜細胞凋亡的影響，并檢測內質網應激及凋亡相關標志物的表達水平，旨在探討黃芪甲苷腎保護作用的潛在分子機制，并為黃芪甲苷在糖尿病腎病的治療應用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1實驗材料

1.1.1實驗藥物 黃芪甲苷(成都錦泰和醫藥化學技術有限公司，批號：150202，AS-IV，含量≥98%)，4-苯基丁酸(phenylbutyric acid，PBA，美國Sigma公司，批號：SML0309)，衣霉素(美國Sigma公司，批號：654380)。

1.1.2實驗試劑 Annexin V-FITC/PI 凋亡試劑盒(InvitrogenTM，批號：V13242)，磷酸化eIF2α、磷酸化IREα、GRP78、CHOP、Cleaved-caspase3、Bax和Bcl-2(美國Abcam公司，批號：ab48187，ab21685，ab179823，ab13847，ab182733，ab196495)，磷酸化蛋白激酶R樣內質網激酶(PERK)(美國CST公司，批號：3179S)，胎牛血清(FBS，美國Gibco公司，批號：1982185)， 碘化丙啶(上海生工生物工程股份有限公司，批號：批號: A601112)。

1.1.3儀器 流式細胞檢測儀、MiniPROTEAN 3 型Western 電泳儀、DJ2300 型凝膠成像分析儀(美國Bio-Rad)，酶標儀(美國ThermoFisher)，低溫離心機(美國Beckman)。

1.2系膜細胞培養和干預 大鼠腎小球系膜細胞HBZY-1購于中國醫學科學院基礎醫學研究所細胞資源中心，參照既往方法進行培養。接種于達爾伯克改良伊格爾培養基(Dulbecco's modified Eagle's medium，DMEM) 培養基(DMEM +10% FBS)，置于細胞培養箱(33 ℃，飽和濕度，5%CO2) 中培養。以內質網應激誘導劑衣霉素誘導HBZY-1細胞建立內質網應激細胞模型：當細胞長至達70%～80%融合后，用無血清DMEM培養液小心漂洗細胞，改用含2%FBS的DMEM培養基繼續培養(用含不同濃度黃芪甲苷或PBA預處理)14 h后，將衣霉素(5 μg·mL-1)小心加入培養基中，繼續培養4 h后，細胞模型誘導完成并用于檢測。具體干預措施如下：正常對照組予以2%FBS+DMEM培養基；模型對照組加入衣霉素5 μg·mL-1；黃芪甲苷小劑量組加入衣霉素5 μg·mL-1+黃芪甲苷50 μg·mL-1；黃芪甲苷大劑量組加入衣霉素5 μg·mL-1+黃芪甲苷100 μg·mL-1；苯丁酸組加入衣霉素5 μg·mL-1+苯丁酸10 mmol·L-1。

1.3流式細胞技術檢測系膜細胞凋亡 取經藥物干預后的各組系膜細胞，經0.25% 胰蛋白酶消化后，用磷酸鹽緩沖液(PBS )洗滌2 次，調整細胞密度為1×106·L-1，制成單細胞懸液，加入Binding 緩沖液100 μL和FITC 標記的Annexin-V(20 μg·mL-1)10 mL，室溫避光30 min，再加入50 μg·mL-1碘化丙啶5 μL，避光反應5 min后，加入Binding 緩沖液400 μL，立即用FACScan進行流式細胞術定量檢測，觀察細胞凋亡情況。

1.4蛋白印跡實驗 取各組系膜細胞，低溫充分勻漿后，加入蛋白裂解液及苯甲基磺酰氟(phenylmethylsulfonyl fluoride，PMSF)，冰上放置40 min，4 ℃下12 000 r·min-1(r=10 cm)離心10 min，取上清液提取總蛋白，以BCA方法對上清液進行蛋白定量。取蛋白樣品20 μg，10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE)電泳，100 V轉移1 h至硝酸纖維素薄膜，放入封閉液中37 ℃封閉1 h；加入一抗并4 ℃過夜；TBST漂洗后加入二抗室溫孵育1 h，TBST漂洗后顯色。以β-actin作為內參，以目的蛋白灰度值/內參灰度值反映蛋白的相對表達水平。

2 結果

2.1黃芪甲苷對大鼠系膜細胞凋亡的影響 流式細胞術檢測發現，模型對照組經衣霉素干預后，系膜細胞凋亡率較正常對照組明顯升高(P<0.05)，給予各濃度黃芪甲苷處理后，細胞凋亡率明顯下降，與模型對照組比較，差異有統計學意義(P<0.05)，而黃芪甲苷大劑量組與苯丁酸組比較，差異無統計學意義，見圖1。

A.正常對照組；B.模型對照組；C.黃芪甲苷小劑量組；D.黃芪甲苷大劑量組；E苯丁酸組；①與正常對照組比較，P<0.05；②與模型對照組比較，P<0.05。圖1 5組系膜細胞凋亡水平的比較A.normal control group；B.model control group；C.low-dose AS-IV group；D.high-dose AS-IV group；E.phenylbutyric acid group；①Compared with normal control group，P<0.05；②Compared with model control group，P<0.05．Fig.1 Comparison of apoptosis levels of mesangial cells in five groups

2.2黃芪甲苷對系膜細胞內質網應激相關信號通道的影響 與正常對照組比較，模型對照組系膜細胞內質網應激信號分子IRE1α、PERK和eIF2α磷酸化水平明顯升高，同時，內質網應激標志蛋白GRP78表達上調，提示細胞內質網應激增強。給予不同濃度黃芪甲苷干預后，IRE1α、PERK和eIF2α磷酸化水平明顯下降，GRP78表達下調，這種效應在黃芪甲苷大劑量組較顯著，差異有統計學意義(P<0.05)，見圖2。

A.正常對照組；B.模型對照組；C.黃芪甲苷小劑量組；D.黃芪甲苷大劑量組；E.苯丁酸組；①與正常對照組比較，P<0.05；②與模型對照組比較，P<0.05。圖2 5組系膜細胞內質網應激信號分子表達水平的比較A.normal control group；B.model control group；C.low-dose AS-IV group；D.high-dose AS-IV group；E.phenylbutyric acid group；①Compared with normal control group，P<0.05；②Compared with model control group，P<0.05.Fig.2 Comparison of the expression of endoplasmic reticulum stress signal molecules of mesangial cells in different

2.3黃芪甲苷對衣霉素誘導系膜細胞凋亡信號分子的影響 與正常對照組相比，模型對照組細胞CHOP的表達明顯增加，同時，Bax和Cleaved caspase-3的表達顯著上調，而Bcl-2表達無明顯變化。與模型對照組比較，黃芪甲苷小、大劑量組系膜細胞CHOP表達降低，且Bax和Cleaved caspase-3表達下調。見圖3。

A.正常對照組；B.模型對照組；C.黃芪甲苷小劑量組；D.黃芪甲苷大劑量組；E.苯丁酸組；①與正常對照組比較，P<0.05；②與模型對照組比較，P<0.05。圖3 5組系膜細胞凋亡相關信號分子表達水平的比較A.normal control group；B.model control group；C.low-dose AS-IV group；D.high-dose AS-IV group；E.phenylbutyric acid group；①Compared with normal control group，P<0.05；②Compared with model control group，P<0.05．Fig.3 Comparison of the expression of apoptosis related signal molecules of mesangial cells in different

3 討論

糖尿病腎病是糖尿病主要的微血管慢性并發癥，其病理改變以腎小球病變為主，早期表現為腎小球系膜細胞增生、系膜基質增加，到中晚期，硬化的腎小球內仍存在過多的系膜基質，但系膜細胞的數量呈耗竭狀態，而過度的細胞凋亡是腎小球系膜細胞缺失的重要原因[21-22]。CHOP是內質網應激誘導多種細胞產生凋亡的關鍵信號分子：過度表達CHOP能下調Bcl-2或使Bax轉移至線粒體膜而誘發凋亡[23]；CHOP也可與C/EBPα形成異源二聚體促進Bim蛋白表達而導致凋亡；在高濃度葡萄糖的刺激下，系膜細胞內CHOP及其下游信號分子Caspase-3被激活，從而啟動系膜細胞的凋亡，也證實CHOP誘導的系膜細胞凋亡在DN進展中的關鍵作用[24]。因此，阻斷CHOP介導的系膜細胞凋亡，從而逆轉內質網應激誘導的糖尿病腎病進展將是治療的潛在靶點。4-苯基丁酸是一種具有分子伴侶作用的脂肪酸，可通過穩定蛋白質構象、改善內質網折疊蛋白，從而發揮抗內質網應激的生物學效應。進一步的研究發現，4-苯基丁酸可逆轉糖尿病腎病、梗阻性腎病等疾病模型引起的腎臟纖維化，這種效應與其阻斷內質網應激，抑制CHOP介導的腎臟系膜細胞、小管間質細胞凋亡有關。 本實驗也觀察到，大鼠系膜細胞在衣霉素干預下內質網應激明顯增強，表現為IRE1α和PERK磷酸化水平升高，內質網應激伴侶分子GRP78上調，同時，調控細胞凋亡的CHOP及其下游促凋亡信號的活性明顯增高，導致系膜細胞凋亡率明顯增加，而給予內質網應激抑制劑4-苯基丁酸干預后系膜細胞內質網應激得到抑制，CHOP及其下游促凋亡信號明顯減弱，細胞凋亡率明顯下降。

研究表明，黃芪甲苷能抑制NF-κF活性，減少腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、MCP-1和ICAM-1表達，減少Ⅳ型膠原α1鏈在腎臟中的沉積，從而緩解糖尿病腎病大鼠的腎臟病變[25]。筆者前期的研究發現，黃芪甲苷能改善鏈脲佐菌素誘導的糖尿病腎病大鼠蛋白尿、緩解腎小球硬化，這種效應與其改善大鼠腎組織內質網應激有關，且這種效應不依賴于其對血糖的影響[19]。本實驗進一步證實，黃芪甲苷干預大鼠系膜細胞后，能有效逆轉衣霉素誘導的細胞內質網應激，同時，CHOP及下游的Bax和Cleaved caspase3表達下調，從而有效抑制衣霉素誘導的系膜細胞過度凋亡，這種效應與4-苯基丁酸干預組相一致。