蛇床子素在體外對人肝癌細胞增殖和侵襲的抑制作用

鮑小棟，方杰，金俊華，鄭桂茹

1.金華市人民醫(yī)院 藥學部，浙江 金華 321000；2.杭州醫(yī)學院 實驗動物中心，浙江 杭州 310063

以肝細胞癌為主的原發(fā)性肝癌是最常見的惡性腫瘤之一，在所有腫瘤疾病患者中約占5.6%[1-4]。在世界范圍內(nèi)，肝癌的發(fā)病率位居第5位，其病死率更是位列第3位；每年全球新增肝癌患者約為62.6萬人，其中發(fā)展中國家的肝癌發(fā)病率要高于發(fā)達國家[4-5]。臨床研究發(fā)現(xiàn)肝癌發(fā)生時肝臟已經(jīng)受到嚴重損傷，且肝癌細胞具有高轉(zhuǎn)移能力和高復(fù)發(fā)率的特點，使得肝癌的治療一直是臨床上面臨的重要難題。中醫(yī)藥是我國的傳統(tǒng)醫(yī)學，在肝癌的預(yù)防和治療方面發(fā)揮著重要的作用。蛇床子素為香豆素類代表化合物，化學名為7-甲氧基-8-異戊烯基香豆素，來源于傳統(tǒng)中藥蛇床子[6-9]。現(xiàn)代藥理學研究發(fā)現(xiàn)，蛇床子素對心腦血管系統(tǒng)、中樞神經(jīng)系統(tǒng)、內(nèi)分泌系統(tǒng)、免疫系統(tǒng)等方面的疾病均具有治療效果[10]。近年來，隨著對蛇床子素研究的深入，多項體外研究實驗表明，蛇床子素對腫瘤細胞顯示出一定的抗增殖作用[11-14]。蛇床子素作為一種低毒、具有抗腫瘤效應(yīng)的天然產(chǎn)物提取物和先導(dǎo)化合物，其廣泛的抗腫瘤作用雖然已被證實，但其抗肝癌細胞的增殖和侵襲的作用效果及抗肝癌相關(guān)機制仍不清楚，尚需進一步研究。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 細胞：人肝癌細胞株HepG2、SMMC-7721和Bel-7402均購于中國科學院細胞庫，于液氮中保存，使用前復(fù)蘇。細胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中，置于37 ℃、5% CO2及飽和濕度的條件，待細胞貼壁生長2～3 d后采用胰蛋白酶消化傳代，待細胞穩(wěn)定傳代2～3代后開始實驗。

1.1.2 主要試劑：蛇床子素（純度＞99%，CAS號：484-12-8）和二甲基亞砜（DMSO，純度＞99.9%，CAS號：67-68-5）購自上海阿拉丁生化科技股份有限公司，蛇床子素完全溶于DMSO中配制成終濃度為 10 mmol/L備用。5-氟尿嘧啶（5-fluorouracil,5-FU）（CAS號：77180-80-4，購自上海藍木化工有限公司，10 mmol/L溶解于1 mL DMSO中）。DMEM完全培養(yǎng)基購自杭州喬陽生物科技有限公司，含0.25% EDTA胰酶、青鏈霉素購自武漢普諾賽生物科技有限公司，胎牛血清購自湖州天杭生物科技股份有限公司，鈣黏蛋白E（E-cadherin）、基質(zhì)金屬蛋白酶2（matrix metalloproteinase-2, MMP-2）、微管蛋白（tublin）、辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔二抗均購自杭州昕誠生物科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 MTT實驗：用胰蛋白酶消化細胞并計數(shù)，以每孔1×104個的密度接種于96孔板中孵育24 h，待細胞完全貼壁。加入配制好的蛇床子素藥液使終給藥濃度分別為50、100、150、200 μmol/L。在對照組中，相同培養(yǎng)條件下不加蛇床子素。設(shè)置6個復(fù) 孔。培養(yǎng)48 h后加入5 g/L MTT溶液20 μL，繼續(xù)孵育4 h，吸去上清液，添加DMSO 150 μL，微量振蕩器振蕩2 min至完全溶解。在570 nm波長處檢測吸光度值（OD值），并計算各實驗組細胞存活。細胞存活率=實驗組吸光度/對照組吸光度×100%。

1.2.2 集落形成實驗：細胞計數(shù)后接種于6孔板中，每孔含細胞1×103個。在培養(yǎng)基中加入蛇床子素藥液和陽性對照藥5-FU，設(shè)置3個復(fù)孔。孵育4 d后倒置顯微鏡下以直徑大于0.5 mm觀察集落數(shù)。

1.2.3 細胞劃痕實驗：設(shè)置蛇床子素給藥組、空白組，將細胞接種到6孔板中，待生長至80%匯合度時，除去培養(yǎng)基，用20 μL移液槍頭末端刮擦產(chǎn)生劃痕，加入培養(yǎng)基，給藥組同時給予蛇床子素藥液，空白組加入等量DMSO溶液，分別孵育48 h和72 h后，在電子顯微鏡下觀察細胞遷移情況，使用計算機輔助電子測量并量化6個隨機視野中每個視野中遷移到劃痕區(qū)域的細胞。

1.2.4 Transwell小室實驗：使用24孔Transwell板，在Transwell上室中涂0.25 mg/mL Matrigel膠。用不同濃度的蛇床子素藥液（50、100 μmol/L） 與等量的DMSO處理SMMC-7721細胞24 h，予胰蛋白酶消化并接種到100 μL無血清培養(yǎng)基中的上部Transwell小室中，每個2×104個細胞。在下室中加入600 μL含10% FBS的完全培養(yǎng)基中，使細胞在含5% CO2的潮濕培養(yǎng)箱中在37 ℃下通過過濾器遷移48 h，將附著于膜下表面的細胞在室溫下用4%多聚甲醛固定30 min，并予結(jié)晶紫染色，用棉簽擦拭除去過濾器表面的細胞，在200倍下隨機選取6個視野計數(shù)過濾器表面上的染色細胞數(shù)及拍照。

1.2.5 蛋白質(zhì)印跡（Western blot）實驗：將人肝癌細胞HepG2和SMMC-7721經(jīng)不同濃度的蛇床子素藥液（50、100、150 μmol/L）處理48 h后，用蛋白胰酶消化并離心以沉淀細胞，加入裂解緩沖液，然后用超聲波粉碎儀在冰上裂解細胞。在4 ℃，轉(zhuǎn)速12 000 r/min下離心20 min。取上清液，測定蛋白質(zhì)濃度，并保存在-80 ℃冰箱中。將樣品蛋白質(zhì)加入等體積緩沖液，混合并煮沸5 min以使蛋白質(zhì)變性并通過凝膠電泳將其分離。轉(zhuǎn)膜，用5%脫脂奶粉封閉2 h，加入兔抗人tubulin-3、MMP-2和E-cadherin抗體（1:1 000） 4 ℃下過夜。采用羊抗兔二抗（1:2 000）室溫孵育1 h，洗膜3次，用凝膠成像儀掃描成像，使用ImageJ軟件分析條帶，以目的蛋白平均光密度/tubulin-3平均光密度反映目的蛋白相對表達量。

1.3 統(tǒng)計學處理方法 采用GraphPad Pro統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計分析。計量數(shù)據(jù)以±s表示，兩組間比較采用t檢驗，多組比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。所有實驗均重復(fù)不少于3次。

2 結(jié)果

2.1 蛇床子素對人肝癌細胞HepG2、SMMC-7721和Bel-7402細胞活力的影響 MTT實驗結(jié)果表明，50、100、150、200 μmol/L的蛇床子素藥液處理人肝癌HepG2、SMMC-7721和Bel-7402細胞48 h后，與空白組相比，蛇床子素各劑量組均呈現(xiàn)出抑制人肝癌細胞生長的效應(yīng)，細胞活力顯著降低，呈現(xiàn)一定的濃度依賴性，且具有良好的IC50值，見圖1。

圖1 蛇床子素化學結(jié)構(gòu)及其對HepG2、SMMC-7721和Bel-7402細胞活力的影響

2.2 蛇床子素對人肝癌細胞HepG2、SMMC-7721和Bel-7402增殖能力的影響 細胞克隆實驗結(jié)果表明，與空白組相比，50、75、100 μmol/L蛇床子素組細胞克隆增殖菌落均顯著減少（P＜0.05），呈現(xiàn)一定的濃度依賴性，見圖2。對于人肝癌HepG2細胞， 75 μmol/L蛇床子素即表現(xiàn)出顯著的抑制效果，而SMMC-7721和Bel-7402細胞，則在100 μmol/L表現(xiàn)出與 陽性對照藥物5-FU（1 mg/mL）相似的抑制增殖能力。

圖2 蛇床子素對HepG2、SMMC-7721和Bel-7402細胞增殖能力的影響

2.3 蛇床子素對人肝癌細胞HepG2、SMMC-7721和Bel-7402遷移和侵襲能力的影響 細胞劃痕實驗結(jié)果表明，與空白組比，蛇床子素（100 μmol/L）組細胞在48 h、72 h遷移距離明顯減少，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），見圖3。SMMC-7721細胞的 Transwell小室實驗結(jié)果表明，與空白組比， 50 μmol/L蛇床子素組和100 μmol/L蛇床子素組SMMC-7721細胞從上腔到下腔的遷移率明顯下降，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），見圖4。

圖4 Transwell法測定蛇床子素對SMMC-7721細胞遷移能力的影響

2.4 蛇床子素對MMP-2和E-cadherin蛋白表達的影響 Western blot結(jié)果表明，與空白組比，在蛇床子素50、100、150 μmol/L影響下，人肝癌細胞HepG2與SMMC-7721中MMP-2蛋白的表達顯著降低（P＜0.05），E-cadherin蛋白的表達顯著升高（P＜0.05），并且呈現(xiàn)一定的濃度依賴性。見圖5。

圖5 蛇床子素對HepG2及SMMC-7721中MMP-2、E-cadherin蛋白表達的影響

3 討論

蛇床子素具有抗炎[15]、抗菌[16]、抗骨質(zhì)疏 松[17]、抗氧化[18]、增強免疫力[19]等多種藥理學作用。蛇床子素作為一種低毒、高效的具有抗腫瘤效應(yīng)的天然產(chǎn)物提取物和先導(dǎo)化合物，在抗肝癌藥物的研究中受到越來越多研究者的關(guān)注，具有極其廣闊的應(yīng)用前景。HepG2、SMMC-7721和Bel-7704均來源于人肝癌細胞株，常被應(yīng)用于新型肝癌治療手段和治療藥物的研究。因此，為了探究蛇床子素是否在體外具有抗肝癌作用，本研究利用細胞增殖實驗發(fā)現(xiàn)不同濃度的蛇床子素（50、100、150、200 μmol/L）在體外均可抑制人肝癌細胞HepG2、SMMC-7721和Bel-7704的細胞活力，呈現(xiàn)濃度依賴性。同時利用細胞集落實驗驗證了蛇床子素組具有抑制人肝癌細胞體外增殖的效果，且在蛇床子素100 μmol/L的濃度條件下，給藥組表現(xiàn)出了與5-FU（1 mg/mL）相似的抑制效果，證實了蛇床子素確實具有抗肝癌的生物活性。

肝癌細胞具有高轉(zhuǎn)移能力和高復(fù)發(fā)率的特點，使得肝癌的藥物治療一直存在挑戰(zhàn)[20-21]。本研究利用細胞劃痕實驗和Transwell小室實驗來評價蛇床子素對于人肝癌細胞遷移侵襲作用的影響，在電子顯微鏡下可以觀察到100 μmol/L的蛇床子素在48 h和72 h可以明顯抑制人肝癌細胞的遷移和侵襲。細胞遷移相關(guān)蛋白MMP-2在腫瘤細胞的侵襲和轉(zhuǎn)移中發(fā)揮重要作用，且在人肝癌細胞中高表達[22-24]。上皮細胞-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial-tomesenchymal transition, EMT）相關(guān)蛋白E-cadherin 可以保持完整的細胞連接，激活E-cadherin蛋白抑制腫瘤細胞的侵襲和轉(zhuǎn)移[25]。為了進一步探究蛇床子素抑制人肝癌細胞遷移和侵襲的藥理機制，本研究利用Western blot實驗，在分子水平上驗證了蛇床子素可以抑制HepG2和SMMC-7721中細胞遷移相關(guān)蛋白MMP-2的表達以及激活EMT相關(guān)蛋白E-cadherin的表達。這提示蛇床子素抑制人肝癌侵襲的作用可能與抑制MMP-2表達以及增加E-cadherin表達有關(guān)。

綜上所述，本研究采取天然產(chǎn)物蛇床子素作為研究對象，發(fā)現(xiàn)其體外具有抑制人肝癌細胞增殖和侵襲的作用，其抑制侵襲作用機制可能與抑制人肝癌細胞中MMP-2蛋白和激活E-cadherin蛋白有關(guān)，有望為肝癌的治療提供新的藥物和新的治療方法。