烷基锍類化合物與DNA復合物的性質研究

張 雷，張 瑩，賴恩銘，陳文洋，周 林，李 婧

(黑龍江八一農墾大學生命科學技術學院，黑龍江 大慶 163319)

基因治療是通過遞送外源正常基因進入靶細胞，改變缺陷基因序列達到治療目的的醫用方法[1-2]，其關鍵在于選擇合適的遞送載體。非病毒載體由于具有制備簡單、低免疫原性、低毒性和可生物降解等優點，成為研究較為廣泛的遞送載體[3-4]。非病毒載體納米級別的粒徑有助于實現載體的靶向性和有效性。研究[5-6]發現，復合物顆粒的粒徑達到一定尺寸時，能夠通過內吞作用進入細胞，并且真核細胞中網格蛋白和小窩蛋白介導的內吞作用具有顯著的顆粒尺寸依賴性。顆粒表面Zeta電位也是影響內吞作用的一個因素，Zeta電位為正的顆粒容易吸附在細胞膜表面，進而促進內吞作用。

目前，研究的非病毒載體主要包括陽離子多聚物、納米顆粒及陽離子脂質體等[3,7]。其中，陽離子脂質體的正電荷頭部能夠與質粒DNA上的負電性磷酸根靜電吸引，疏水脂肪鏈尾部能將質粒DNA縮聚為球狀粒子，這些特點引起了許多研究者的興趣[8-11]。作者所在課題組前期合成了一類烷基锍類化合物[12](圖1a)，由于該類化合物含有锍正離子和疏水脂肪鏈，從而具備了復合質粒DNA的能力。化合物Ⅰ和Ⅱ含有C12烷基鏈，在硫磷比(S/P)為40/1、50/1時顯示出弱阻滯效果；化合物Ⅲ、Ⅳ含有C16烷基鏈，在S/P 為30/1時顯示出弱阻滯效果，在S/P 為40/1、50/1時顯示出較好的阻滯效果(圖1b)。

圖1 烷基锍類化合物的結構式(a)及烷基锍類化合物與gWiz-GFP質粒復合后的凝膠阻滯電泳圖譜(b)Fig.1 Structural formula of alkyl-sulfonium compound(a) and electrophoretic mobility shift assay spectra(b) of alkyl-sulfonium compound and plasmid gWiz-GFP condensates

為深入研究烷基锍類化合物作為基因載體的性能，作者通過動態光散射實驗測定化合物Ⅰ～Ⅳ與質粒DNA復合物的粒徑和Zeta電位，通過MTT法研究化合物Ⅰ～Ⅳ的細胞毒性，通過熒光顯微鏡觀察復合物的細胞攝取情況，為烷基锍類化合物基因載體的設計與轉染能力提升提供基礎。

1 實驗

1.1 材料、試劑與儀器

人肝癌細胞株 Hep3B、HepG2、Huh7，購自美國模式培養物集存庫(ATCC)，本實驗室長期凍存傳代培養。

烷基锍類化合物Ⅰ～Ⅳ，自制。乙腈、二甲基亞砜(DMSO)，分析純，泉瑞試劑公司；蛋白胨、酵母粉、氯化鈉，Oxoid 公司；卡那霉素，Biosharp公司；DH-5α，TIANGEN 公司；gWiz-GFP質粒，Aldevron 公司；EndoFree Plasmid Mega Kit，Qiagen公司；噻唑藍(MTT)胰蛋白酶-EDTA消化液、青鏈霉素混合液(100×)，Solarbio公司；DMEM/F12 高糖培養基，Thermo Fisher 公司；聚乙烯亞胺(PEI，25 kDa)，Sigma公司；胎牛血清，四季青公司；Label IT Cy5標記試劑盒，Mirus Bio公司。

Nano-ZS ZEN型激光粒度儀，Malvern公司；Thermo Nanodrop 2000C 型分光光度計，Thermo Scientific公司；ELX800型全自動酶標儀，BioTek Instruments 公司；Leica DMI 4000B型顯微鏡。

1.2 溶液的配制

gWiz-GFP質粒DNA通過大腸桿菌進行擴增并提取[12]。

用乙腈將化合物Ⅰ～Ⅳ配制成30 nmol·μL-1的溶液，將gWiz-GFP質粒配制成25 ng·μL-1的溶液，用于復合物粒徑、Zeta 電位的測定。

用DMSO將化合物Ⅲ、Ⅳ和PEI倍數稀釋成31.25 μg·mL-1、6.25 μg·mL-1、1.25 μg·mL-1、0.25 μg·mL-1、0.01 μg·mL-1等5個濃度，用于MTT法細胞毒性檢測。

用DMSO將化合物Ⅲ、Ⅳ配制成10 nmol·μL-1的溶液，將PEI配制成6 nmol·μL-1的溶液。將gWiz-GFP質粒配制成100 ng·μL-1的溶液后，使用試劑盒進行Cy5標記。用于復合物細胞攝取能力檢測。

1.3 復合物粒徑、Zeta 電位的測定

分別取化合物溶液(3.3 μL、4.1 μL )與雙蒸水(28.7 μL、27.9 μL)混合成32 μL體系溶液；分別加入gWiz-GFP質粒32 μL(800 ng)，漩渦振蕩 10 s 后，室溫靜置20 min，形成S/P為40/1、50/1的化合物/質粒DNA復合物，將復合物用雙蒸水稀釋至1 mL，采用激光粒度儀測定其粒徑、Zeta 電位。

1.4 細胞培養

細胞傳代：人肝癌細胞株 Hep3B、HepG2、Huh7分別用含有10%胎牛血清、1%青鏈霉素混合液的DMEM/F12高糖培養基(10%FBS培養液)培養，待10 cm培養皿長滿90%細胞后，吸棄培養液，用8 mL PBS緩沖液清洗細胞，吸棄PBS緩沖液，用1 mL胰蛋白酶消化細胞1 min，加入9 mL 10%FBS培養液阻斷消化，用移液槍將貼壁細胞吹下，1 000 r·min-1離心3 min；吸棄上清，加入10 mL 10%FBS培養液，移液槍反復吹打細胞，按1∶3的比例傳代。

細胞培養：取第三代對數生長期的細胞，用細胞計數法計數。取適量細胞，以每孔200 μL 10%FBS培養液接種于96孔板中；置于37 ℃、5%CO2培養箱中培養8 h以上直至細胞貼壁；隨后將細胞培養液置換成200 μL 1%FBS血清培養液或無血清培養液培養至觀測時間。

1.5 MTT法細胞毒性檢測

于96孔板中，接種200 μL密度為每孔8 000個的細胞，培養8 h至貼壁；取配制好的不同濃度化合物Ⅲ、Ⅳ和PEI溶液加入到96孔板中，每孔加樣量為1 μL(空白孔加入DMSO)，最終上樣濃度(μg·mL-1)分別為0、0.01、0.25、1.25、6.25、31.25；將處理好的96孔板置于37 ℃、5%CO2培養箱中分別培養24 h、48 h后，棄去培養液，每孔加入90 μL不含血清的細胞培養液，再加入10 μL 5 mg·mL-1的MTT溶液，繼續在37 ℃、5%CO2培養箱中培養4 h；棄去培養液，每孔(包括空白孔)加入150 μL DMSO，水平搖床振蕩10～20 min，用酶標儀測定490 nm處每孔的吸光度，計算細胞存活率。

1.6 復合物細胞攝取能力檢測

將細胞爬片置于24孔板中，接種500 μL密度為每孔40 000個的細胞，培養8 h至貼壁。取化合物溶液9.8 μL與DMEM/F12高糖培養基40.2 μL混合成50 μL溶液。取參照PEI溶液4 μL與DMEM/F12高糖培養基46 μL混合成50 μL溶液。取Cy5標記的質粒DNA (8 μL，100 ng·μL-1)與DMEM/F12高糖培養基42 μL混合成50 μL溶液，以質粒DNA輕輕加入化合物的方式制備成100 μL的復合物溶液。避光靜置30 min后，加入到24孔板中，置于37 ℃、5%CO2培養箱中培養4 h，棄去培養液，并用PBS緩沖液洗滌3次，每次8 min；加入4%多聚甲醛溶液靜置30 min，進行細胞固定，用PBS緩沖液洗滌3次，每次10 min；加入1%曲拉通溶液靜置20 min，進行細胞膜打孔，用PBS緩沖液洗滌3次，每次15 min；用含DAPI的封片劑將細胞爬片固定在載玻片上，進行細胞核染色，在熒光顯微鏡下觀察熒光分布情況。

2 結果與討論

2.1 復合物的粒徑和Zeta電位(圖2)

圖2 復合物的粒徑(a)和Zeta電位(b)Fig.2 Particle size(a) and Zeta potential(b) of condensates

烷基锍類化合物的正電荷頭部與質粒DNA中電負性磷酸根靜電吸引，疏水脂肪鏈尾部能將質粒DNA縮聚成納米顆粒，適合尺寸的納米顆粒會通過內吞作用進入細胞，Zeta電位為正的顆粒更容易吸附在帶負電的細胞膜表面，加快內吞作用。由圖2a可知，4個化合物與質粒DNA在S/P為40/1、50/1形成的復合物，粒徑均在160～210 nm之間。由圖2b可知，烷基鏈的長度明顯影響復合物的Zeta電位，烷基鏈越長對質粒DNA的復合能力越強。化合物Ⅰ、Ⅱ與質粒DNA在S/P比為40/1和50/1形成的復合物，Zeta電位均為負值；化合物Ⅲ、Ⅳ與質粒DNA在S/P為40/1和50/1形成的復合物，Zeta電位均在+20 mV左右。另外，噻吩環和噻喃環對復合物的影響不顯著。

2.2 細胞毒性

低細胞毒性是化合物作為理想非病毒基因載體的先決條件，采用MTT法檢測化合物Ⅲ、Ⅳ分別對細胞Hep3B、HepG2、Huh7作用24 h和48 h后的細胞毒性，以黃金標準PEI作為對照，結果見圖3。

圖3 化合物Ⅲ、Ⅳ、PEI對Hep3B、HepG2、Huh7的細胞毒性Fig.3 Cytotoxicity of compounds Ⅲ,Ⅳ,and PEI to cells Hep3B,HepG2,and Huh7

由圖3可知，作用24 h后，化合物Ⅲ、Ⅳ與PEI相比，在較低濃度下細胞毒性無明顯差異；在濃度大于6.25 μg·mL-1時，PEI處理組的細胞存活率整體偏高，而化合物Ⅲ、Ⅳ處理組的細胞存活率顯著降低，說明化合物Ⅲ、Ⅳ存在較高的細胞毒性；同時發現，作用24 h后，化合物Ⅲ、Ⅳ對Hep3B、HepG2的細胞毒性大于Huh7細胞。作用48 h后，細胞存活情況與作用24 h的結果相似。

2.3 細胞攝取能力

細胞HepG2在用化合物Ⅲ、Ⅳ、PEI與gWiz-GFP-Cy5生成的復合物處理4 h后，細胞經過固定、打孔、細胞核染色，其中細胞核用DAPI藍色染色(激發波長359 nm，發射波長461 nm)，gWiz-GFP用 Cy5紅色熒光標記(激發波長646 nm，發射波長664 nm)。在熒光顯微鏡下觀察細胞對復合物的攝取情況，結果見圖4。

由圖4可知，PEI處理組在N/P為10/1時，細胞形態無明顯變化，有明顯的紅色熒光分布在藍色細胞核周圍，證明實驗條件下，PEI攜帶質粒DNA進入細胞內；化合物Ⅲ、Ⅳ處理組在S/P為40/1時，多數細胞形態皺縮，出現細胞脫落破損，細胞內無明顯紅色熒光。這是由于，在S/P為40/1時，烷基锍類化合物具有較高的細胞毒性，對細胞存在較強的殺傷能力，致使細胞無法有效攝取復合物。嘗試使用復合物處理細胞2 h、1 h或降低DNA用量至100 ng·μL-1，觀察細胞攝取情況，均未見明顯改善。化合物中锍正離子對細胞的毒性限制了其轉載DNA的效果，化合物結構仍需進一步優化。

(a) PEI/gWiz-GFP-Cy5，N/P=10/1 (b) Ⅲ/gWiz-GFP-Cy5，S/P=40/1 (c) Ⅳ/gWiz-GFP-Cy5，S/P=40/1圖4 HepG2細胞攝取結果Fig.4 Uptake results of HepG2 cells

3 結論

研究了烷基锍類化合物作為基因載體的性能，結果表明，4個烷基锍類化合物與質粒DNA在硫磷比(S/P)為40/1、50/1時形成復合物的粒徑均在160～210 nm之間；烷基鏈較短(C12)時，復合物的Zeta電位為負值，烷基鏈較長(C16)時，復合物的Zeta電位為正值，在+20 mV左右；細胞毒性檢測結果顯示，在較低濃度下，烷基锍類化合物與PEI相比，細胞毒性無明顯差異，在濃度大于6.25 μg·mL-1時，烷基锍類化合物的細胞毒性強于PEI；細胞攝取能力檢測結果顯示，在S/P為40/1時，HepG2細胞存活狀態較差，不能有效攝取復合物。烷基锍類化合物具有作為基因載體的潛力，后續仍需優化結構，進一步降低細胞毒性，完成基因傳遞作用。