超聲軟指標異常胎兒產前診斷中染色體微陣列技術應用研究

韓詠梅

山東省淄博市婦幼保健院產前診斷中心，山東淄博 255000

胎兒異常易導致新生兒出生后外表或內在缺陷，為了提高人口質量，臨床多以產前篩查及診斷的方式降低新生兒出生缺陷率[1]。目前，超聲、MRI 及母體血清學檢測、羊水、臍帶穿刺等為臨床常用篩查及診斷手段[2]。產前超聲可對胎兒宮內情況及結構畸形進行評估篩查，并以超聲軟指標評估染色體異常情況[3]。隨著醫學技術的發展及測序手段的提高，染色體微陣列分析技術憑借其周期短、通量高、準確性及靈敏度高等優勢在產前檢查中取得了廣泛應用，并有效提高了超聲異常胎兒產前診斷的檢出率[4]。基于此，本研究回顧性分析2018年6月—2020年6月于山東省淄博市婦幼保健院行超聲檢查提示胎兒軟指標異常并接受產前診斷的149 例孕婦的臨床資料，就超聲軟指標異常胎兒經染色體微陣列技術產前診斷的價值展開探討。現報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

回顧性分析149 例于本院行超聲檢查提示胎兒軟指標異常并接受侵入性產前診斷的孕婦的臨床資料，其中，年齡19～45 歲，平均（29.72±2.53）歲；孕周18～24周，平均（21.14±1.31）周；超聲軟指標異常類型：胎兒頸項透明層增厚95 例、脈絡叢囊腫9 例、單臍動脈18 例、側腦室增寬12 例、心室強回聲光點2 例、腎盂分離8 例及鼻骨發育不良5 例。

1.2 納入與排除標準

納入標準：①符合《胎兒畸形產前超聲診斷學》[3]相關標準且經產前超聲診斷提示存在異常者；②18 周≤孕周＜25 周；③為單胎妊娠者。排除標準：①臨床資料不完整者；②合并妊娠高血壓者；③合并抗磷脂綜合征者。

1.3 方法

孕婦均行羊膜腔穿刺術，并以傳統G 顯帶核型及染色體微陣列技術進行分析。傳統G 顯帶核型分析：將培養間及細胞處理平臺進行常規無菌消毒處理，給予孕婦羊膜腔穿刺術，取20 mL 羊水作為檢驗標本，進行低速離心處理后在恒溫環境中培養7 d，隨后將培養液轉移至新培養瓶中培養7 d，將3 mL 新培養基加入舊瓶中培養1 d，在檢驗樣本中加入秋水仙素后培養6 h，再加入胰酶消化，收集細胞懸液并固定、滴片、烤片、分帶、閱片處理。染色體微陣列技術分析：將濃度為50 ng/μL的DNA 樣本以NspI 酶進行隨機消化處理，在16℃的溫度下以T4 酶連接長度不同的DNA 片段，連接完畢后將其進行稀釋4 倍處理，并以磁珠吸附法將PCR 擴增后的產物進行純化，以去除多余成分確保實驗結果，片段化處理PCR 定量產物，將雜交混合液加入標記后的DNA中，掃描成片后以ChAS 平臺分析掃描結果，并通過各個數據庫對樣本基因芯片進行判斷。

1.4 觀察指標

將染色體微陣列技術拷貝數變異檢出率及不同超聲軟指標異常胎兒的拷貝數變異檢測結果作為此次研究的觀察指標。染色體微陣列分析拷貝數變異及單核苷酸多態性（single nucleotide polymorphisms, SNP）結果判讀標準：（1）致病性拷貝數變異：經過相關文獻證實存在致病意義，即存在外顯率或表現度差異，均納入致病性范疇。（2）可能致病性拷貝數變異：臨床對于該數據致病尚未取得統一定論，但已有證據表明其存在致病性。（3）臨床意義不明拷貝數變異：臨床尚未對其良性或致病性變異進行定性，但經相關研究累積與證實存在定義的可能性。（4）可能良性拷貝數變異：臨床對于該數據致病尚未取得統一定論，但已有證據表明其與孟德爾遺傳病無關。（5）良性拷貝數變異：①相關文獻或報道結果顯示其為良性變異；②CNV 本身呈多態性；③在相關數據庫中存在＞1%的發生頻率；④發生頻率＜1%，但與基因無關；⑤致病性拷貝數變異（copy number variation, CNV）依據ClinGen 評定得分≤-0.99。

1.5 統計方法

采用SPSS 19.0 統計學軟件處理數據，計數資料以[n(%)]表示，組間差異比較采用χ2檢驗。P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 超聲軟指標異常胎兒經兩種方式分析拷貝數變異檢出率分析

149 例孕婦行傳統G 顯帶核型分析顯示染色體數目異常共19 例，檢出率為12.75%，其中10 例21 三體綜合征、5 例18 三體綜合征、2 例Turner 綜合征、1 例超雌綜合征及1 例克氏綜合征，染色體結構異常2 例，均為染色體倒位；染色體微陣列技術檢出染色體非整倍體及致病性拷貝數變異共23 例，檢出率為15.44%，除傳統G顯帶核型分析檢出數目異常之外還額外檢出致病性拷貝數變異4 例。見表1。

表1 超聲軟指標異常胎兒經兩種方式分析拷貝數變異檢出率分析[n(%)]Table 1 Analysis of Detection rate of copy number variation in fetuses with abnormal ultrasound soft indicators analyzed by two modalities[n(%)]

2.2 僅染色體微陣列技術檢測異常的4 例拷貝數變異分析

4 例致病性拷貝數變異經染色體微陣列技術分析顯示1 例為22q11.21 有3.15 Mb 缺失、1 例為7q11.23 有1.44 Mb 缺失、1 例 為15q11.2 有875 kb 缺失，1 例 為16p11.2 有1.3 Mb 缺失。見表2。

表2 僅染色體微陣列技術檢測異常的4 例拷貝數變異分析Table 2 Analysis of copy number variants in four cases with abnormal detection by chromosome microarray technology only

2.3 不同超聲異常胎兒染色體微陣列技術檢測臨床意義未明拷貝數變異分析

149 例孕婦行染色體微陣列技術檢測出臨床意義不明確拷貝數變異（variants of uncertain significance, VOUS）為24 例（16.11%），其中，可能致病拷貝數變異為6 例（25.00%），可能良性拷貝數變異為4 例（16.67%），未知臨床意義拷貝數變異為14 例（58.33%）。見表3。

表3 不同超聲異常胎兒染色體微陣列技術檢測臨床意義未明拷貝數變異分析[n(%)]Table 3 Analysis of unspecified copy number variants of clinical significance detected by different ultrasound abnormal fetal chromosome microarray techniques[n(%)]

3 討論

產前診斷是臨床檢測胎兒出生前是否存在先天性疾病的一種手段，隨著影像學技術的發展與進步，超聲可較精準檢測出胎兒結構畸形情況，使產婦明確胎兒情況后決定是否繼續妊娠，有助于降低新生兒缺陷，提高生育質量[5]。

超聲軟指標是指產婦經超聲產前診斷，顯示胎兒存在一定程度病變或異常情況，并不代表胎兒解剖功能一定存在異常，也存在胎兒發育過程中正常變異的可能性[6]。胎兒軟指標頸后透明層異常是經相關研究及臨床實踐證實與胎兒畸形存在密切聯系的重要指標之一[7]。頸后透明層形成原因是由于胎兒系統發育不同步所致，屬于正常生理結構，形成時間為10～13+6孕周左右，提示胎兒回流功能因淋巴系統發育遲緩而存在輕微異常，超聲檢測胎兒頸后顯示為無回聲帶。正常情況下，頸后透明層的厚度＜3 mm，若存在增厚情況，則考慮為21、18、13-三體綜合征等染色發育體異常、先天性心臟發育異常等結構畸形或Noonan 綜合征等遺傳綜合征等[8]。脈絡叢囊腫則是指胎兒脈絡叢發育過程中由增生毛細血管及腦脊液所形成的假性囊腫。相關研究指出，胎兒單發脈絡叢囊腫則無明確病理意義，若合并頸后透明層增厚等其他異常軟指標時，則將顯著增加其罹患18、21-三體綜合征等染色體異常的可能性[9]。單臍動脈的形成受到18-三體綜合征等遺傳物質改變所致的原發因素的影響以及胎兒較多接觸藥物、病毒等物理化學物質所致的繼發因素的影響。單臍動脈合并其他軟指標變化則易引發泌尿系統、胃腸道以及染色體等畸形[10]。側腦室增寬是由于胎兒腦室系統過多聚積腦脊液致使腦室系統擴張寬度＞10 mm 所引發的一種結構改變，該征象可提示胎兒存在多種疾病的可能性，但其特異性較低。心室強回聲光點多見于左心室，形成原因與心室腱索反射、心室內鈣化有一定關系。相關研究指出，心室強回聲光點提示胎兒有較大概率發生21、18-三體綜合征[11]。胎兒腎盂寬度≥10 mm 則考慮為腎盂增寬，胎兒出現染色體異常情況則較大概率并發腎盂增寬征象。11～13+6孕周期間為觀察胎兒鼻骨的最佳時期，胎兒正常鼻骨影像檢查可見3 條線，分布、排列較為完整。鼻骨發育不良影像顯示為3 條線呈現消失、斷續態，以21-三體綜合征等較為多見。

結構畸形受到染色體異常的影響，染色體分析是超聲異常胎兒進行產前診斷的一個重要環節。傳統G 顯帶核型分析為檢測細胞遺傳學常用的手段，其檢出胎兒異常的概率為9%～35%，分辨率較大程度限制了傳統G 顯帶核型檢測異常染色體的檢出率[12]。傳統G 顯帶核型對于染色體及亞顯微結構＜5 Mb 的異常存在一定檢測難度。因此，臨床需探求更為精準有效的產前診斷方式，以提高異常胎兒的檢出率，最大限度避免畸形兒的出生。染色體微陣列分析是以微陣列為技術基礎的基因組拷貝數變異的一項分析技術，其主要通過基因組雜交及單核苷酸多態性微陣列進行對比，CMA 是一種高分辨率的全基因組染色體變異檢測技術，相較于傳統G 顯帶核型分析而言無需細胞培養，可在較短的時間內以少量細胞準確檢測胎兒基因組拷貝數改變情況，不僅減少了應用限制及檢測流程，還將檢測使用范圍進行了有效拓寬[13]。染色體微陣列分析技術具有較高的通量，并以二代測序計算方法將正常情況下的基因序列進行還原，使臨床可更加全面、清晰地認識疾病的形成及類型[14]。此外，應用染色體微陣列分析技術相較于傳統G 顯帶核型分析4 周出檢測結果而言具有較短的檢測周期，僅需1周便可出檢測結果。本次研究顯示，149 例孕婦行傳統G顯帶核型分析顯示染色體數目異常共19 例，檢出率為12.75%，其中10 例21 三體綜合征、5 例18 三體綜合征、2例Turner 綜合征、1 例超雌綜合征及1 例克氏綜合征，染色體結構異常2 例，均為染色體倒位；染色體微陣列技術檢出染色體非整倍體及致病性拷貝數變異共23 例，檢出率為15.44%，除傳統G 顯帶核型分析檢出數目異常之外還額外檢出致病性拷貝數變異4 例。宓嫻賢等[15]在其研究結果中指出，染色體微陣列分析技術共檢出致病性拷貝數變異16 例，檢出率為5.46%；在168 例結構異常胎兒中檢出致病性拷貝數變異10 例，檢出率為5.95%；在125例非結構異常胎兒中檢出致病性拷貝數變異6 例，檢出率為4.80%。結果表明傳統G 顯帶核型分析僅對于染色體數目及結構異常有較高檢出率，而對于基因組拷貝數的檢測則存在較大局限性，染色體微陣分析技術不僅可檢測出傳統G 顯帶核型檢測的染色體數目異常，對于染色體無倍數變化的基因組缺失、擴增等均具有良好的檢出率，但不能檢出無拷貝數變異的染色體結構地改變，故2 例染色體倒位未檢出。結果表明，染色體微陣列分析技術檢測染色體異常情況具有較高的靈敏度，可較精準檢出傳統G 顯帶核型未檢測出的致病性拷貝數變異。

綜上所述，染色體微陣列分析應用于超聲異常胎兒的診斷中不僅可準確檢測出致病性拷貝數變異，對于基因缺失、擴增等微變化形式也具有較好的檢出率，在產前診斷中具有較高的應用價值。