基于網絡藥理學和分子對接探究補腎活血湯“從虛從瘀從毒”治療膝骨關節炎的作用機制

劉力菠，盧 敏，鄺高艷，陳 瑤，曾 凡

(1.湖南中醫藥大學，湖南 長沙 410208；2.湖南中醫藥大學第一附屬醫院，湖南 長沙 410007；3.衡陽市第一人民醫院，湖南 衡陽 421000)

膝骨關節炎(Knee osteoarthritis，KOA)又稱退行性膝關節炎，是以膝關節疼痛、畸形、穩定性和運動功能下降為臨床表現的疾病[1]，并有關節軟骨漸進性退化，關節組織重塑以及滑膜的炎性變化的病理特征[2]。中老年人群中KOA的發病率呈逐年上升趨勢，嚴重影響患者的健康和生活質量[3]。流行病學[4]顯示，在全世界年齡大于65歲人群中，有一半以上為膝骨關節炎患者，疾病的發展與年齡有關。相關研究表明[5]，中國的KOA患病率可達18% 以上，在性別上存在差異，男性為11%，女性為19%。女性KOA的患病率明顯高于男性。目前，KOA的發病機制尚未完全闡明，其治療主要是減輕疼痛，改善或恢復關節功能，延緩關節進一步退變。中醫藥運用整體觀念及辨證論治，有許多治療方法，例如內服外敷中藥、針灸、按摩等療法，療效確切，可明顯改善患者的臨床癥狀[6]，中醫藥仍然是國內治療KOA的主要手段，有療效明顯、價格低廉、方法多樣、不良反應少等優勢[7]。部分指南[8]已經明確指出，常用西藥如NSAIDs類藥物、鎮痛藥等短期療效顯著，但長期服用不良反應較多。通過探索已證明具有治療作用的藥物干預疾病的分子機制，去發現具有潛在治療作用的藥物是非常有必要的。

KOA屬中醫學“膝痹”范疇，其病機始終為“本虛標實”[9]。導師盧敏教授[10]認為，膝骨關節炎的病機特點無非是“虛、瘀、毒”三種致病因素。本課題組基于該病機理論，展開了大量的研究[11-14]，并應用中醫藥治療本病，取得較好療效。目前已有研究證實[15-18]，補腎活血湯對KOA的療效確切，但中藥復方存在多成分、多靶點、多途徑的特點，作用機制十分復雜，需進一步探討。

本研究采用網絡藥理學及分子對接方法，對補腎活血湯進行分析，揭示補腎活血湯“從虛從瘀從毒”三個角度干預KOA的分子機理，從微觀角度闡述其原理，結合中醫特色病因病機，為KOA的深入研究及臨床用藥提供參考。

1 數據來源及方法

1.1 藥材中所含活性成分的篩選

以補腎活血湯中“紅花”“枸杞”“當歸”“杜仲”“獨活”“沒藥”“肉蓯蓉”“熟地”“山茱萸”“菟絲子”為關鍵詞在TCMSP(中藥系統藥理學數據庫與分析平臺)(https：//tcmspw.com/tcmsp.php#)數據庫中檢索，去除重復得到藥物化學成分，并設置其口服利用度(OB)≥30%、類藥性(DL)≥0.18為篩選條件。對未檢索到的“補骨脂”，從 TCM Database@Taiwan(http：//tcm.cmu.edu.tw/index.php)數據庫查詢其活性成分。

1.2 藥物作用靶點預測與疾病靶點查詢

在TCMSP中進行檢索，獲取藥物活性成分靶點，通過Uniprot數據庫(https：//www.uniprot.org/)對各靶點人類基因簡稱進行查詢轉化，獲取補腎活血湯中可能存在的基因靶點。以疾病“Knee Osteoarthritis”為檢索詞在PharmGkb(https：//www.pharmgkb.org/)、DrugBank(https：//go.drugbank.com/)、GeneCards(https：//www.genecards.org/)、TTD(http：//db.idrblab.net/ttd/)、OMIM(https：//omim.org/)這5個數據庫中進行檢索，對收集到的疾病靶點進行整合、去重，預測出疾病相關靶點，繪制維恩圖。

1.3 共同靶點的確定

通過R軟件繪制維恩圖獲取藥物(補腎活血湯)靶點與疾病(KOA)靶點的交集為共同靶點。

1.4 構建“中藥-化合物-靶點-疾病”可視化網絡

通過Cytoscape 3.8.2軟件對“中藥-化合物-靶點-疾病”網絡進行可視化呈現，使用Cytoscape軟件中“Network Analyzer”功能獲得其相關參數。通過分析節點連接度Degree，以獲取補腎活血湯治療KOA的主要活性成分，篩選出核心成分。

1.5 PPI蛋白相互作用網絡的構建

將“1.3”中篩選得到的治療KOA的靶點在String(https：//string-db.org/)數據庫中分析，Organism(種屬)設為“Homo Sapiens(人類)”，保存數據為tsv格式。運用Cytoscape 3.8.2 軟件構建PPI蛋白網絡。然后使用Cytoscape軟件中“Network Analyzer”功能，獲得相關參數，然后對DC(Degree)、BC(Betweenness)和CC(Closeness)、LAC(Local Average Connectivitiy-based method)、NC(Network)、EC(Eigenvector)進行分析，篩選出核心靶點。

1.6 GO和KEGG富集結果分析

將“1.3”中交集靶點通過R軟件中 ClusterProfiler 程序包進行基因本體(GO)和京都基因與基因組百科全書(KEGG)通路富集分析。設置p=0.05，q=0.05，根據重要性對每個類別進行排序，并用氣泡圖的形式直觀顯示GO分析中的前10名和KEGG分析中的前30名。

1.7 分子對接

本研究把補腎活血湯的核心成分輸入到pubchem(https：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)網站上，獲取2D結構，下載SDF格式，使用ChemBio 3D 14.0軟件優化SDF文件并將其轉換為mol2文件，在Uniprot數據庫中找到核心靶點的蛋白ID，再通過PDB(http：//www.rcsb.org/)數據庫中獲得其受體，下載pdb格式文件，將文件導入PYMOL 2.4.1軟件中，刪除水分子及其配體，下一步使用AutoDock Tools 1.5.6軟件加氫并計算電荷，設置受體和配體為pdbqt格式，最后把受體和配體導入PYMOL 2.4.1中進行分子對接。

2 結果

2.1 補腎活血湯的有效活性成分

通過TCMSP共篩選出192種活性化合物，其中補骨脂2個、杜仲 28個、紅花 22 個、沒藥 45 個、肉蓯蓉 6 個、菟絲子 11 個、當歸2個、枸杞 45個、山茱萸 20個、熟地 2 個、獨活 9 個，去重整理后補腎活血湯共獲得163種活性化合物。

2.2 藥物及疾病靶點預測及共同靶點的確定

藥物活性化合物在Uniprot數據庫中取并集獲得244個基因靶標。在GeneCards、OMIM、PharmGkb、TTD、DrugBank數據庫中對收集到的疾病靶點，繪制韋恩圖如圖1，取并集獲取已知的疾病靶點共1 921個。取兩者交集為共同靶點，共129個(圖2)。

圖1 疾病靶點韋恩圖

圖2 疾病和靶點韋恩圖

2.3 “中藥-成分-靶點-疾病”可視化網絡分析

在Cytoscape 3.8.2軟件中對“中藥-成分-靶點-疾病”進行可視化網絡的構建，將網絡中各個節點及邊的數據進行網絡拓撲分析，如圖3，其中圓形點代表成分，顏色顯示其歸屬的中藥；矩形代表靶點。共得到241個節點，其中包括活性化合物節點112個、疾病靶點節點129個，共533條邊。“Degree”值越大，表示該節點在網絡中越重要。以“Degree”值從高到低進行篩選，總共篩選出10個核心成分，分別為quercetin(槲皮素)、luteolin(木犀草素)、kaempferol(山柰酚)、beta-carotene(β-胡蘿卜素)、baicalein(黃芩素)、beta-sitosterol(β-谷甾醇)、isorhamnetin(異鼠李素)、ellagic acid(鞣花酸)、glycitein(黃豆黃素)、Tetrahydroalstonine(四氫鴨腳木堿)以上成分可能為治療KOA的重要成分。

圖3 “中藥-成分-靶點-疾病”可視化網絡分析

2.4 PPI蛋白質相互作用網絡構建

使用String數據庫分析藥物和疾病共同作用的靶點(圖4)，其中節點表示蛋白質，邊表示蛋白質之間的結合的關系。將分析結果導入 Cytoscape 3.8.2 進行PPI 可視化網絡構建，根據節點連接度(Degree)對蛋白互作靶點前 30 的關鍵靶點展示，如圖4。按照DC(Degree)、BC(Betweenness)和CC(Closeness)、LAC(Local Average Connectivitiy-based method)、NC(Network)、EC(Eigenvector)順序的中位數數值分三次進行篩選。第一次篩選中位數數值：40.569 922 175、0.216 165 414、7、0.046 412 315 5、3.2、4.158；第二次篩選中位數數值：12.558 718 9、0.583 333 333、11、0.140 615 902 5、5.601 398 601 5、7.042 153 679 5；第三次篩選中位數數值：50.546 740 815、0.660 377 358、17、0.226 309 873、7.294 117 647、10.721 611 07。共篩選到3個核心靶點蛋白，分別為TP53、JUN、RELA。

圖4 PPI網絡和前 30 的關鍵靶點

2.5 GO和 KEGG 富集結果分析

GO功能富集分析一共得到2 604個富集結果，其中BP(生物學過程)、CC(細胞組成)、MF(分子功能)分別有 2 366、81、157個富集結果。顯示前十項，如圖 5。KEGG通路富集分析一共有159個富集結果，顯示前30項，如圖6，最顯著的是Lipid and atherosclerosis信號通路，參與通路的基因有BCL2、BAX、JUN、CASP3、PRKCA、RELA、AKT1、TNF、MAPK8、STAT1、ICAM1、SELE、VCAM1、MAPK14、VEGFA、CCND1、MMP2、MAPK1、IL6、F3、IL1B、CCL2、CXCL8、NOS3、THBD、SERPINE1、COL1A1、IL1A、COL3A1、NOX1。

圖5 GO富集分析氣泡圖

圖6 KEGG富集分析氣泡圖

2.6 分子對接

分子對接進一步闡明了補腎活血湯關鍵靶點與活性成分在KOA治療中的結合效果。通過篩選，本研究選擇了Degree中排名前3種活性化合物與核心靶點進行分子對接。得到分子對接結合能得分見表1。取結合最穩定的JUN和luteolin、kaempferol、quercetin對接構象進行作圖分析，如圖 7。

表1 結合能得分

圖7 分子對接構象

3 討論

補腎活血湯具有補益肝腎、強筋、祛除風濕、活血止痛的功效，方中的七味藥熟地黃、杜仲、菟絲子、補骨脂、枸杞子、山茱萸、肉蓯蓉補益肝腎，填補精血，強壯筋骨，從虛方面論治；三味藥當歸尾、紅花、沒藥活血化瘀止痛，從瘀從內毒論治；一味藥獨活祛除風濕，從外毒論治。全方十一味藥共“從虛從瘀從毒[10]”的角度治療膝骨關節炎，以達到補益、化瘀、祛毒之功效。

通過查閱文獻，對“中藥-成分-靶點-疾病”網絡中顯示的10個核心成分進行分析。槲皮素可通過減少炎性細胞因子的產生而保護關節軟骨和延緩KOA的進展，影響炎癥相關信號通路，抑制ECM降解[19]。木犀草素可降低炎癥因子表達，調節Nrf2/HO-1和NF-κB信號通路[20]。山柰酚具有多種生物活性，有抗氧化和清除自由基以及抗炎，抗病毒和降血糖的作用[21]。β-胡蘿卜素是維生素A的合成前體，它還在動物中發揮獨立于維生素A的生理作用，例如抗氧化、抗炎和免疫調節[22]。

通過構建蛋白互作網絡，共有30個治療KOA的靶點。AKT1，AKT2和AKT3共同組成AKT激酶家族。AKT與磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)一起形成PI3K/AKT信號通路，活化的AKT通過上調CyclinD1，并磷酸化P21和P27及其他細胞周期蛋白，達到促進細胞增殖并抑制細胞凋亡的作用[23-24]。有相關研究[25]發現，AKT參與關節炎的病理過程，在骨關節炎軟骨細胞中磷酸化(p)-AKT表達下調。通過上調這個靶點干預KOA，這可能與補腎活血湯“從虛”治療膝骨關節炎關系密切。其中經過篩選的三種核心靶點，Nishitani Kohei[26]等發現，IL-1β可直接影響軟骨細胞中基質金屬蛋白酶的表達，從而誘導軟骨細胞凋亡和破壞，而通過抑制JUN通路可以抑制 IL-1β的表達，這恰好提示 JUN 通路對治療骨關節炎具有潛在價值。在KOA發病機制中，RELA[27]基因參與軟骨降解。作為NF-κβ基因的一個成員家族，RELA可調節炎癥反應并激活促炎細胞因子。TP53[28]被認為與RA的成纖維樣滑膜細胞增生和關節破壞相關，即參與關節破壞過程。通過下調這3個核心靶點來實現對KOA的治療，這可能與補腎活血湯“從毒”治療膝骨關節炎密切相關。

GO分析結果顯示，補腎活血湯通過多種生物學過程參與KOA的治療過程，其最顯著的是Response to oxidative stress(氧化應激反應)。KEGG富集結果中，最顯著的是Lipid and atherosclerosis(脂質和動脈粥樣硬化)信號通路，它可以通過調控其通路中VEGFA，從而調節血小板活化[29]。另外Fluid shear stress and atherosclerosis(流體剪切力與動脈粥樣硬化)通路可以調控 KLF2 和內皮一氧化氮合酶(eNos)，達到抑制黏附分子如細胞間黏附分子-1(ICAM-1)和血管細胞黏附分子-1(VCAM-1)的表達，發揮抗炎、抗黏附，維持血管內環境穩定性的效果[30]。PI3K-AKT信號通路的激活/抑制已被闡明用于血栓形成、內皮細胞凋亡[31]。可以推測出補腎活血湯“從瘀”治療KOA與調節Lipid and atherosclerosis、Fluid shear stress and atherosclerosis、PI3K-AKT等通路的關系密切。

根據分子對接結果，quercetin、luteolin、kaempferol分別與TP53、JUN、RELA對接，其對接的結合能分數均比較低，這表明二者容易結合并形成穩定的結構。表明這核心成分在干預KOA的治療中發揮著重要角色，在現代研究中，這些成分可作為探索潛在藥物治療KOA的研究方向，為新藥的研發提供新思路。

綜上，本研究通過網絡藥理學和分子對接結合的方法，篩選出補腎活血湯治療KOA的有效成分、關鍵靶點和信號通路，并“從虛從瘀從毒”的角度探討其相關機制，發現補腎活血湯可能通過促進細胞增殖、抗黏附及維持血管內穩定、抗炎等方面發揮其重要作用，具有多成分、多靶點、多途徑干預KOA的特點。本研究為補腎活血湯治療KOA機制研究提供了理論依據和線索，豐富了中醫藥治療KOA的相關理論，其預測結果仍需進行實驗來驗證研究的正確性。