口腔癌細胞通過傳遞性內質網應激影響胰島β細胞功能的初探

李若焓 黃穎昭 廖乃麟 吳沉洲 李一

口腔疾病研究國家重點實驗室 國家口腔疾病臨床醫學研究中心 四川大學華西口腔醫院頭頸腫瘤外科，成都610041

內質網是蛋白合成的重要細胞器，參與蛋白的生產、折疊、修飾、成熟、質量控制和降解[1-2]。內質網與蛋白質穩定的維持密切相關，當內質網穩態被各種干擾破壞時，就會觸發一種稱為“內質網應激（endoplasmic reticulum stress，ERS）”的細胞狀態。

為了克服應激并恢復蛋白質穩定，ERS會激活未折疊蛋白反應（unfolded protein response，UPR）[3]。UPR可以減少蛋白質合成，增強內質網蛋白質折疊能力，降解錯誤折疊或未折疊的蛋白質[4]。如果UPR不能協助細胞擺脫應激，那么UPR信號會從促生存轉為促死亡[5-8]。普遍認為癌癥可導致ERS及UPR信號通路的激活[9-11]。ERS對癌癥的發生、發展有雙向調控作用：如能及時解決ERS，UPR將有利于癌細胞的生存、轉移、血管生成和耐藥性的提高；如果內質網中錯誤折疊或未折疊的蛋白質大量積累，超過了內質網的自我調節能力，將激活ERS下游凋亡通路，誘導細胞凋亡[12]。

ERS除了直接影響癌細胞外，還參與細胞之間的交流。2011年，Mahadevan等[13]首次報道了前列腺癌細胞在ERS狀態下會釋放某些“可溶性的因子”，誘導骨髓來源的髓系細胞也出現ERS，這種細胞間的ERS傳遞現象稱為傳遞性內質網應 激（transmissible endoplasmic reticulum stress，TERS）。

研究[14-16]發現，ERS狀態的胰島β細胞會引發多種反應，這些反應包括細胞凋亡、細胞功能受損、胰島素分泌障礙等。目前許多研究認為，口腔癌對患者身體的損害不僅僅是由于癌癥對進食器官的毀損，還由于包括胰島功能下降等在內的諸多代謝紊亂，這些破壞對口腔癌患者的生活質量和預后造成了較大的負面影響。本研究的目的是為探究口腔癌細胞是否通過TERS影響了胰島β細胞的功能。

1 材料和方法

1.1 實驗材料

人口腔鱗癌細胞系CAL-27、SCC-25，小鼠胰島素瘤6細胞系的MIN6細胞（四川大學口腔疾病研究國家重點實驗室提供），達爾伯克改良伊格爾（Dulbecco’s modified eagle medium，DMEM）培養基，DMEM/F-12培養基，洛斯維·帕克紀念研究所-1640（Roswell Park Memorial Institute-1640，RPMI-1640）培養基，胎牛血清（fetal bovine se‐rum，FBS），0.25%胰蛋白酶（Gibco公司，美國），磷酸緩沖鹽溶液（phosphate buffer saline，PBS）（武漢賽維爾生物科技有限公司），衣霉素（tunicamycin，TM）（北京市華中海威基因科技有限公司），RNA提取試劑（Trizol試劑）（TAKARA公司，日本），逆轉錄試劑盒（Thermo Fisher Sci‐entific公司，美國），實時熒光定量聚合酶鏈反應（quantitative real-time polymerase chain reaction，qPCR）擴增試劑盒（Bimake公司，美國），甘油醛-3-磷酸脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate de‐hydrogenase，GAPDH）、β-肌動蛋白（β-actin）、結合免疫球蛋白（binding immunoglobulin protein，BiP）、剪切型X-盒結合蛋白1（spliced form of Xbox binding protein 1，XBP1S）、CAAT區/增強子結合蛋白同源蛋白（C/EBP-Homologous Protein，CHOP）、胰島素（insulin，INS）-1、INS-2的qP‐CR引物（上海市生工生物工程股份有限公司），兔抗BiP抗體，兔抗微管蛋白（tubulin，TUB）抗體（杭州華安生物技術有限公司），鼠抗INS單克隆抗體（Sigma-Aidrich公司，美國），抗兔二抗、抗鼠二抗（SAB公司，美國），脫氧核苷酸末端轉移酶介導的脫氧尿苷三磷酸缺口末端標記（TdTmediated dUTPnick-end labeling，TUNEL）細胞凋亡檢測試劑盒，二喹啉甲酸（Bicinchoninic acid，BCA）蛋白濃度測定試劑盒（上海碧云天生物技術有限公司），小鼠INS酶聯免疫吸附測定（enzyme linked immunosorbentassay，ELISA）試劑盒，小鼠C肽ELISA試劑盒（上海茁彩生物科技有限公司）。

1.2 細胞培養

CAL-27細胞用含10%FBS的DMEM培養基，SCC-25細胞用含10%FBS的DMEM/F-12培養基，MIN6細胞用含10%FBS的RPMI-1640培養基，置于37℃、5%CO2的培養箱培養。細胞傳代時用0.25%胰蛋白酶消化貼壁細胞，用相應的培養基終止消化并離心，重懸后接種于培養瓶中。

1.3 誘導口腔癌細胞ERS

1.3.1 誘導口腔癌細胞CAL-27產生ERS用TM（2μg·mL-1）作為ERS應激劑，持續刺激組使用TM持續處理3、6、17、24 h后收樣；間歇刺激組加入TM處理2 h，PBS清洗3次確保無TM殘留后，換成正常培養基，繼續培養1、4、15、22 h后，0.25%胰蛋白酶消化貼壁細胞，收樣。

1.3.2 誘導口腔癌細胞SCC-25產生ERS 用TM（2μg·mL-1）作為ERS應激劑，持續刺激組使用TM持續處理3、6、24 h后收樣，間歇刺激組加入TM處理2 h，PBS清洗3次確保無TM殘留后，換成正常培養基，繼續培養1、4、22 h后，0.25%胰蛋白酶消化貼壁細胞，收樣。

1.4 誘導MIN6細胞ERS

用TM（2μg·mL-1）作為ERS應激劑，MIN6細胞使用TM持續處理3、6、17、24 h后，0.25%胰蛋白酶消化貼壁細胞，收樣。

1.5 制作條件培養基

加入0.2%二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）或2μg·mL-1TM處理口腔癌細胞2 h后，PBS清洗3次確保無DMSO或TM殘留后，換成正常培養基，繼續培養12 h后，收集上清液，離心（1 000 r·min-1，5 min）、過濾（0.22μm孔徑），去除雜質及細胞碎片。收集的條件培養基分別稱為對照條件培養基（control conditional medium，CCM）、介導TERS效應的條件培養基（TERSconditional medium，TCM）。SCC-25細胞的CCM、TCM稱為CCM25、TCM25，CAL-27細胞的CCM、TCM稱為CCM27，TCM27。

1.6 TERS實驗

MIN6細胞以60萬/孔密度鋪于6孔板中。使用DMSO（0.2%，陰性對照）、TM（2μg·mL-1，陽性對照）、CCM25、TCM25、CCM27、TCM27處理MIN6細胞24 h、48 h后，0.25%胰蛋白酶消化貼壁細胞，收樣。

1.7 qPCR檢測

用Trizol法提取細胞總RNA，溶于無酶水中，用紫外分光光度計進行濃度和純度的檢測。取10μL總RNA，用逆轉錄試劑盒逆轉錄為互補脫氧核糖核酸（complementary deoxyribonucleic acid，cDNA），用qPCR擴增試劑盒進行擴增。使用GAPDH作為CAL-27、SCC-25細胞的內參，使用β-actin作為MIN6細胞的內參。反應體系為10μL：5μL qPCR預混液，0.5μL上游引物，0.5μL下游引物，4μL cDNA。設置3個復孔，反應條件為：預變性95℃3 min，95℃5 s，55℃30 s，72℃30 s，40個循環。用2-ΔΔCT統計學方法計算目的基因相對表達量。相關引物序列見表1。

表1 引物序列Tab 1 Primer sequence

1.8 WB檢測

用蛋白裂解液提取細胞總蛋白，在蛋白液中加入蛋白上樣緩沖液，99℃、1 400 r·min-1、5 min進行變性。樣品進行十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳后轉膜，用5%牛血清白蛋白溶液室溫封閉30 min，洗滌緩沖液清洗。孵育一抗：抗TUB（1∶5 000），抗BiP（1∶1 000），抗INS（1∶500），4℃過夜。洗滌緩沖液洗滌3次，每次為20 min。室溫孵育二抗1 h。增強化學發光顯影，并進行灰度分析，“目的蛋白/內參蛋白”表示。

1.9 MIN6細胞的細胞凋亡實驗

MIN6細胞以2萬/孔密度鋪于96孔板中。使用DMSO（0.2%，陰性對照）、TM（2μg·mL-1，陽性對照）、CCM27、TCM27處理MIN6細胞24 h。PBS洗滌一次，加入免疫染色固定液固定細胞30 min。PBS洗滌一次，加入免疫染色強力通透液，室溫孵育5 min。PBS洗滌2次，加入TUNEL檢測液染凋亡細胞，37℃避光孵育60 min。PBS洗滌3次，加入4’,6-聯脒-2’-苯基吲哚（4’,6-di‐amidino-2’-phenylindole，DAPI）染色液染所有細胞的細胞核，室溫孵育5 min。PBS洗滌3次，加入抗熒光淬滅封片液，在熒光顯微鏡下觀察。于200倍倒置熒光顯微鏡下，計數6個視野中凋亡細胞數和總細胞數，取均值，計算細胞凋亡率：細胞凋亡率=凋亡細胞數/總細胞數×100%。

1.10 MIN6細胞的克隆形成實驗

MIN6細胞以500個/孔密度鋪于12孔板中。使用DMSO（0.2%，陰性對照）、TM（2μg·mL-1，陽性對照）、CCM25、TCM25、CCM27、TCM27處理MIN6細胞24 h后，使用正常培養基繼續培養7 d后吸棄上清，用4%多聚甲醛室溫固定10 min，再加入結晶紫染色，10 min后用PBS洗滌2次，拍照記錄實驗結果并計算每孔中的細胞群落數，克隆形成率=（克隆數/接種細胞數）×100%。

1.11 MIN6細胞的分泌功能實驗

1.11.1 葡萄糖刺激胰島素分泌（glucose-stimulat‐ed insulin secretion，GSIS）實驗 MIN6細胞以60萬/孔密度鋪于6孔板中。使用DMSO（0.2%，陰性對照）、TM（2μg·mL-1，陽性對照）、CCM27、TCM27處理MIN6細胞24 h后，用克雷布斯林格緩沖液（Krebs-Ringer Buffer，KRB）洗滌2次，并在KRB緩沖液中培養1 h后，一組換液成含3.3 mmol·L-1葡萄糖的培養基，另一組換液成含16.7 mmol·L-1葡萄糖的培養基。繼續培養1 h后，收集細胞及上清液，用小鼠INSELISA試劑盒檢測細胞內及上清液中的INS含量，MIN6細胞的INS分泌量采用“上清液INS濃度/細胞內INS濃度”表示。

1.11.2 葡萄糖刺激C肽分泌實驗 MIN6細胞以60萬/孔密度鋪于6孔板中。使用DMSO（0.2%，陰性對照）、TM（2μg·mL-1，陽性對照）、CCM27、TCM27處理MIN6細胞24 h后，用KRB緩沖液洗滌2次，并在KRB緩沖液中培養1 h后，一組換液成含3.3 mmol·L-1葡萄糖的培養基，另一組換液成含16.7 mmol·L-1葡萄糖的培養基。繼續培養1 h后，收集細胞及上清液，用BCA試劑盒檢測細胞總蛋白含量，用小鼠C肽ELISA試劑盒檢測上清液中的C肽含量，MIN6細胞的C肽分泌量采用“上清液C肽濃度/總蛋白”表示。

1.12 統計學分析

采用Graphpad Prism 8軟件對實驗結果進行統計分析，兩組之間比較使用t檢驗，多組之間比較使用方差分析，P<0.05表示差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 誘導口腔癌細胞ERS實驗結果

在CAL-27細胞中，ERS標志物BiP在持續刺激組和間歇刺激組中4個時間點的mRNA相對表達量及蛋白表達量均高于0 h（圖1 A、D、E），ERS標志物XBP1S、CHOP的mRNA相對表達量在持續刺激組的3 h和間歇刺激組的3 h+均高于0 h（圖1B、C），BiP、XBP1S、CHOP的mRNA相對表達量及BiP的蛋白表達量在持續刺激組和間歇刺激組組間同時間點比較的差異無統計學意義（圖1）。

圖1 CAL-27細胞的ERS標志物表達Fig 1 Expression of ERSmarkers in CAL-27 cells

在SCC-25細胞中，BiP、XBP1S、CHOP在持續刺激組和間歇刺激組中3個時間點的mRNA相對表達量均高于0 h，持續刺激組和間歇刺激組組間同時間點比較的差異無統計學意義（圖2）。

圖2 SCC-25細胞的ERS標志物表達Fig 2 Expression of ERSmarkers in SCC-25 cells

2.2 誘導MIN6細胞ERS實驗結果

3、6、17 、24 h的BiP、XBP1S、CHOP的mRNA相對表達量高于0 h（圖3A～C），3、6、17、24 h的BiP的蛋白表達量高于0 h（圖3D、E）。

圖3 MIN6細胞的ERS標志物表達Fig 3 Expression of ERSmarkers in MIN6 cells

2.3 MIN6細胞的細胞凋亡實驗結果

TM組相較0組、TCM27組相較CCM27組，鏡下見MIN6細胞的細胞凋亡比例增加（圖4），細胞凋亡率增加（圖5）。

圖4 MIN6細胞TUNEL染色結果 倒置熒光顯微鏡 ×200Fig 4 TUNEL staining of MIN6 cells inverted fluorescence microscope ×200

圖5 MIN6細胞凋亡率Fig 5 Apoptosis rateof MIN6 cells

2.4 MIN6細胞的克隆形成實驗結果

TM組相較0組、TCM25組相較CCM25組、TCM27組相較CCM27組，MIN6細胞克隆形成的群落數減少，克隆形成率降低（圖6）。

圖6 MIN6細胞的克隆形成能力Fig 6 Colony formation ability of MIN6 cells

2.5 TERS實驗結果

TM組相較0組、TCM25組相較CCM25組、TCM27組相較CCM27組，BiP、XBP1S的mRNA相對表達量上調（圖7A～D），BiP的蛋白表達量上調（圖7E～H）。

圖7 MIN6細胞的ERS標志物表達Fig 7 Expression of ERSmarkersin MIN6 cells

TM組相較0組、TCM25組相較CCM25組、TCM27組相較CCM27組，INS的蛋白表達量下調（圖8A～D），INS的mRNA相對表達量上調（圖8 E～H）。

圖8 MIN6細胞的INS表達Fig 8 Expression of INSin MIN6 cells

2.6 MIN6細胞的分泌功能實驗結果

2.6.1 GSIS實驗結果 在3.3、16.7 mmol·L-1兩種濃度的葡萄糖刺激下，TM組相較0組、TCM27組相較CCM27組，INS分泌量降低（圖9）。

圖9 MIN6細胞的INS分泌量Fig 9 INSSecretion in MIN6 cells

2.6.2 葡萄糖刺激C肽分泌的實驗結果 在3.3、16.7 mmol·L-1兩種濃度的葡萄糖刺激下，TM組相較0組、TCM27組相較CCM27組，C肽分泌量降低（圖10）。

圖10 MIN6細胞的C肽分泌量Fig 10 C-peptide Secretion in MIN6 cells

3 討論

TM可以阻斷N-連接糖基化，從而影響真核細胞糖蛋白的折疊，產生ERS，激活UPR，是ERS常用應激劑之一。UPR的激活是因為內質網中累積的錯誤折疊或未折疊蛋白質競爭性地與BiP結合，3種ERS感受器（蛋白激酶RNA樣內質網激酶、肌醇需要酶1、激活轉錄因子6）與BiP解離并激活[17-18]，啟動下游3個主要信號通路（蛋白激酶RNA樣內質網激酶/真核起始因子2α、肌醇需要酶1/x-盒結合蛋白1、激活轉錄因子6）[19]。通過查閱文獻[20]確定TM處理細胞的濃度范圍，進行預實驗。預實驗中，不同濃度的TM分別處理CAL-27、SCC-25、MIN6細胞，鏡下觀察細胞狀態，并通過qPCR檢測ERS標志物的表達。預實驗發現TM濃度在2μg·mL-1時，鏡下細胞未有大面積漂浮現象，并通過qPCR檢測ERS標志物明顯上調，確定了本研究TM濃度為2μg·mL-1。

在誘導CAL-27細胞ERS實驗中，發現ERS標志物的表達在持續刺激組和間歇刺激組組間同時間點比較的差異無統計學意義。表明對CAL-27細胞施加TM刺激2 h后撤除TM，與持續施加TM刺激，兩種刺激方式的ERS效應無明顯差別。在誘導SCC-25細胞ERS實驗中，選擇與誘導CAL-27細胞ERS實驗相同的TM刺激時長2 h，發現ERS標志物的表達在持續刺激組和間歇刺激組組間同時間點比較的差異無統計學意義，可得出與CAL-27細胞相同的結論，意味著可收集TM刺激2 h后不含TM的口腔癌細胞條件培養基供后續實驗。誘導MIN6細胞ERS實驗發現，MIN6細胞可以產生ERS現象。

TERS實驗發現，ERS的口腔癌細胞可將ERS傳遞給MIN6細胞，TERS導致MIN6細胞的胰島素合成減少，在翻譯水平抑制胰島素的合成。MIN6細胞的細胞凋亡實驗發現，TERS的MIN6細胞凋亡現象增加。MIN6細胞的克隆形成實驗發現，TERS的MIN6細胞增殖能力下降，這可能意味著TERS的胰島β細胞存活能力下降。MIN6細胞的分泌功能實驗發現，MIN6細胞的分泌功能下降。

在TERS實驗和MIN6細胞的分泌功能實驗中，MIN6細胞的胰島素合成在轉錄水平上調，在翻譯水平下調，胰島素分泌下調，這三者結果出現矛盾。內質網是加工分泌性蛋白質的主要場所，ERS引起了蛋白質分泌的變化；內質網和核糖體偶聯密切，是具有翻譯功能的機器，ERS抑制了蛋白質的合成，導致細胞內胰島素的減少；轉錄水平胰島素上調的現象，可能原因是ERS狀態下的胰島β細胞嘗試自我修復，加強負荷，代償性地在轉錄水平合成更多胰島素，具體機制尚不清楚，有待進一步的研究。

有研究表明，癌癥惡病質能降低參與胰島素分泌的相關胰島蛋白的表達。Violato等[21]研究發現，與對照組小鼠相比，在皮下接種實體艾氏腫瘤細胞的小鼠中，參與胰島素分泌不同通路的關鍵蛋白在胰腺中表達明顯減少。也有研究[22]表明，惡性腫瘤能抑制胰島素的分泌，與對照組相比，Walker 256荷瘤大鼠的胰島在受到葡萄糖刺激時，胰島素分泌減少。ERS可導致胰島β細胞衰竭，表現為胰島素分泌的喪失和因凋亡導致的胰島β細胞數量下降[23-24]。

關于是何種介質導致TERS現象的發生，有研究表明產生TERS現象的介質可能與外泌體有關。Javeed等[14]發現，胰腺癌將富含腎上腺髓質素的外泌體釋放到血液中，胰島β細胞攝入此類外泌體后會出現ERS，導致胰島素分泌障礙、胰島功能受損。本實驗初步探究了口腔癌細胞通過TERS對胰島β細胞功能的影響，為TERS的機制研究打下基礎，有一定臨床研究價值，在為口腔癌患者提供有效的治療策略以提高患者預后方面有一定的臨床意義。

本實驗存在一定的局限性。首先由于沒有公認的小鼠口腔鱗狀細胞癌細胞系和人的胰島β細胞系的限制，本實驗使用了人的口腔鱗狀細胞癌細胞系的CAL-27、SCC-25細胞和小鼠胰島素瘤6細胞系的MIN6細胞。MIN6細胞與胰島β細胞有共同的形態生理特征，當受到刺激時，它們會分泌胰島素并表達特定的UPR標志物，因此被廣泛用于研究[25]。前期研究發現，ERS的CAL-27、SCC-25細胞分別與相應同種細胞培養，后者能產生ERS；本實驗研究發現，ERS的CAL-27、SCC-25細胞上清加入MIN6細胞，后者也能產生ERS，這在一定程度上體現了TERS現象物種的保守性。其次，本實驗研究均為體外實驗，未進行體內實驗，實驗結果證據較弱，未來可通過對小鼠定期注射TM、TCM、CCM，記錄小鼠的體重、血糖、血清胰島素變化，以及用免疫組化法檢測ERS標志物和胰島素表達情況等實驗方法，進行進一步的研究。

綜上所述，本實驗發現了口腔癌細胞可通過TERS引起胰島β細胞應激，導致其凋亡增加，存活能力下降，合成及分泌胰島素能力下降，在研究口腔癌癥惡病質對胰島β細胞功能障礙中有一定的意義。

利益沖突聲明：作者聲明本文無利益沖突。