淺析代謝組學臨床血清及血漿樣本的采集與前處理方法

邱偉華，熊琴平，何志梅，夏立，呂尚

（1.江西省疾病預防控制中心，南昌 330029；2.江西中醫(yī)藥大學，南昌 330000）

代謝組學（Metabolomics）研究的主要內容是生物體系新陳代謝動態(tài)進程中代謝產物的變化規(guī)律以及應激后（用藥、患病等）代謝產物隨時間變化的情況，以期最終闡明生物體系的代謝途徑并揭示機體生命活動代謝本質[1]。代謝組學目前已經(jīng)成為了包括臨床診斷[2]、早期疾病監(jiān)測[3]、臨床不良反應監(jiān)測[4]、疾病生物標志物鑒定[5]、藥物作用機制研究[6]等領域的首選研究手段之一，病理變化可以通過組織和生物體液樣本中代謝物的異常變化來表現(xiàn)，臨床代謝組學的一般研究過程見圖1。

而在臨床代謝組學中，血液樣本是最常用的研究材料之一，其中主要包括血清和血漿[7]，而血液樣本（尤其是大批量血液樣本）的復雜性和多樣性便成為了代謝組學，尤其是非靶向代謝組學的一項重大挑戰(zhàn)。因此，血液樣本的質量對于有效的診斷和適當?shù)闹委煕Q定，以及可靠的、結論性的研究結果來說是至關重要的。大批量血液樣本的質量往往取決于高重復性的收集和處理標準操作程序（S tandard O perating P rocedures，SOP），一些血液樣本采集或處理過程中的不規(guī)范操作（如采血方式不準確、樣本運輸延遲、儲存溫度不適當）會極大的影響血液樣本的質量[8-11]。根據(jù)文獻報道，不規(guī)范、不準確的血液樣本前處理將會造成60%～80%的臨床代謝組學測試誤差[12-15]，但通常來說，人們往往會忽視血液樣本前處理方法，而把測試方法或儀器參數(shù)當做誤差的主要來源。更加重要的是，在進行代謝組學研究時，所使用的血液樣本類型、采集方法和前處理方法應保持一致，以此才能夠保證代謝組學分析的平行性和結果的科學性。

近年來基于代謝組學的血液樣本分析技術水平和應用范圍有較大提高和拓展[16]，應用包括研究人類疾病以定義病理生理過程和發(fā)現(xiàn)生物標志物、研究藥物毒性和療效、研究環(huán)境與基因型的相互作用(如營養(yǎng)基因組學，nutrigenomics)和脂質研究(脂質組學，lipidomics)[17]。但許多研究人員對樣本分析前的變量控制重視程度仍然不夠，這可能導致偶然誤差的增加，降低結果的可靠性和科學性，并且混淆最終的研究結果（如代謝輪廓模糊等）。因此，應該制定詳細實驗設計和規(guī)范血液樣本前處理SOP，并且嚴格執(zhí)行，以此確保能夠獲得可信的結果。本文對影響代謝組學研究的血液樣本分析前的變量進行了系統(tǒng)討論。此外，本研究還提出了關于血液樣本選擇、采集程序、前處理程序和存儲條件的建議，以供相關研究和SOP制定參考。

圖1 臨床代謝組學一般研究過程

1 血液樣本的選擇

血清和血漿樣本均被廣泛應用于靶向和非靶向代謝組學研究，兩者相似但不完全相同。血清是自然凝血過程后殘留的物質，其中的血細胞以及參與凝血的蛋白質已被清除；血漿是在用抗凝劑處理血液樣本以防止凝塊形成，通過離心除去細胞而得。這兩種從血液中去除細胞的方法將導致代謝組略有不同。就代謝輪廓來說，兩者的代謝物種類（峰數(shù)量）差異不大，而一些代謝物在兩者中的濃度（峰面積）差異較大。選擇血清或血漿開展代謝組學研究，取決于研究的目標代謝物類型以及檢測方法，如：液相-質譜聯(lián)用（Liquid Chromatography-Mass Spectrometry，LC-MS）、氣相-質譜聯(lián)用 （gas Chromatography-Mass Spectrometry，GCMS）或核磁共振 （Nuclear Magnetic Resonance，NMR）。實際上，無論檢測方法是LC-MS還是GCMS，血清和血漿樣本在由主成分分析（Principal Component Analysis，PCA）所得的得分圖上都有明顯不同[18-19]。Liu[20]等人以超高效液相-質譜聯(lián)用（Ultra Performance Liquid Chromatography-Mass Spectrometry，UPLC-MS)為檢測手段，對不同的血清和血漿樣本進行了代謝輪廓對比分析，在216個已鑒定的代謝物中，46%的代謝物水平存在顯著差異（P<0.05），只有3個代謝物（蛋氨酸、乙酰肉堿、丙酰肉堿）在血清中水平較低。顯然，血漿和血清的選擇必須基于實際考慮，然而，考慮到血漿和血清中可能存在的樣本組成差異，應注意確保在任何特定研究中只使用一種樣本類型。筆者總結了近3年以來血漿與血清在臨床代謝組學中的應用實例（見表1）。

1血漿與血清在臨床代謝組學中近三年的應用實例

2 血液樣本的采集

大批量、大規(guī)模代謝組學研究中最重要的一個部分就是正確的收集樣本集。臨床上采集血漿常用的抗凝劑有乙二胺四乙酸（EDTA）、枸櫞酸（檸檬酸）鹽以及肝素鹽等。其抗凝血機制分別為：（1）EDTA是通過與血液中的Ca2+形成配位化合物，從而抑制凝血活性；（2）枸櫞酸（檸檬酸）鹽是通過與血液中的Ca2+形成可溶性的螯合物，從而使Ca2+失去凝血作用；（3）肝素與血液中的抗凝血酶III結合后能增強其抗凝血活性，并且同時能降低絲氨酸蛋白酶的凝血活性，從而阻止血小板的聚集。相應的，以上三種抗凝劑的一般選擇原則為：（1）枸櫞酸鹽是機體內三羧酸循環(huán)（Tricarboxylic Acid Cycle，TAC）的中間產物，以其作為血漿抗凝劑會對代謝組學的測定結果造成干擾，如果研究內容包括與TAC相關的代謝通路和靶點，一般不建議選擇枸櫞酸鹽作為抗凝劑[46]；（2）EDTA（鹽）應用于NMR代謝譜時會產生很強的噪音信號[47]，而應用于LC-MS或GC-MS代謝組學分析時無此現(xiàn)象，因此在以MS作為代謝組學檢測平臺時，筆者建議以EDTA（鹽）作為血漿抗凝劑；（3）肝素是2種多糖交替連接形成的大分子多聚體，因此肝素鹽會在LC-MS代謝譜中產生嚴重的干擾信號[48-49]，但由肝素鹽作為抗凝劑采集的血漿將含有更多的代謝物。就目前來說，血漿代謝物研究應采用何種抗凝劑依然沒有明確的規(guī)范和建議。因此在收集血漿樣本之前，研究者應該綜合研究對象和檢測技術類型對抗凝劑特點和局限性進行全面考慮，使其能夠適用于整個研究過程，避免不必要的干擾。

血清樣本在臨床上的收集一般采用無添加劑（常規(guī)）和添加血清分離膠（快速）兩種方法。無添加劑采血時，全血經(jīng)過較長時間（30～60 min）自然凝固后析出血清；而添加血清分離膠（separate gel，高分子半固體疏水性膠體）與全血一同離心時，將形成三層：血清（上層）、血清分離膠（中層）及血細胞（下層）。如此，首先能夠有效的避免溶血以及凝血時間不一致對檢測結果帶來的干擾，其次能夠大大縮短樣本收集時間，提高效率和樣本品質。筆者將臨床所用的采血管（含凝血劑或促凝劑）總結歸納于表2。

3 血液樣本的前處理

表2 臨床采血管分類及適用范圍

血清或血漿樣本的基質比尿液等其它生物液體樣本更加復雜，尿液中的高分子量蛋白質的濃度要低得多。制備用于LC-MS或GC-MS分析的血清和血漿樣本包括去除高分子量成分的步驟，一般為添加有機溶劑或混合溶劑沉淀這些成分，然后離心分離沉淀物和含有代謝產物的上清（去蛋白化）。甲醇（或根據(jù)需求添加內標物質制成內標甲醇溶液）與樣品的體積比為4∶1時，在室溫(15～20℃)下具有高效的蛋白質去除效果[50]，且使用簡單，取其上清液可直接進行LC-MS分析；或取其上清液進行衍生化后進行GC-MS分析。常用的衍生化試劑有：MeOX （甲氧胺鹽酸鹽）[17，51]、MSTFA[N-甲基-N-（三甲基硅）三氟乙酰胺][17，52]、BSTFA[N，O-雙（三甲基硅）三氟乙酰胺][53]等。樣本與衍生化試劑的孵化時間、孵化溫度以及衍生化試劑加入量等條件將根據(jù)樣本和所用分析儀器的不同而有略微變化，用于非靶向代謝組學的孵化時間一般為各1.5小時，孵化溫度為60℃，衍生化試劑需加入過量[54-55]。

4 血液樣本的存儲條件

在制備血清和血漿后，應將一定量的樣本快速冷凍于-80℃，直至分析。Gika[56]等人對比研究了在-20℃和-80℃條件下生物樣本中代謝物的變化程度：-20℃和-80℃存儲的樣本在6個月后代謝物的組成與0天時相比沒有顯著的變化。但Pottala[57]等人報道了部分脂質組代謝物如DHA和EPA的濃度在-20℃下存儲3個月后會明顯降低。

樣本的穩(wěn)定性與每一種代謝物都相關，若將-80℃中的血液樣本直接置于室溫條件下，溫度的劇烈變化將會引起某些代謝物的變化。因此筆者建議血液樣本應在-80℃存儲前分裝，避免反復凍融（不超過3次為宜，且需冰面操作），最佳情況是每個受試者收集多份血清或血漿樣本，并僅使用一次。

5 結語及展望

5.1 臨床血液樣本的采集和預處理的規(guī)范性亟待加強 血清和血漿是綜合性的生物液體樣本，人體中許多不同部位的功能和表型都融合其中，可以體現(xiàn)為組織代謝的“代謝足跡”[56，58]。然而，這種綜合性可以稀釋來自身體特定部位的微小代謝變化，在這些情況下，組織樣本可能更加適合代謝物發(fā)現(xiàn)(如：肝臟用于肝病的代謝組學研究)。血清和血漿含有成百上千的代謝物，據(jù)估計，人類代謝組包含7800種代謝物，其中不包括許多與腸道微生物群、脂質和藥物代謝相關的代謝物[59]，因此可以反映機體內許多部位的代謝輪廓。

對于代謝組學檢測的樣本采集和處理方法，目前暫時沒有通用的指導性規(guī)范，因此筆者推薦采用以下血液樣本采集、預處理及存儲條件：選擇血清樣本或EDTA/肝素鋰抗凝血漿樣本；去蛋白化試劑:樣本體積比為甲醇∶樣本=4∶1；用于GC-MS非靶向代謝組學的孵化時間一般為各1.5小時，孵化溫度為60℃，衍生化試劑需加入過量；樣本應當提前分裝好，并置于-80℃冰箱存儲，盡量避免反復凍融（不超過3次），如需分析脂質組代謝物，須在3個月之內送檢。

5.2 應根據(jù)臨床代謝組學實驗的具體情況選擇采集血清或血漿樣本 筆者在總結了近3年以來血漿與血清在臨床代謝組學中的應用實例后發(fā)現(xiàn)，由于血漿樣本較血清樣本具有更多的代謝物信息與更好的重復性[60]，因此常常用于研究與疾病（包括疾病的不同病程）相關的生物標志物或代謝輪廓（代謝譜）；但由抗凝劑所引起的基質干擾也可能掩蓋血漿中某些濃度較低的代謝物[61-62]，故在研究臨床用藥或飲食干預后相關的生物標志物時，常常選擇整體靈敏度更高的血清樣本。因此，筆者建議在設計臨床代謝組學的實驗方案之初，應按照擬解決的關鍵科學問題和研究方向等實際情況，確定擬采集的臨床血樣種類，以此保證實驗結果的科學性。

5.3 人類臨床血液樣本的代謝組學研究正從小規(guī)模向大規(guī)模拓展 人類血液樣本的代謝組學研究通常有兩種不同的方式[17]：（1）小規(guī)模：在控制良好的實驗室或實驗環(huán)境中進行，在此條件下，試驗的隨機變量可控，并且相對極端（如：給藥、控制飲食等）。其優(yōu)勢是代謝組變化巨大，從而易于檢測和分析。此策略的樣本量可以很小，但結果仍然具有統(tǒng)計學意義。（2）大規(guī)模：分析平臺、方法和技術的快速發(fā)展使研究從小規(guī)模控制擴大到大規(guī)模，從短時間內分析幾十例樣本的代謝組，擴展到長時間內分析數(shù)百、上千甚至幾千例樣本的代謝組。這種規(guī)模的擴大需要在參與者對研究設計、樣本的收集和分析實驗的設計方面進行詳細規(guī)劃，以便發(fā)現(xiàn)受試者隊列中的細微差異，使后續(xù)的數(shù)據(jù)分析無偏倚且符合目的和要求。大規(guī)模人類臨床血液樣本代謝組學研究的特點是由不同個體間的生理機能、代謝狀態(tài)、生活習慣帶來的隨機變量多[63]且不易控制，這一特點對臨床樣本的采集和處理提出了更高的要求，也正是這一特點使得大規(guī)模人類臨床血液樣本代謝組學研究的結果具有更高的普遍性意義和實際參考價值。