水熱處理對黃豆秸稈體外發酵、甲烷生成及微生物的影響

周承福，汪水平，張佰忠，張秀敏，王榮，馬志遠，王敏

（1.西南大學動物科學技術學院，重慶 402460；2.湖南省畜牧獸醫研究所，湖南 長沙 410131；3.中國科學院亞熱帶農業生態研究所，亞熱帶農業生態過程重點實驗室，湖南 長沙 410125；4.白玉縣牧旺農業科技有限公司，白玉縣玉牧康源牧業有限公司，四川 白玉 627150）

黃豆（Glycine max）秸稈是世界上最豐富的農作物秸稈之一，產量大、成本低，可作為反芻動物的主要粗飼料來源。然而，黃豆秸稈緊密的纖維素-半纖維素（hemicellucose，HC）-木質素結構阻礙酶和微生物的接觸與降解，阻礙其在反芻動物飼糧中的應用［1］。因此，提高黃豆秸稈的瘤胃降解率，不僅有利于這一豐富農副產品的利用，也有助于緩解反芻動物優質飼草短缺的現狀。熱處理可有效破壞作物秸稈的木質纖維素結構［2］。蒸汽處理利用高壓蒸汽破壞木質素和HC之間的一些化學鍵，水解部分多糖，有利于瘤胃微生物的附著及酶的結合，進而提高秸稈的瘤胃降解率［3-4］。水熱處理（hydrothermal treatment，HT）是在高溫高壓條件下使水保持液體狀態，以水作為溶劑和催化劑破壞細胞壁結構，從而增加纖維素的可水解性［5］。與蒸汽處理相比，HT使水保持液態，從而可產生更多的溶解產物，并減少如糠醛和木質素化合物等不利降解產物的產生［6-7］。目前，HT廣泛應用于生物能源處理中［8-10］。但是，HT提高農作物副產品在反芻動物飼糧中的營養價值及潛力還有待探索。瘤胃發酵產生的甲烷是導致氣候變化的重要溫室氣體［11］。使用HT對黃豆秸稈進行預處理，可破壞細胞壁結構，促進糖的釋放；含糖量的增加可提高瘤胃微生物對底物的降解并促進丙酸產生，進而減少瘤胃甲烷生成［12］。此外，HT過程中產生的一些化合物，如可溶性木質素、糠醛和羥甲基糠醛，對產甲烷菌的生長有抑制或毒害作用，從而抑制甲烷的產生［7］。基于此，本試驗利用全自動體外模擬瘤胃發酵系統，研究HT對黃豆秸稈體外發酵、甲烷生成及微生物的影響，探究HT影響黃豆秸稈瘤胃降解率的機理，為科學開發和利用黃豆秸稈農副產品和有效緩解反芻動物優質飼草短缺的現狀提供技術支撐。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 黃豆秸稈和HT黃豆秸稈 本試驗在2020年3月進行，試驗所用黃豆秸稈來自中國安徽省。將收獲黃豆后的秸稈曬干，粉碎過0.425 mm篩。HT黃豆秸稈的制作主要根據Yu等［13］描述的方法進行：將40 g長度為1 cm的黃豆秸稈放入裝有200 mL水的密閉反應容器中，在飽和蒸氣壓下將固液混合物加熱到180℃，并用磁力攪拌器以500 r·min-1攪拌10 min；反應結束后，將固液混合物在30℃條件下烘干，再粉碎過0.425 mm篩。將黃豆秸稈和HT黃豆秸稈在室溫條件下保存于干燥器中，用于化學成分分析和體外模擬瘤胃發酵試驗。

根據Aoac［14］的方法測定發酵底物干物質（dry matter，DM）、有機物及粗蛋白質含量。根據Van Soest等［15］的方法測定中性洗滌纖維（neutral detergent fiber，NDF）、酸性洗滌纖維（acid detergent fiber，ADF）和酸性洗滌木質素含量，在NDF測定過程中加入穩定的耐熱α-淀粉酶。采用蒽酮法測定水溶性碳水化合物（water soluble carbohydrate，WSC）含量［16］。根據Yu等［17］的方法測定單糖和糠醛含量。

1.1.2 人工瘤胃培養液 3只健康、體重相近（25.0±2.0）kg且裝有永久性瘤胃瘺管的成年湘東黑山羊作為瘤胃液供體動物，單籠飼養，自由飲水。山羊飼喂精粗比為50∶50的全混合飼糧（TMR），粗料為稻草，精料由50%玉米（Zea mays）、19.8%麩皮、18.5%豆粕、3.0%黃豆油、1.2%碳酸鈣、1.1%氯化鈉、1.0%維生素和微量元素預混料組成。每天08：00和18：00分兩次等量飼喂，自由飲水。試驗當天，在晨飼前1 h，隨機從2只瘺管羊取得新鮮瘤胃液，迅速裝入保溫瓶帶回實驗室。人工瘤胃營養液的配制參照Menke等［18］的方法。將采集的瘤胃液用6層脫脂紗布過濾，量取600 mL的濾液迅速加入到準備好的2400 mL人工瘤胃營養液中（瘤胃液與人工瘤胃營養液體積比為1∶4），制成混合人工瘤胃培養液，其中整個過程的溫度保持在39.5℃，通入純二氧化碳以保持厭氧環境（以刃天青色變成無色來判斷）。以磁力攪拌器攪拌人工瘤胃培養液，以保持瘤胃液與營養液混合均勻。

1.1.3 全自動體外模擬發酵設備 本研究采用的全自動體外模擬瘤胃發酵設備，包括厭氧瓶、三通電磁閥、培養箱、壓力傳感器、計算機和氣相色譜儀［19］。培養箱設定：振蕩頻率50 r·min-1和培養溫度39.5℃。厭氧瓶通過導管與三通電磁閥和壓力傳感器連接。壓力傳感器與計算機連接，每分鐘測定并記錄瓶中壓力，通過壓力與氣體體積間關系計算氣體生成量。三通電磁閥受計算機控制，當厭氧瓶中壓力超過9 k Pa，電磁閥自動打開，厭氧瓶氣體釋放，并通過導管進入氣相色譜儀（安捷倫7890A，安捷倫公司，美國）測定排出氣體中的氫氣和甲烷含量。氫氣（甲烷）產量根據厭氧瓶頂部空間大小、壓力與氣體體積的轉化系數和氫氣（甲烷）含量進行計算［20］。

1.2 試驗方法

1.2.1 試驗設計 采用對照試驗設計，將黃豆秸稈和HT黃豆秸稈分別作為對照組和HT組。試驗分為3個批次，即3個重復，每批次內，每個處理做3個平行。

1.2.2 體外模擬瘤胃發酵試驗操作 稱取1.2 g底物于135 mL厭氧發酵瓶中。發酵前將所有發酵瓶置于振蕩頻率50 r·min-1和溫度39.5℃的培養箱中預熱。取出發酵瓶，通入二氧化碳以保證發酵瓶中為厭氧環境，用瓶口分液器向每個發酵瓶中加入60 mL人工瘤胃培養液，并將發酵瓶放入體外模擬瘤胃發酵設備中進行發酵，72 h后終止發酵，并采集固體、液體及微生物樣品進行測定。

1.2.3 樣品采集和分析［21-29］首先用p H計（Starter 300，上海奧豪斯儀器有限公司）對每個發酵瓶中的發酵液進行pH測定。然后將發酵瓶充分搖勻，取2 mL發酵液，15000 r·min-1和4℃下離心10 min，取1.5 mL上清液，加入0.15 mL 25%偏磷酸固定，靜置15 min后，-20℃保存。樣品在常溫條件下解凍，15000 r·min-1和4℃條件下離心10 min，取0.6 mL上清液裝于測定瓶中，在氣相色譜儀（安捷倫7890A，安捷倫公司，美國）測定揮發性脂肪酸（volatile fatty acids，VFA）組分［21］。再取2 mL發酵液，放入液氮中速凍，置于-80℃冰箱保存，用于微生物分析。試驗采用Qiagen公司的QIAamp DNA Stool Mini Kit試劑盒及按照試劑盒的說明書對微生物DNA進行提取。提取的DNA首先用微量紫外分光光度計（ND-1000）測定其核酸濃度（ng·μL-1）及純度（OD260nm/OD280nm），最后用0.8%凝膠電泳檢測其完整性，剩余的DNA置于-80℃保存。利用實時熒光定量PCR對總細菌、甲烷菌、真菌、原蟲、纖維降解菌群（白色瘤胃球菌、黃色瘤胃球菌和產琥珀酸絲狀桿菌）、甲烷菌群（甲烷桿菌目、甲烷短桿菌和甲烷微菌目）進行定量分析。使用的引物序列見表1，用1.8%凝膠電泳檢測PCR產物，數據結果以log10表示［22］。最后，剩余發酵液用0.441 mm的尼龍紗布過濾，置于105℃烘箱中烘干至恒重。根據底物重量和烘干之后的發酵底物重量，結合取樣過程中發酵液體積的變化，參考Zhang等［23］描述的方法計算DM降解率。

表1 微生物qPCR引物序列Table 1 M icrobial q PCR primer sequence

1.3 數據分析

1.3.1 計算公式 中性洗滌可溶液（neutral detergent soluble，NDS）與HC含量的計算公式分別是：NDS=100-NDF，HC=NDF-ADF［30］。

應用非線性軟件程序，按照Wang等［31］的模型對體外模擬瘤胃發酵產氣曲線進行擬合。模型及相關參數的計算公式如下：

式中：V為t時間點底物累積產氣量（mL·g-1），Vf為理論最大產氣量（mL·g-1），k為產氣速率（h-1），b為曲線形狀指標。

起始底物降解速率（FRD0，h-1），即t=0時的底物降解速率，計算公式參考Wang等［31］的模型，數學表達方程為：

式中：k為產氣速率（h-1），b為曲線形狀指標。

按照Wang等［20］的模型對體外模擬瘤胃發酵氫氣曲線進行擬合，模型及相關參數的計算公式如下：

式中：VFH為潛在最大氫氣產氣量（mL·g-1），bH和cH為形狀參數，kH為氫氣產氣速率（h-1），μH為氫氣消耗速率（h-1），lagH為滯留時間（h）。

根據Wang等［21］描述的公式，揮發性脂肪酸（volatile fatty acid,VFA）產氫效率（RNH2）為：

式中：Cac、Cbu、Cibu、Cpr、Cva、Civa及CVFA分別為乙酸、丁酸、異丁酸、丙酸、戊酸、異戊酸及VFA濃度。

1.3.2 數據處理 使用Excel 2007軟件進行試驗數據基本處理，采用SPSS 11.5軟件中的“比較均值”模塊進行獨立樣本T檢驗，P<0.05為差異顯著，P<0.01為差異極顯著，0.05≤P<0.10為有趨勢。

2 結果與分析

2.1 HT對黃豆秸稈化學成分變化的影響

由表2可知，與對照組相比，HT可提高（P<0.001）黃豆秸稈NDS（+66.5%）和WSC（+234%）含量，降低（P<0.001）NDF（-22.3%）、ADF（-10.2%）及HC（-87.7%）含量。此外，HT可提高（P<0.001）黃豆秸稈阿拉伯糖（+49.7%）、半乳糖（+45.3%）及木糖（+174.0%）含量，降低（P<0.001）葡萄糖（-78.6%）、鼠李糖（-30.8%）及果糖含量（-80.8%）。

表2 發酵底物化學組成和單糖含量Table 2 The concentrations of chemical compositions and monosaccharides for the fermentation substrates（g·kg-1，dry matter basis）

2.2 HT對黃豆秸稈體外降解與總產氣參數的影響

由圖1可知，HT對黃豆秸稈體外發酵總產氣量和總產氣速率有顯著影響。發酵0～6 h對照組和HT組產氣量差異不明顯，發酵6～72 h HT組產氣量均低于對照組；發酵0～18 h HT組產氣速率均低于對照組，發酵24～45 h HT組產氣速率均高于對照組，45～72 h對照組和HT組產氣速率差異不明顯。由表3可知，與對照組相比，HT提高黃豆秸稈DM降解率（P<0.001），降低每克DM產氣量（P<0.001）、每克可消化DM產氣量（P<0.001）、起始底物降解速率（P<0.05）。

表3 HT對黃豆秸稈72 h體外模擬瘤胃發酵底物降解與總產氣參數的影響Table 3 Effects of HT on the substrate degradation and the par ameter s of gas production of soybean str aw after 72 h in vitro ruminal incubation

圖1 HT對黃豆秸稈72 h體外模擬瘤胃發酵總氣體生成曲線的影響Fig.1 Effects of HT on the kinetic of total gas pr oduction of soybean straw after 72 h in vitro ruminal incubation

2.3 HT對黃豆秸稈體外甲烷與氫氣產氣參數的影響

由圖2可知，HT對黃豆秸稈體外發酵甲烷產量和甲烷生成速率具有顯著影響。發酵0～9 h HT組甲烷產量均高于對照組，發酵12～72 h HT組甲烷產量均低于對照組；發酵0～30 h HT組甲烷生成速率均低于對照組。由表4可知，與對照組相比，HT降低（P<0.001）黃豆秸稈每克DM甲烷產量、每克可消化DM甲烷產量、甲烷濃度、甲烷潛在最大產氣量及甲烷產氣速率。由圖3可知，發酵0～9 h HT組氫氣產量均高于對照組，發酵9～72 h HT組氫氣產量均低于對照組；發酵0～42 h HT組氫氣生成速率均低于對照組。由表4可知，與對照組相比，HT降低（P<0.001）黃豆秸稈每克DM氫氣產量、每克可消化DM氫氣產量、氫氣濃度、氫氣潛在最大產氣量及氫氣產氣速率。

表4 HT對黃豆秸稈72 h體外模擬瘤胃發酵甲烷和氫氣產氣參數的影響Table 4 Effects of HT on the par ameter s of methane and hydr ogen gas pr oduction of soybean str aw after 72 h in vitro r uminal incubation

圖2 HT對黃豆秸稈72 h體外模擬瘤胃發酵甲烷產量和生成速率曲線的影響Fig.2 Effects of HT on the kinetic of methane production of soybean straw after 72 h in vitro ruminal incubation

圖3 HT對黃豆秸稈72 h體外模擬瘤胃發酵氫氣產量和生成速率曲線的影響Fig.3 Effects of HT on the kinetic of hydrogen production of soybean straw after 72 h in vitro ruminal incubation

2.4 HT對黃豆秸稈體外發酵參數的影響

由表5可知，與對照組相比，HT可提高黃豆秸稈體外發酵TVFA（P<0.05）、丙酸（P<0.001）、丁酸（P<0.001）及戊酸（P<0.05）濃度，降低氨態氮（P<0.05）、乙酸（P<0.001）及異戊酸（P<0.001）濃度、乙酸/丙酸（P<0.001）及VFA產氫量（P<0.001）。

表5 HT對黃豆秸稈72 h體外模擬瘤胃發酵參數的影響Table 5 Effects of HT on the fer mentation parameter s of soybean straw after 72 h in vitro ruminal incubation

2.5 HT對黃豆秸稈體外發酵微生態的影響

由表6可知，與對照組相比，HT可減少黃豆秸稈體外發酵真菌（P<0.01）、原蟲（P=0.067）、產甲烷菌（P<0.05）及產琥珀酸絲狀桿菌（P<0.05）的數量。

表6 HT對黃豆秸稈72 h體外模擬瘤胃發酵微生物種群的影響Table 6 Effects of HT on the populations of major micr oor ganisms of soybean str aw after 72 h in vitro r uminal incubation（log10，copies·mL-1）

3 討論

HT主要利用高溫高壓條件下的水打斷木質素和HC之間的一些化學鍵，水解部分多糖，進而破壞秸稈木質纖維素結構［2，4］。本試驗發現，HT可顯著降低黃豆秸稈NDF、ADF及HC含量。Li等［8］和Jiang等［10］也發現，HT可破壞棉花（Gossypium herbaceum）秸稈和南荻（Miscanthuslutarioriparious）的抗逆性物質結構，大幅降低HC含量。秸稈纖維素-HC-木質素結構遭到破壞時，纖維素的聚合度降低，進而增加WSC含量［5，17］。Nitsos等［32］發現，HT可促進HC水解，進而提高WSC含量。本試驗發現，HT顯著增加了黃豆秸稈NDS和WSC含量。因此，HT可有效破壞黃豆秸稈的纖維結構，降低纖維含量，提高WSC含量。WSC包含葡萄糖、果糖、阿拉伯糖、木糖、半乳糖及鼠李糖等糖類物質。Lopez等［9］指出，HT可將葡萄糖、木糖、果糖等單糖脫水形成5-羥甲基糠醛、糠醛、糖酐及有機酸，從而降低葡萄糖、果糖和木糖含量。本試驗發現，HT顯著改變黃豆秸稈WSC的組成，降低葡萄糖、鼠李糖和果糖含量，增加阿拉伯糖、半乳糖和木糖含量。

本試驗中，HT顯著提高黃豆秸稈DM降解率，促進VFA生成。與纖維相比，發酵底物NDS和WSC更易于被瘤胃微生物降解［33-34］。Getachew等［35］指出，瘤胃VFA產量與飼糧WSC含量呈正相關關系。Zhang等［23］發現，尿素和硝酸鹽處理提高稻草NDS含量，進而提高稻草DM降解率和產氣量。因此，HT提高黃豆秸稈NDS和WSC含量，這可能是DM降解率和VFA產量增加的原因。飼糧較高WSC和較低NDF有利于瘤胃氨的利用并促進微生物蛋白合成，進而提高氨態氮的利用效率［36］。本試驗中，HT降低了發酵液氨態氮濃度，這可能也與黃豆秸稈WSC含量增加，促進了瘤胃微生物對氨態氮的利用有關。HT通過提高WSC含量促進了瘤胃微生物對黃豆秸稈的碳水化合物降解和氨的利用。

甲烷是瘤胃微生物發酵碳水化合物的產物之一，產量隨飼糧碳水化合物組成而變化。提高反芻動物飼糧淀粉水平或降低纖維含量，可降低甲烷產量［37］。Aguerre等［38］指出，奶牛甲烷排放量隨飼糧纖維水平的增加而增加。與纖維相比，WSC發酵的甲烷生成效率更低。本試驗發現，HT抑制瘤胃甲烷生成，每克DM甲烷產量、每克可消化DM甲烷產量和甲烷潛在最大產氣量都呈現明顯下降。氫分子是瘤胃內甲烷合成重要前體物，產甲烷菌主要利用氫還原二氧化碳產生甲烷［39］。未被利用的氫分子進發酵瓶頂端，并通過排氣釋放到大氣。本試驗發現，HT抑制瘤胃氫氣生成，每克DM氫氣產量和氫氣濃度都呈現明顯下降。Shima等［40］指出，瘤胃氫氣濃度會影響產甲烷菌甲烷合成酶的基因表達，從而改變甲烷產量。Patra［41］指出，可通過減少底物氫的產量或抑制甲烷菌的活性，來減少產甲烷菌對氫的利用，從而減少甲烷產生。HT可能通過降低黃豆秸稈NDF含量和提高可溶性糖含量，減少瘤胃氫和甲烷生成。

甲烷生成與飼糧碳水化合物結構和瘤胃發酵模式密切相關。瘤胃中80%的產甲烷菌主要以氫和二氧化碳為原料產生甲烷［39］，甲烷產量受氫產量的限制。Janssen［12］指出，丙酸生成伴隨著氫的消耗，而乙酸產生伴隨著氫的生成。瘤胃纖維素和HC降解有助于乙酸和甲烷生成，而瘤胃淀粉和WSC降解生成更多丙酸和丁酸，進而抑制甲烷生成［42-43］。Song等［36］指出，較高WSC和較低NDF有助于丙酸產生，并抑制乙酸生成。本試驗發現，HT提高發酵液丙酸和丁酸摩爾比例，減少乙酸摩爾比例。乙酸摩爾比例下降將減少氫的生成，進而降低VFA產氫效率。因此，HT改變瘤胃發酵模式，抑制乙酸生成，并促進丙酸和丁酸生成，降低VFA的產氫效率，進而抑制甲烷生成。

瘤胃內真菌、細菌、原蟲及甲烷菌是瘤胃內降解碳水化合物的主要菌群，其中，原蟲對植物細胞壁降解的貢獻率約占20%，而真菌和細菌約占80%［44］。HT降低發酵液原蟲、真菌及產琥珀酸絲狀桿菌基因拷貝數。HT促進黃豆秸稈纖維降解形成WSC，這使得HT后的黃豆秸稈NDF更難降解，進而抑制瘤胃內主要纖維降解微生物種群的增殖。另外，HT降低發酵液甲烷菌基因拷貝數，這可能與原蟲和真菌數量下降密切相關，因為瘤胃大部分甲烷菌附著在原蟲與真菌上［45］。盡管HT促進黃豆秸稈碳水化合物的瘤胃發酵，但通過增加未破壞纖維的瘤胃微生物降解難度，抑制纖維降解微生物種群和甲烷菌增殖。

4 結論

HT可破壞黃豆秸稈纖維素-HC-木質素結構，降低纖維含量，增加WSC含量，提高體外發酵DM降解率和VFA含量，促進碳水化合物的發酵。HT改變黃豆秸稈的瘤胃發酵模式，抑制乙酸生成，促進丙酸與丁酸生成，進而減少VFA產氫效率，抑制氫氣與甲烷生成。HT增加黃豆秸稈未破壞纖維的瘤胃微生物降解難度，抑制纖維降解微生物種群和甲烷菌增殖。總之，HT可成為提高黃豆秸稈碳水化合物瘤胃微生物降解效率和抑制甲烷生成的一種潛在策略，其用于反芻家畜生產的成本和效益仍需要進一步的試驗研究。