草地早熟禾Phosphate Starvation Response 2基因的克隆及表達分析

齊 欣， 李春月， 劉本松， 劉 博， 劉宇恒， 邸浩洋， 趙 迪， 金忠民

(齊齊哈爾大學生命科學與農林學院， 黑龍江 齊齊哈爾 161006)

磷(Pi)是植物生長和發育必需的大量營養物質，并介導許多生物過程[1]。磷是ATP、核酸或磷脂等分子的重要組成部分，在能量轉移、代謝調節和蛋白質激活中起著至關重要的作用[2-3]。干旱脅迫也是常見災害之一，干旱影響植物的生長，嚴重將會威脅植物的生存。草地早熟禾(PoapratensisL.)是多年生草本植物，冷季型草坪草，廣泛應用于北方及中部地區[4-5]。北方多砂質土壤，而在砂質土壤上建植的草坪植物最容易發生缺磷缺水的問題。草地早熟禾喜肥喜水，缺磷、缺水會導致植物萎蔫、葉片發紫、草坪生長變慢和草坪返青推遲等問題[6]。植物在長期的適應逆境脅迫中已經響應出一系列協調的應對措施，以保護、回收內部的磷，增強從外部環境中獲取磷的能力[7]，對干旱脅迫也產生了不同的生理生化策略[8]。因此了解草地早熟禾逆境脅迫下的轉運機制具有重要的理論和實踐意義。

磷饑餓響應轉錄因子屬于MYB-CC型轉錄因子[9]，其特征是含有一個保守的MYB DNA結合結構域和一個卷曲螺旋結構域[10]。轉錄因子作為感知信號和維持內環境穩定的樞紐在生物和非生物脅迫下對植物的調控中起著至關重要的作用[7]。改變或者修飾轉錄因子的表達是提高植物抗逆性的可行途徑[11]。PHR家族基因具有重要的轉錄調控作用，擬南芥PHR1結合序列存在于磷饑餓響應的結構基因啟動子中，這與其他MYB-CC家族成員的卷曲螺旋結構域在該蛋白中的存在一致，表明該蛋白在磷饑餓信號通路下游中發揮作用，能調控下游磷饑餓響應基因的表達[1]。目前，在玉米[12]、水稻[13]、二穗短柄草[14]等多個物種已在相應的全基因組水平上鑒定出PHR家族基因，在水稻中發現三種PHR1同源基因PHR1,PHR2和PHR3，三者構成一個網絡，在調節水稻的磷信號傳導和體內平衡中發揮重要作用[13]。在玉米中，PHR1已被分離并轉化到擬南芥中，過表達PHR1導致擬南芥在磷饑餓過程中代謝調節基因上調，促進了擬南芥的生長[15]。PHR2作為磷饑餓反應的中樞調節因子可正向調控下游的缺磷響應基因，調節植物的磷素信號及磷素穩態[16]。雖然，目前PHR基因在一些植物的功能分析方面取得了重大進展，但對于禾本科植物的PHR基因家族可獲得的信息不多[14]，尤其它在耐旱性方面的作用還沒有報道。鑒于MYB基因在小麥和其他植物中的耐旱性，我們假設MYB-CCPHR2基因也可能在草地早熟禾干旱脅迫中起作用，這可能有助于揭示植物逆境脅迫中的反應機制。

本研究以草地早熟禾為材料，克隆PHR2基因，并對其進行生物信息學分析，利用實時熒光定量PCR測定不同組織及不同磷濃度、干旱脅迫下的基因表達水平，為后續其功能驗證奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

選草地早熟禾‘午夜2號’為試驗材料，將材料置于光照培養箱中，溫度：25℃/15℃(晝/夜)，光照時長：12 h/12 h(晝/夜)，光照強度：500 μmol·m-2·s-1，相對濕度：60%。選取培養3個月以上的長勢優良且健康的植株，進行干旱處理與不同磷素濃度處理。(1)磷脅迫處理：將健康植株根部置于細沙中，將其根部置于細沙中每日澆灌1/2 Hoagland營養液，培養14 d后進行不同磷濃度處理(表1)，分別為0 mmol·L-1KH2PO4(無磷組)、0.01 mmol·L-1KH2PO4(低磷組)和1 mmol·L-1KH2PO4(適磷組)，處理21 d后取樣品進行后續試驗。(2)干旱處理：將健康植株放入10% PEG6000溶液中處理0 h，2 h，16 h后取樣進行后續試驗。

表1 不同磷濃度營養液Table 1 Nutrient solution with different phosphorus concentration

1.2 RNA的提取和cDNA制備

取長勢優良且健康的草地早熟禾植株，使用植物總RNA提取試劑盒(天根，DP432)提取植物總RNA，瓊脂糖凝膠電泳觀察RNA的完整性(圖1)，合格后將其置于-80℃保存。cDNA第一條鏈的合成參照HiScript?III 1st Strand cDNA Synthesis Kit試劑盒(諾維贊，R312-01)說明書進行操作，完成后置于-80℃保存。

圖1 草地早熟禾葉部RNA電泳圖Fig.1 Electrophoresis pattern of RNA isolated from the leaf of Poa pratensis L. plant

1.3 草地早熟禾PHR2克隆

根據NCBI GeneBank已公布的二穗短柄草PHR2(XM_ 00356 3139.4)，以及前期三代轉錄組測序數據為基礎，合成引物(PHR2-F:5′-TTGGCTAGCTACTACCAGCCTAG-3′PHR2-R:5′-CCAACACACTTCCATATGTAGGAAG T-3′)，以提取的草地早熟禾cDNA為模板進行PCR擴增。

1.4 草地早熟禾PHR2生物信息學分析

利用ExPASy-ProtParam(https://web.expasy.org/protparam/)工具在線分析該蛋白的氨基酸組成以及理化性質，利用ExPASy-ProtScale(https://web.expasy.org/protscale/)在線分析蛋白親/疏水性，TMHmmol/L Server v. 2.0(http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM)對編碼氨基酸的跨膜區分析，利用SignaIP4.1 Server(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)對信號肽進行預測分析，利用Netphos(http://www.cbs.dtu.dk/services/NetPhos/)對磷酸化位點進行預測分析，利用PSORT(https://www.psort.org/)進行亞細胞定位預測，SOPMA在線工具對蛋白二級結構進行預測分析，利用SWISS-MODEL(https://www.psort.org/)在線工具對蛋白三級結構進行預測，相關蛋白的保守基序分析使用MEME (http://meme.sdsc.edu)進行。

1.5 實時熒光定量PCR(qRT-PCR)分析

根據克隆得到的PHR2基因序列，設計并合成Real-time PCR引物PHR2-RT-F和PHR2-RT-R。以UBQ基因作為Real-time PCR內參，設計引物Q-UBQ-F:5′-AGAAGAAGACCTACACCAAG-3′和Q-UBQ-R:5′-GGTTGTAAGGCGTAGGTGAG-3′。分別提取未處理的根部、葉部RNA干旱處理的根部、葉部RNA以及不同濃度磷處理后葉部材料的RNA，以RNA為模板使用HiScriptTMIII 1 st Strand cDNA Synthesis Kit試劑盒(諾維贊，R312-01)反轉錄合成cDNA。使用ChamQTMUniversal SYBRTMqPCR Master Mix試劑盒(諾維贊，Q711-02)進行實時熒光定量PCR。每個處理進行三次生物學重復，利用2-ΔΔCt法處理相關數據[17]。

2 結果與分析

2.1 草地早熟禾基因的獲得及其生物信息學分析

以草地早熟禾‘午夜2號’葉片cDNA為模板，利用特異性引物進行PCR擴增出條帶(圖2)。由NCBI分析可知克隆獲得草地早熟禾PHR2基因，長度為1 288 bp，開放閱讀框序列1 080 bp，可編碼359個氨基酸序列(圖3)。

圖2 草地早熟禾PHR2的電泳圖Fig.2 Electrophoresis pattern of PHR2 isolated from Poa pratensis L.

圖3 草地早熟禾PHR2基因序列Fig.3 Sequence of PHR2 gene in Poa pratensis L.

2.2 草地早熟禾PHR2生物信息學分析

利用ProtParam在線工具分析可知，該基因分子量為39.06 KD，等電點pI為5.14，其蛋白質分子式為C1689H2 676N476O566S11，是不穩定蛋白。根據基因編碼氨基酸組成表可知(表2)，Ser含量較高，占12.30%。其中，表面帶負電荷氨基酸殘基(Asp + Glu)有46個，帶正電荷的氨基酸殘基(Arg + Lys)有32個。平均親水系數為—0.66，是親水性蛋白(圖4)。利用TMHmmol/L Server v. 2.0在線分析可知，草地早熟禾PHR2基因無跨膜結構(圖5)。SignaIP4.1 Server檢測發現該基因有信號肽的概率為3.74%(圖6)。經Netphos分析可知，該基因磷酸化位點包括25個Serine，6個Threonine，3個Tyrosine(圖7)。利用CELLO v.2.5進行亞細胞定位預測可知，該基因可能位于細胞核中。利用SOPMA在線工具對PHR2進行二級結構預測可知，其中含有28.13%的α-螺旋、62.67%的不規則卷曲、6.69%的延伸鏈和2.51%的β-轉角(圖8)。進一步利用SWISS-MODEL在線工具對其三級結構進行建模，結果與PHR2的二級結構預測相似(圖9)。

表2 草地早熟禾PHR2蛋白編碼氨基酸組成Table 2 The amino acid composition of PHR2 proteins in Poa pratensis L.

圖4 草地早熟禾PHR2蛋白編碼氨基酸的親水性分析Fig.4 Hydrophilicity analysis of PHR2 proteins in Poa pratensis L.

圖5 草地早熟禾PHR2蛋白跨膜區預測分析Fig.5 Prediction of transmembrane region of PHR2 proteins in Poa pratensis L.

圖6 草地早熟禾PHR2蛋白編碼氨基酸的信號肽分析Fig.6 Signal peptide analysis of PHR2 proteins in Poa pratensis L.

圖7 草地早熟禾PHR2蛋白磷酸化位點的分析Fig.7 Analysis of the phosphorylation site of PHR2 proteins in Poa pratensis L.

圖8 草地早熟禾PHR2蛋白的二級結構Fig.8 Secondary structure of PHR2 proteins in Poa pratensis L.

圖9 草地早熟禾PHR2蛋白的三級結構Fig.9 Tertiary structure of PHR2 proteins in Poa pratensis L.

CDD在線預測表明，草地早熟禾PHR2屬于SANT蛋白家族成員，在179-233和265-310氨基酸范圍內分別包含Myb_SHAQKYF(TIGR01 557)和Myb_CC_LHEQLE (pfam14 379)兩個結構域(圖10)。將多物種PHR2編碼氨基酸序列通過MEME的保守域預測進行比對發現MRWTPELHERFVDAVNLLGGSEKATPKGVLKLMKADN-LTIYHVKSHLQKY，GNFDLTEALRLQLELQK-RLHEQLEVQRSLQLRIEEQGKCLQIMJEQQCIP，SMLGYSDDVPGGNNLTGISPIAATDELAKQT-EWWTDFMNDDWK，EQYTNANPYNSQTPST-GSSSALNYGSQHGGFEPTFTDFPRDVGPTWC-PDP，STVAPJHGQFHPSTGSVGPLRSPPAVRF-SSVSN，TLDESFPRJPDAQNVLLERELRSTPLP-PHQ，ESQPQVGPPAQSSTSVHQSAAQQIVST-QSGEPSAVAAPSPSASSNTSKTR，LDASTSAEGSKLSSDPPESSTVKDVPENSQNGTTKQAES-GD，TARYRPELSEGSSERLAASKEEJPSIDLK，MERITTNQFYSSGIPVTVPSP 10個保守域序列(圖11)。利用MEGA7.0對多物種PHR2編碼氨基酸進行同源比對可知，草地早熟禾PHR2與節節麥、小麥、大麥、二穗短柄草同源性分別為89.32%，88.70%，88.53%，87.52%(圖11)。

圖10 PHR2蛋白功能結構域CDD預測Fig.10 prediction of functional domain CDD of PHR2 proteins

圖11 草地早熟禾PHR2蛋白的同源進化關系Fig.11 Homologous evolutionary relationship of PHR2 proteins in Poa pratensis L.

2.3 PHR2基因在不同部位及磷脅迫、干旱脅迫的表達分析

2.3.1不同組織部位中草地早熟禾PHR2基因的表達分析 本研究利用qRT-PCR方法測定草地早熟禾PHR2基因在不同組織中相對表達量，穗部PHR2基因相對表達量明顯高于其他部位，且穗部相對表達量為根部表達量的3倍，穗部>根部>葉部>莖部，表明PHR2基因表達水平存在組織特異性(圖12)。

圖12 草地早熟禾PHR2基因在不同組織中的表達分析Fig.12 Expression analysis of PHR2 gene in different tissues of Poa pratensis L plant注：圖中不同小寫字母表示在0.05水平差異顯著(P<0.05),三次生物學重復,下圖同Note:Different lowercase letters in the figure represent significant difference at the 0.05 level,three biological repetitions,the same as below

2.3.2磷素調控對PHR2基因表達水平的影響 草地早熟禾葉部經不同濃度磷溶液誘導處理21天后，利用qPCR對PHR2基因的表達水平進行檢測。結果表明：相對適磷組(CK)處理，PHR2基因相對表達量在不同磷濃度處理間呈現顯著差異。無磷及適磷處理時有利于PHR2基因的表達，低磷處理時該基因表達量最低，低磷組處理下表達量是無磷組處理下相對表達量的57.80%。綜上，推測草地早熟禾中PHR2基因對磷響應較為敏感(圖13)。

圖13 草地早熟禾PHR2基因在磷脅迫21天后的表達分析Fig.13 Expression analysis of PHR2 gene after 21 days of phosphorus stress

2.3.3干旱對PHR2基因表達水平的影響 利用10% PEG6000溶液進行草地早熟禾植株模擬干旱處理，采用qPCR技術對PHR2基因干旱脅迫下根部、葉部在不同干旱時間時的表達水平進行檢測。結果表明：經10%PEG 6000處理，PHR2基因在根部相對表達量隨干旱時間的增加呈現先降低后升高的趨勢，0 h>16 h>2 h。該基因在葉部相對表達量隨干旱時間的增加呈現逐漸下降的表達趨勢，0 h>2 h>16 h，但是0 h與2 h的差異不顯著，可見輕度未影響其表達(圖14)。干旱脅迫初期(2 h)，PHR2基因在葉部的相對表達量明顯高于根部，葉部是根部相對表達量的1.89倍，但是持續的干旱脅迫(16 h)又促進該基因在根中的表達，其在根中的相對表達量是葉部的2.88倍。綜上，干旱脅迫顯著影響PHR2基因在根部、葉部的表達水平。

圖14 草地早熟禾 PHR2基因干旱脅迫中的表達分析Fig.14 Expression analysis of Poa pratensis L. PHR2 gene under drought stress注：*代表(P<0.05)，三次生物學重復Note:*indicate significant difference at the 0.05 level,three biological repetitions

3 討論

磷饑餓響應轉錄因子PHR屬于MYB-CC基因家族，具有高度保守的與DNA結合的MYB結構域(Myb_SHAQKYF)和與二聚體形成的螺旋CC結構域(Myb_CC_LHEQLE)。是植物特有的轉錄因子，部分MYB-CC基因低磷誘導下可調控磷饑餓反應[18-19]。草地早熟禾PHR2定義為MYB-CC家族成員，含Myb_SHAQKYF和Myb_CC_LHEQLE特征序列，表明草地早熟禾PHR2基因具有典型的PHR家族基因特性和結構特征。草地早熟禾PHR2蛋白質結構分析表明，其二級結構以α螺旋和無規則卷曲為主的親水性蛋白，無信號肽和跨膜區域，此結果符合PHR轉錄因子特征與擬南芥[20]、水稻[21]中PHR1和PHR2基因結構具有相似性，在葉片中的表達模式十分相近，說明PHR1可能是PHR2的功能冗余基因，二者在調節植物的磷素內環境穩態中有相似的功能，為防止由于基因突變等情況而造成基因功能的缺失，以維持磷素穩態正常進行[22]。亞細胞預測定位結果顯示草地早熟禾PHR2基因位于細胞核中，這可能是由于大部分轉錄因子通過定位在細胞核中來轉錄激活或抑制下游基因表達的緣故[23-25]，后續可以利用亞細胞定位以及雙熒光素酶(Dual-Luciferase)實驗進行驗證。

磷是植物生長發育的主要礦質營養之一[26]。在適當磷肥水平下，植物也只能利用土壤中不到20%磷[27]。干旱是最常見的非生物脅迫之一，也是植物生長發育最重要的限制因子之一[28]。因此，植物必須進化出適應性策略應對逆境脅迫。磷饑餓響應轉錄因子PHR2基因是磷攝取和調節途徑的關鍵成員，其功能及作用機制研究是解析植物磷信號調控網絡的關鍵[29]。已有報道發現，PHR基因在水稻、二穗短柄草等植物所有組織部位中均有表達，表明它們可能在調節磷攝取和轉運方面重要作用[30-31]。本研究發現草地早熟禾PHR2基因存在組織表達特異性，穗部的表達量大于其他部位表達量，這與其他禾本科作物PHR基因的表達情況相似，如SiPHR1基因在穗中有較高表達，并在其他部位均有表達[8]。

磷脅迫與干旱脅迫都依賴于分子調控網絡，轉錄因子在其中起著重要作用。水稻中的PHR2基因在磷信號傳導中起核心作用，PHR2與PHR1,PHR3一起形成一個調控網絡，在調控水稻缺磷信號和缺磷穩態中起著不同的作用[32]。Meina Guo等[13]在水稻上的研究表明，PHR3和PHR1/2在缺磷條件下的mRNA表達水平存在差異，PHR3在缺磷條件下被誘導表達，PHR1和PHR2在植物正常生長過程中都轉錄，而PHR3只有在缺磷時才轉錄。但一些在非生物脅迫中發揮積極作用的基因可能對生長發育產生負面影響，過表達PHR2基因使水稻模擬磷饑餓時的響應途徑，誘導磷饑餓響應基因的表達。Zhou等[29]研究發現，磷含量低于抑制植物生長的毒害水平會出現抑制植物生長的情況。本研究中草地早熟禾PHR2基因的相對表達量在不同磷濃度處理間呈現顯著差異，無磷條件下相對表達量最高，說明草地早熟禾中PHR2基因對磷信號傳導較為敏感。在10% PEG6000處理下，PHR2基因在根中相對表達量隨時間的增加呈現先降低后升高的趨勢，而在葉中相對表達量隨時間的增加呈現逐漸下降的表達趨勢，說明草地早熟禾PHR2基因抵御干旱脅迫時在不同部位可能存在不同的轉錄調控機制。由于草地早熟禾中PHR2基因的相關報道較少，所以PHR2基因在禾本科植物逆境脅迫中的分子機制仍有待進一步研究。

4 結論

草地早熟禾PHR2基因，屬于MYB-CC型轉錄因子。研究發現，草地早熟禾中PHR2基因對磷信號傳導較為敏感，在抵御干旱脅迫時在不同部位存在不同的轉錄調控機制。因此，PHR家族基因在逆境脅迫中具有重要意義。