不同秋眠型苜蓿頂芽中特異表達蛋白篩選及其功能鑒定

杜紅旗， 婁治國， 鄒 靖， 房衛平， 馮長松*

(1.河南省農業科學院畜牧獸醫研究所，河南 鄭州450002； 2.河南省農業科學院經濟作物研究所， 河南 鄭州 450002；3.河南省信陽市畜牧工作站， 河南 信陽464000)

秋眠性是指從夏末至秋季由于日照長度縮短和溫度下降，紫花苜蓿(MedicagosativaL.)植株表現為緩慢匍匐生長或停止生長的一種特性。根據苜蓿秋眠特定時期刈割后植株的再生高度，將其分為秋眠型苜蓿、半秋眠型苜蓿、非秋眠型苜蓿和極不秋眠型苜蓿[1-3]。在秋季，秋眠型苜蓿生長變緩慢、葉變小、莖變纖細，但具有較強的抗寒性和高的越冬率；相反，非秋眠型和極不秋眠型苜蓿在秋季依然生長旺盛，但抗寒性差[4-5]；半秋眠型苜蓿介于二者之間。

關于苜蓿秋眠性的發生機理開展了大量研究。目前普遍認為調控紫花苜蓿秋眠性的主要環境因子是光周期和溫度[6-7]，其中光周期是誘導秋眠性的關鍵因子[8]。苜蓿根系的生長狀態、根系和根頸中可溶性糖的積累以及根和芽中氮素化合物的分解代謝可能參與苜蓿秋眠的發生[9-13]，苜蓿秋眠性與抗寒性呈顯著正相關關系，但是二者是兩個獨立性狀，苜蓿秋眠性與其適應性和生產性能有較大關系[14-16]，并且認為光敏色素、隱花色素2B、脫落酸、生長素等可能參與秋眠性的調控[8，17]。在苜蓿秋眠分子機理研究方面，2000年Douglas等人確定了控制秋眠型苜蓿秋季生長的基因組區域，但是該區域具體的核苷酸序列還未知[18]。王成章等應用高通量測序技術得到了大量的調控苜蓿秋眠的候選基因、蛋白和microRNAs，并且選出了重要候選調控基因和蛋白[19-22]。

高通量分析技術是基于計算在每個樣本中均檢測到的基因和蛋白相對含量來篩選樣本間差異基因和蛋白，這樣會遺漏一組樣本中特異性表達而在其它組樣本中不表達的基因和蛋白，也可能遺漏一組樣本中高表達而在其它組樣本痕量表達(通量分析技術檢測不到)的基因和蛋白，因此為彌補這些遺漏，本研究通過檢測秋眠1級苜蓿‘Maverick’和9級苜蓿‘Cuf101’頂芽中的蛋白在對方蛋白質組中是否存在來篩選各自特異表達的蛋白，應用熒光定量PCR技術檢測春夏秋季兩種苜蓿頂芽中蛋白mRNA相對表達量,了解其特異表達情況，以及通過建立特異表達蛋白過表達和沉默轉基因植株觀察其表型變化研究它們在苜蓿生長和秋眠中的作用。本研究豐富了苜蓿秋眠性理論，也為苜蓿分子育種提供功能基因和理論基礎。

1 材料與方法

1.1 秋眠時期‘Maverick’和‘Cuf101’頂芽中特異性表達的蛋白篩選

基于前期秋眠時期‘Maverick’和‘Cuf101’頂芽蛋白質組結果[22]，將秋眠1級苜蓿‘Maverick’的3個樣品的中蛋白進行兩兩比較，取兩兩比較的交集作為其蛋白集合(‘Maverick’的3個樣品中至少有2個樣品中存在的蛋白)；同理，對秋眠9級苜蓿‘Cuf101’的3個樣品也分別進行兩兩比較，取兩兩比較的交集作為其蛋白集合；然后對兩個蛋白集合進行比較得到它們各自特有蛋白。

1.2 RNA提取、反轉錄和實時熒光定量PCR

在2015年7月8日、18日、28日，8月7日、18日，9月1日、12日、23日取美國苜蓿標準秋眠1級品種‘Maverick’和秋眠9級品種‘Cuf101’頂芽，每5株苜蓿作為一個生物學重復，7月8日、18日、28日取樣在一個生長期內(C1)，8月7日、18日取樣在一個生長期內(C2)，9月1日、12日、23日取樣在一個生長期內(C3)。所有樣品取樣后立刻放于液氮中，到實驗室儲存于-80℃冰箱[22]。

根據特有蛋白和內參基因gapdh基因序列,應用primer5.0軟件按照熒光定量引物設計原則設計它們的熒光定量引物(表1)，樣品總RNA按照植物提取試劑盒操作說明(Takara Bio,Inc.)提取，應用Nano2000核酸檢測儀器(ThermoFisher Scientific,Waltham,MA,USA)檢測各樣品RNA的濃度，并調至同一濃度，嚴格按照TAKARA公司反轉錄試劑盒的說明書上操作步驟對各樣品的總RNA反轉錄。采用SYBR Green Supermix(ROCHE)在LightCycler96熒光定量PCR儀(ROCHE)上檢測各樣品中各特異蛋白mRNA相對表達量，數據通過gapdh基因的Ct值來均一化。

表1 檢測候選特異蛋白mRNA相對表達量的引物Table 1 Primers used to detect mRNA relative expression abundance of candidate protein

1.3 統計學分析

采用2-ΔΔCt公式計算各特異蛋白mRNA相對表達量，用平均值±標準差表示[23]。應用SPSS19.0(IBM Corp.,USA)軟件對所測數據進行統計學分析。應用One-way ANOVA方法分析同一品種苜蓿三個生長周期間頂芽中各特異蛋白mRNA相對表達量的差異顯著性,以及三個生長期間兩品種頂芽中各特異蛋白mRNA相對表達量的差異顯著性，并應用GraphPad prism 5(GraphPad Software,Inc.,USA)軟件對各數據進行線型圖的制作。

1.4 過表達和沉默載體構建、工程菌和轉基因植株的建立

應用內切酶將特異蛋白基因的CDS區與過表達載體pCAMBIA3301構建各自的過表達重組載體，選取CDS區約500 bp序列與沉默載體系統(pHANNIBAL和pART27)構建各自的沉默重組載體，按照農桿菌轉化方法將各自的過表達、沉默重組載體和空載體轉入農桿菌LBA4404感受態細胞，分別獲得各自過表達和沉默工程菌株。以RBP47C基因為例展示構建過表達和沉默載體結構簡圖(圖1和圖2)，紅色片段是目的基因的位置。

圖1 RBP47C過表達載體結構簡圖Fig.1 Structural diagram of RBP47C overexpression vector

圖2 RBP47C沉默載體結構簡圖Fig.2 Structural diagram of RBP47C silencing vector

過表達工程菌株和空載體菌株侵染秋眠9級苜蓿‘WL903’(非秋眠型苜蓿品種)子葉節節點受傷幼苗，各自沉默工程菌株和空載體菌株侵染秋眠2級苜蓿‘伏納爾’子葉節節點受傷幼苗，轉入MS固體培養基中并在溫度24℃，16 h光照條件下培養，待主根長至5 cm和至少出現5根須根時，即可將幼苗轉至營養土中繼續在溫度24℃，16 h光照條件下培養。幼苗長成良好植株后，首先應用植物基因組DNA提取試劑盒提取最終成活的植株的基因組DNA，以各植株的基因組DNA為模板，應用載體上的Bar基因和nptII基因引物進行PCR鑒定，得到陽性的轉基因苗，待轉基因陽性苗、空載體對照苗完全成活并長成良好植株后刈割，刈割后10 d觀察植株表型。同時，未侵染的兩苜蓿品種野生型植株按照上述培養過程培養用于表型比較。

苜蓿子葉節節點受傷幼苗準備步驟：挑選優質飽滿的苜蓿種子直接在濾紙上萌發，要求加入無菌水保持濾紙濕潤。約4 d后，即真葉出現之前，在超凈工作臺中用滅菌手術刀從子葉節節點處切除1片子葉，獲得子葉節節點受傷幼苗，將剩余的幼苗放于50 mL無菌水中，加入農桿菌工程菌液0.5 mL并在28℃，100 rpm振蕩器中侵染1 h，侵染后用鑷子將幼苗取出，并置于無菌干燥濾紙上吸干工程菌液后，將侵染后的幼苗轉入MS固體培養基中，并在溫度24℃，16 h光照條件下培養，待主根長至5 cm和至少出現5根須根時期，將幼苗轉至營養土中繼續在溫度24℃，16 h光照條件下培養[24]。

2 結果與分析

2.1 ‘Maverick’和‘Cuf101’苜蓿頂芽中各自特異表達蛋白

經過特異表達蛋白分析發現,在秋季‘Maverick’苜蓿頂芽特異性表達的候選蛋白包括：酪氨酸/多巴脫羧酶(AES81613)、聚腺苷結合蛋白RBP47C (KEH40057)和乙二醛酶/博萊霉素抗性蛋白/雙加氧酶(KEH32483)；‘Cuf101’苜蓿頂芽特異表達的候選蛋白包括：S-腺苷甲硫氨酸依賴甲基轉移酶(AET04140)、假設蛋白AES61470。

從未秋眠至秋眠過程中，mRNA相對表達量檢測結果表明：在秋季‘Maverick’苜蓿頂芽中聚腺苷結合蛋白RBP47CmRNA相對表達量較春夏季‘Maverick’苜蓿和春夏秋季‘Cuf101’苜蓿頂芽中的均顯著升高(圖3)，從夏末至秋季,‘Cuf101’苜蓿頂芽中假設蛋白AES61470 mRNA相對表達量顯著高于‘Maverick’苜蓿頂芽中的相對表達量(圖4)。

圖3 7—9月份兩苜蓿品種頂芽中RBP47C蛋白mRNA相對表達量Fig.3 mRNA relative expression abundance of RBP47C in‘Maverick’and‘Cuf101’varieties apical buds from July to September注：#代表‘Maverick’苜蓿頂芽中RBP47C蛋白mRNA相對表達量顯著高于‘Cuf101’苜蓿頂芽中的相對表達量(P<0.05)；*代表9月份‘Maverick’苜蓿頂芽中RBP47C蛋白mRNA相對表達量顯著高于7,8月份時的相對表達量(P<0.05),誤差線表示標準偏差(SD)Note:# indicate that RBP47C mRNA relative expression abundance in apical buds of‘Maverick’alfalfa at September is significant more than that in apical buds of‘Cuf101’alfalfa at July,August,September at the 0.05 level,* indicate that RBP47C mRNA relative expression abundance in apical buds of‘Maverick’alfalfa at September is significant more than that at July,August at the 0.05 level. Error bars indicate standard deviation (SD)

圖4 7—9月份兩苜蓿品種頂芽中假設蛋白AES61470 mRNA相對表達量Fig.4 mRNA relative expression abundance of hypothetical protein AES61470 in‘Maverick’and‘Cuf101’varieties apical buds from July to September注：#代表‘Maverick’苜蓿頂芽中假設蛋白AES61470 mRNA相對表達量顯著低于‘Cuf101’苜蓿頂芽中的相對表達量(P<0.05),##代表‘Maverick’苜蓿頂芽中假設蛋白AES61470 mRNA相對表達量極顯著低于‘Cuf101’苜蓿頂芽中的相對表達量(P<0.01),誤差線表示標準偏差(SD)Note:# indicate that the hypothetical protein AES61470 mRNA relative expression abundance in apical buds of‘Maverick’alfalfa is significant less than that in apical buds of‘Cuf101’alfalfa at August at the 0.05 level,## indicate that the hypothetical protein AES61470 mRNA relative expression abundance in apical buds of‘Maverick’alfalfa is very significant less than that in apical buds of‘Cuf101’alfalfa at July and September at the 0.01 level. Error bars indicate standard deviation (SD)

2.2 特異蛋白功能鑒定

由圖5、圖6所示，聚腺苷結合蛋白RBP47C過表達的非秋眠型苜蓿品種‘WL903’植株株高顯著(P<0.05)低于空載體對照和野生型植株株高，莖較細，葉片較小(圖5)；RBP47C沉默的秋眠型苜蓿品種‘伏納爾’植株株高顯著(P<0.05)高于空載體對照和野生型植株株高，莖較粗(圖6)。

圖5 RBP47C過表達‘WL903’陽性植株與陰性植株表型比較Fig.5 Comparison of phenotypes betweenRBP47C overexpression positive‘WL903’plants and negative plants

圖6 沉默RBP47C‘伏納爾’植株與陰性植株表型比較Fig.6 Comparison of phenotypes between RBP47C silenced‘Vernal’plants and negative plants

3 討論

植物具有適應環境的能力，蛋白質是生命活動的最主要載體，更是功能的執行者，隨著四季的變換、環境的變化，植物體內蛋白質種類、數量都會隨著改變。秋眠性是指從夏末至秋季由于日照長度縮短和溫度下降，紫花苜蓿植株表現為緩慢匍匐生長或停止生長的一種特性。依據不同苜蓿品種在從夏末至秋季生長適應性表現不同將其分為不同的秋眠型苜蓿，在秋眠時期不同秋眠型苜蓿體內存在特異表達的蛋白和表達量差異的蛋白，秋眠型苜蓿和非秋眠型頂芽中也存在差異表達和特異表達的蛋白。由于目前常規高通量測序技術是基于蛋白相對含量的差異來篩選差異蛋白，所以特異表達的蛋白就會被遺漏。本研究結果表明，秋眠型苜蓿‘Maverick’的RBP47C蛋白在秋眠時期頂芽中特異表達，假設蛋白AES61470在‘Cuf101’苜蓿頂芽中較‘Maverick’苜蓿特異表達，這些結果驗證常規高通量定量分析差異蛋白確實存在遺漏，而且驗證了在秋季秋眠型苜蓿和非秋眠型頂芽中確實存在特異表達的蛋白。

RBP47C蛋白屬于核蛋白中的Polyadenylate-binding proteins (PABs) 家族蛋白。PABs可影響植物的表型和環境抗性，過表達聚腺苷酸結合蛋白的植物的環境脅迫抗性和種子生產力較強[25]。本研究通過轉基因技術對其進行功能驗證表明：秋眠型苜蓿‘伏納爾’品種沉默RBP47C后的植株較對照植株生長速度顯著加快、植株高度極顯著增高，非秋眠型苜蓿‘WL903’過表達RBP47C后的植株較對照植株生長速度顯著變慢、植株高度極顯著變矮，所以推測RBP47C的高表達促進苜蓿的秋眠。Li等研究表明酵母Pab1p在煙草(NicotianatabacumL.)中過表達可較強抑制植株的生長[26]，該結果與本研究結果一致。

PABs是高度保守RNA結合蛋白，它們特異性的結合mRNA 3′端聚腺嘌呤尾巴，參與基因翻譯的起始、poly(A) 縮短[27]，參與決定細胞核中mRNA 3′端poly(A) 的長度[28-29]。煙草RBP47含有三個RBD型RNA結合結構域和富含谷氨酰胺的N-末端，它的兩個RBD型RNA結合結構域對于RBP47與RNA的相互作用是必需的[30]；擬南芥(Arabidopsisthaliana)的RBP47與poly(A)+RNA形成有關[31]，因此推測RBP47C調控苜蓿秋眠性是通過調控其靶基因成熟mRNA的含量發揮作用的。

另外，PABs都作用于mRNA 3′端聚腺嘌呤尾巴，但是這些PABs氨基酸序列、結構和功能有差異，它們各自作用的mRNA不可能相同，所以推測它們特異作用于某些mRNA，并且特異性是由各個PABs的氨基酸組成和mRNA 3′端最后數位核苷酸的組成不同導致的，但是目前RBP47C是否有特異性作用的mRNAs尚未見研究報道，值得進一步研究。

4 結論

不同秋眠型苜蓿在秋眠時期具有其特異表達的蛋白，RBP47C 蛋白在秋眠苜蓿頂芽中特異表達，假設蛋白AES61470在非秋眠苜蓿頂芽中特異表達；RBP47C 蛋白高表達促進了苜蓿的秋眠、低表達加快了苜蓿的生長。