舟葉橐吾浸提液對三種牧草種子萌發及幼苗生長的影響

王 輝， 馬向麗， 另如貴， 張 燕， 任 健， 代微然

(1.云南農業大學動物科學技術學院， 云南 昆明 650201； 2.云南農業大學科學技術處， 云南 昆明 650201)

香格里拉位于青藏高原東緣，地處云南西北部，草地資源豐富，是云南的主要牧區，擁有可利用草地面積24.9萬hm2，當地農牧民以飼養牦牛、犏牛、高原黃牛等草食家畜為主，草地畜牧業是當地農牧民的重要家庭經濟來源。在香格里拉，高山草甸主要分布在海拔 3 200～3 900 m，作為冬春季牧場和過渡性牧場放牧利用[1]。長期以來，受人為和自然因素影響，香格里拉亞高山草甸優良可食牧草銳減，狼毒(StellerachamaejasmeLinn.)、西南鳶尾(IrisbulleyanaDykes.)、舟葉橐吾(Ligulariacymbulifera(W. W. Smith) Hand.-Mazz.)等惡性雜草大量滋生，使得草原可食牧草產量嚴重下降，草地退化嚴重。如何減輕草地退化是當地農戶和廣大畜牧工作人員面臨的問題。

化感作用是指一個活體植物通過向環境釋放自身產生的某種化學物質來影響周圍植物的種子萌發和生長發育[2-3]，有利于近緣種或單一種的生長。化感作用能提高自身競爭能力，對種子萌發和幼苗生長的作用效果是不可逆的[4]。化感物質幾乎存在于所有植物及其組織中，如葉、莖、根、花、種子、樹皮和芽[5]。學者們針對牧草的化感作用進行了許多研究。牛歡歡等[6]研究發現光葉紫花苕(ViciaSativaL.)浸提液對白三葉(TrifoliumrepensL.)的化感作用強于多年生黑麥草(LoliumperenneL.)，且濃度增加抑制作用增強；而白三葉高濃度浸提液對多年生黑麥草和鴨茅(DactylisglomerataL.)生長同樣具有顯著的抑制作用，低濃度則表現為無影響或促進作用[7-8]。有研究進一步發現豆科牧草對多花黑麥草(L.multiflorumLam.)的化感作用存在顯著的種間差異，且豆科牧草的化感物質使得多花黑麥草幼苗生長發育受到抑制[9]。自然界中存在的化感物質主要來源于植物產生的次生代謝物質[10]，有酚類、萜類、糖和糖苷類、生物堿和非蛋白氨基酸等[11]。植物化感作用通常是幾個或幾類次生代謝產物綜合作用的結果[12]，往往是一種植物抑制或刺激其它植物種子的萌發、幼苗的生長發育[5,13]。化感作用的物質一般通過雨水沖刷、淋溶、揮發、根分解等方式進入到地表或者土層中，進而對周圍植物產生一定的影響[14]。

舟葉橐吾，又名船型橐吾，是菊科(Compositae)橐吾屬(Ligularia)的一種多年生草本植物，根肉質多數，莖直立，舌狀花黃色，管狀花深黃色[15]。在香格里拉退化草地上，往往舟葉橐吾是單一優勢植物，其它植物稀少，有研究認為這是因為化感作用有利于自身或親緣關系近的植物共存[4]。目前有關舟葉橐吾的研究主要集中在對化學成分及生物活性的研究，而關于舟葉橐吾對牧草的化感作用研究較少。在滇西北利用重度退化草地建設人工草地時，不可避免地會遇到受到橐吾泛濫的問題，為此本研究以當地廣為利用的白三葉、多年生黑麥草及鴨茅作為受體牧草，探討舟葉橐吾不同濃度地上部和根部浸提液處理對豆科和禾本科牧草種子萌發、幼苗生長的影響，了解舟葉橐吾的化感效應，為牧草種植、退化亞高山草甸改良提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

2019年8月末從云南省迪慶藏族自治州格咱屬都湖尼嘎牧場(27°57′50″ N，99°56′04″ E)樣地上隨機采集長勢基本一致的舟葉橐吾，植株處于生長旺盛期，尚未開花。樣地海拔3 658 m，屬低緯度高海拔地區，氣候類型屬寒溫帶山地季風氣候，秋冬長而春夏短，年平均氣溫5.4℃，最熱月份(7月)月均氣溫13.2℃，最冷月(1月)月均氣溫-3.8℃。由于長年過度放牧，舟葉橐吾在樣地上大量生長，并成為優勢種，這在滇西北亞高山草甸具有一定的代表性。該地區土壤pH值5.8，有機質碳含量3.25%，有機質含量5.73%，堿解性氮含量13.2 mg·kg-1，速效磷含量27.2 mg·kg-1，速效鉀含量265.9 mg·kg-1。

供試的白三葉(品種：‘海發’)、多年生黑麥草(品種：‘麥迪’)、鴨茅(品種：‘德娜塔’)種子由北京正道公司提供。

1.2 試驗方法

1.2.1不同部位舟葉橐吾水浸提液的制備 實驗室內將植株分為地上部分(包括莖、葉)和根，在102℃殺青半小時后，在60℃烘箱中烘干至恒重，打粉機粉碎制樣，分別稱取100 g，加入1 000 mL超純水浸泡48 h，經雙層紗布過濾后，濾液4 000 r·min-1離心5 min，取上清液作為母液(濃度為100 g·L-1)。分別量取地上部和根部母液25，50，75 mL于100 mL容量瓶中，定容，配制成相當于原舟葉橐吾質量濃度為0.025，0.050和0.075 g·mL-1的地上部浸提液和根部浸提液[16](此濃度梯度的設置基于預試驗)，置于4℃的冰箱備用。

1.2.2種子萌發 在人工氣候箱中利用培養皿濾紙法進行種子萌發試驗，人工氣候箱白天溫度為(25±1)℃，夜晚溫度為(20±1)℃，每天光照12 h，黑暗12 h，光強為4 000 lx，濕度為70%。在鋪有兩層濾紙培養皿(直徑9 cm)中均勻放入50粒飽滿的牧草種子，每兩天分別加入0.025(低濃度)、0.05(中濃度)和0.075(高濃度)g·mL-1的水浸液6 mL，CK組加入等量蒸餾水，每個處理設置3個重復。每天統計各處理組發芽種子數，培養25 d后，每天記錄種子發芽數，發芽試驗以種子連續3 d不再萌發的時間為末次計數時間[16]。

1.3 測定指標

苗高、根長：在幼苗培養20 d后用直尺測量幼苗苗高、根長，隨機抽取10株。

發芽勢(Germination potential，GP)=規定天數內發芽種子數/供試種子數×100%(白三葉為發芽第4天的發芽種子數；多年生黑麥草為發芽第5天的發芽種子數；鴨茅為發芽第7天的發芽種子數)[8,17-18]。

發芽率(Germination rate，GR) = (發芽種子數/供試種子總數)×100%。

發芽指數(Germination index，GI)=∑(Gt/Dt)，Gt為第t日內的發芽數,Dt是相應的發芽天數。

化感效應指數(Allelopathic response index，RI)=1-C/T(T≥C)或RI=T/C-1(T 0時，表示促進作用；當RI< 0時，表示抑制作用；RI絕對值的大小代表化感作用強度[19]。

綜合化感效應指數(Synthetic effects of allelopathic index，SE)反映化感效應的強弱，是指同一處理下對同一受體各測定項目化感效應指數(RI)的算術平均數。

1.4 葉片成分的非靶向測定

取舟葉橐吾新鮮葉片0.1 g置于5 mL EP管中，加入1 000 μL預冷提取液(甲醇氯仿體積比=3∶1)，再加入1 000 μL乙酸乙酯，加入5 μL核糖醇，渦旋30 s；加入鋼珠后，35 Hz研磨儀處理4 min，將樣本4℃離心，10 000 r·min-1離心15 min，進行代謝物的提取。隨后，提取物通過一系列處理后，注入Agilent DB-5MS毛細管柱(30 m×250 μm×0.25 μm,J&W Scientific，Folsom，CA，USA)，在Agilent 7890氣相色譜-飛行時間質譜聯用儀(GC-TOF-MS)進行檢測(表1)。使用ChromaTOF軟件(V 4.3x，LECO)對質譜數據進行了峰提取、基線矯正、解卷積、峰積分、峰對齊等分析。

表1 GC-TOF-MS具體分析條件Table 1 Specific analysis conditions of GC-TOF-MS

1.5 數據分析

利用SPSS 25.0統計軟件對發芽率、發芽勢、發芽指數、苗高、根長進行兩因素的方差分析，探討舟葉橐吾植株不同提取液對三種牧草種子萌發和幼苗生長的影響。在同一種牧草中，則采用Duncan檢驗法進行處理間的多重比較。并利用軟件Sigmaplot 14.0作圖。

2 結果與分析

2.1 舟葉橐吾浸提液對種子萌發的影響

舟葉橐吾不同部位、不同濃度的浸提液對3種牧草種子發芽率、發芽勢和發芽指數影響均產生了顯著的影響，而且牧草之間的差異顯著(P<0.05)(表2)。與對照相比，供試牧草種子的發芽率、發芽勢和發芽指數均顯著下降(P<0.05)，其中高濃度的地上部分和根部浸提液使白三葉種子發芽率分別降低了76.03%和85.6%，多年生黑麥草的發芽率則分別降低了59.5%和77.7%，鴨茅的發芽率分別降低了69.4%%和90.7%(表2)。

無論是地上部還是根部浸提液處理，白三葉的發芽率、發芽勢和發芽指數以及多年生黑麥草的發芽率和發芽指數均隨著提取液濃度的增加而進一步降低，且不同濃度間均差異顯著(P<0.05)。

化感效應指數表明，不同部位不同濃度的舟葉橐吾浸提液對供試種子的萌發有一定的抑制作用，且這種抑制作用與浸提液的濃度成正相關(表2)。發芽指數受到的抑制作用明顯比發芽率強。相同濃度下根部浸提液較地上部浸提液對3種受體種子萌發的抑制作用更強(表2)。就發芽率、發芽勢、發芽指數而言，兩因素方差分析表明草種之間和不同舟葉橐吾浸提液之間存在顯著的交互作用(表3)。

表2 舟葉橐吾水浸提液對3種牧草種子萌發的影響Table 2 Effects of aqueous extracts of Ligularia cymbulifera on seed germination of three forages

表3 牧草種類和浸提液濃度對3種牧草種子萌發的影響的交互作用Table 3 Interaction of species and extract concentration on Seed Germination of three forages

2.2 舟葉橐吾浸提液對幼苗生長的影響

舟葉橐吾同濃度根部浸提液對3種牧草幼苗生長的抑制作用大于地上部浸提液(P<0.05)。中高濃度的提取液對苗高和根的生長有一定的抑制作用，不過相比而言，苗高受到的影響要小一些(圖1)，尤其是低濃度的提取液對苗高的生長影響不顯著。相反，地上部及根部的中高濃度提取液均顯著抑制幼苗高度的增加(P<0.05)。

與對照相比，白三葉和鴨茅的根長在不同處理下均受到了顯著的抑制作用(P<0.05)。地上部低濃度浸提液對多年生黑麥根長的影響不顯著，但是其他濃度抑制效果顯著(P<0.05)。例如，高濃度的根浸提液使白三葉、多年生黑麥草及鴨茅根長分別降低了89.7%，66.4%，86.3%，可見抑制效應與草種有關(圖1)。

圖1 舟葉橐吾對3種牧草幼苗高度和根長的影響Fig.1 Effects of Ligularia cymbulifera extracts on the seedling height and root length of three forages注：不同小寫字母表示在同一種牧草中不同處理間差異顯著(P<0.05)。圖例“地低”表示“地上部低濃度浸提液處理”；“地中”表示“地上部中濃度浸提液處理”；“地高”表示“地上部高濃度浸提液處理”；“根低”表示“根部低濃度浸提液處理”；“根中”表示“根部中濃度浸提液處理”；“根高”表示“根部高濃度浸提液處理”。下圖同Note:Different lowercase letters within a species indicate there are significant differences among treatments at the 0.05 level,the same as below. The legend DD stands for low concentration extract from above-ground，DZ stands for medium concentration extract from above-ground,DG stands for high concentration extract from above-ground,GD stands for low concentration extract from root,GZ stands for medium concentration extract from root,and GG stands for high concentration extract from root. The same as below

2.3 舟葉橐吾浸提液對3種牧草的綜合化感效應

從苗高和根長的化感效應指數(RI)來看，除了低濃度的舟葉橐吾地上部提取液影響不明顯外，其它處理的RI值均為負值，說明舟葉橐吾的高中濃度地上部浸提液及三種濃度的根部浸提液顯著抑制了供試牧草地上部和根的生長(圖2)。

圖2 舟葉橐吾對3種牧草種子苗高和根長影響的化感效應指數Fig.2 RI of Ligularia cymbulifera on the seedling height and root length of three forages說明：“CK”數值為0，因此無數據顯示。下圖同Note:“CK” value is 0,so no data is displayed. The figure below is the same

從種子發芽率、苗高及根長等方面的綜合化感效應指數(SE)來看(圖3)，白三葉、多年生黑麥草和鴨茅的SE值為負值，說明舟葉橐吾浸提液對3種牧草的生長都產生了不同程度的抑制作用。根據SE值的大小判斷，敏感性最強的為鴨茅，白三葉和多年生黑麥草次之。

圖3 舟葉橐吾對3種牧草的綜合化感效應Fig.3 Synthetic allelopathic effects of Ligularia cymbulifera on three forages

2.4 舟葉橐吾葉片化學成分

GC-TOF-MS聯用儀掃描到了812個色譜峰，隨后根據質譜匹配、保留時間指數及峰面積等匹配，從KEGG數據庫、PubChem數據庫中定性出了283種代謝物。部分代謝物如表4所示，其中氨基化合物有3-羥基-L-脯氨酸、天冬酰胺、谷氨酸、苯乙酰胺、谷氨酰胺等；有機酸類化合物有4-羥基苯甲酸、4-羥基肉桂酸、苯甲酸、抗壞血酸、咖啡酸、孜然酸、半乳糖醛酸等；酮類化合物有丙酮、薄荷酮1、3-羥基黃酮等；醇類化合物有乙醇胺、山梨醇等。

表4 舟葉橐吾葉片部分代謝物Table 4 Qualitative analysis of metabolites indentified in leaves of Ligularia cymbulifera

3 討論

種子萌發是植物生命史中的關鍵環節，萌發后幼苗易受到外界環境變化的影響。牧草通過化感作用能抑制其它植物種子的萌發，尤其高濃度的提取物會抑制種子發芽和幼苗生長[20]。本試驗中高濃度的地上部和根浸提液使白三葉種子發芽率分別降低了76.03%和85.6%，多年生黑麥草降低了59.5%和77.7%，鴨茅降低了69.4%%和90.7%。這與馬瑞君[16]、蘭措卓瑪[21]和李晶[22]等的結果類似。3種牧草發芽指數、發芽率均降低，說明舟葉橐吾水浸提液的化感作用在影響發芽率的同時，也影響了種子正常發芽的時間，表明舟葉橐吾對地下資源的競爭能力比人工草地牧草強。綜合效應指數(SE)結果表明，舟葉橐吾浸提液不僅抑制供試牧草的種子萌發、幼苗的生長，而且表現出明顯的濃度效應、部位效應，即濃度越大抑制作用越強，根部浸提液的抑制作用比地上部更加明顯(圖3)，這與其它橐吾種類化感作用研究結果相一致[16，23]。

對化感作用，不同植物的耐受性有差異[24-26]。試驗中，我們也發現幼苗生長、種子萌發對舟葉橐吾植株浸提液的響應與牧草種類有關，其中鴨茅的敏感性最強，可能與舟葉橐吾浸提液中所含的化感活性物質有關。據馬瑞君等[27]研究，萜類化合物是黃帚橐吾主要的化感活性揮發物質，揮發釋放后影響受體植物種子的萌發。酚類物質影響著細胞分裂等關鍵過程[28]。通過代謝組非靶向測定，我們在舟葉橐吾葉片中發現了283種成分，主要包括4-羥基苯甲酸、苯甲酸、薄荷酮、抗壞血酸等。4-羥基苯甲酸可以通過枯枝、落葉、根部分泌、雨水沖洗等方式向周圍環境中釋放，當濃度累積到一定程度就會抑制植物的生長[29]。同為酚酸類物質的苯甲酸、咖啡酸、肉桂酸、阿魏酸均可對植物生長產生一定的抑制作用[30-33]。究竟是哪些具體成分在抑制其它牧草的生長，有待進一步深入研究。

4 結論

舟葉橐吾浸提液對供試的3種牧草種子萌發和幼苗生長均產生了抑制效果，且根部浸提液比地上部浸提液產生的抑制作用更強。對于3種受體植物，白三葉受到的抑制作用最明顯；鴨茅種子萌發受到的抑制作用強于多年生黑麥草，而幼苗生長受到的抑制程度弱于多年生黑麥草。由此可見，舟葉橐吾的化感作用嚴重影響3種牧草的發芽和幼苗生長，在人工草地建設中應去除舟葉橐吾。