宮頸上皮內瘤變及鱗癌中人乳頭瘤病毒不同亞型分布及多重感染的研究

陳婷婷，張 燕，程會賢，陳名園，王 巍

(四川大學華西第二醫院病理科、出生缺陷與相關婦兒疾病教育部重點實驗室，四川 成都，610044)

宮頸癌是全球女性的第四大常見癌癥類型[1]，在中國僅次于乳腺癌，為女性第二大常見癌癥類型。在15～44歲女性各系統癌癥發病率中居第二位，死亡率居第三位，且近年來呈年輕化趨勢[2]。高危型人乳頭瘤病毒( human papilloma virus，HPV)持續感染是公認的導致宮頸上皮內瘤變(cervical epithelial neoplasia，CIN)及宮頸癌的主要致病因素。作為目前唯一病因明確的癌癥，宮頸癌是可以通過早期篩查、早期發現、徹底防治的[3]。但目前全球宮頸癌防控形勢仍然非常嚴峻，特別是在中低收入國家。目前，越來越多的國家開始使用HPV基因分型進行宮頸癌初篩。不同HPV亞型擁有不同的致癌能力，了解不同亞型在宮頸病變中的分布及多重感染情況對宮頸癌的預防、疫苗應用及篩查策略制定，均有著重要意義。本研究選取四川大學華西第二醫院病理科診斷為CINⅠ、CINⅡ、CINⅢ及宮頸癌的四川地區病例，運用返向點雜交法檢查其HPV感染情況，統計不同亞型HPV在CIN及宮頸癌中的分布及多重感染情況，并探討其臨床意義。

1 資料與方法

1.1 一般資料選取2019年7月至2020年6月四川大學華西第二醫院病理科診斷為CINⅠ、CINⅡ、CINⅢ及宮頸癌的四川地區病例384例，其中CINⅠ、CINⅡ、CINⅢ分別為77、50、166例，宮頸鱗狀細胞癌(cervical squamous cell carcinoma，SCC)91例。均符合WHO2020版《女性生殖道病理學》診斷標準，并為經組織病理診斷明確的四川地區病例。排除資料不全病例。

1.2 方法

1.2.1 組織學檢查所有病例組織學結果均經2名高級職稱病理醫師復查，結果分為低級別上皮內瘤變CINⅠ、高級別上皮內瘤變CINⅡ、CINⅢ及宮頸癌四組，同時具有多種病變者，以最嚴重病變歸入相應組。

1.2.2 HPV亞型檢測①儀器與試劑：基因擴增儀ETC-811購自于蘇州東勝興業科學儀器有限公司，全自動核酸分子雜交儀YN-H48和人乳頭瘤病毒基因分型(23型)檢測試劑盒(PCR-返向點雜交法)均購自于亞能生物科技(深圳)有限公司。②實驗步驟：采用HPV基因分型檢測試劑盒(亞能生物)進行HPV檢測，經過樣本HPV DNA的提取，PCR擴增，雜交，洗膜，顯色，對所有病例進行23種HPV亞型檢測，包括17種高危型HPV(HPV16、18、 31、33、35、39、45、51、52、53、56、58、59、66、68、73、82) 和6種低危型HPV( HPV6、11、42、43、81、83)。③結果判斷(參照產品說明書)：僅一個基因型位點出現藍色斑點，則為相應基因型的單一感染；多個基因型位點出現藍色斑點，則為相應基因型的混合多重感染。

1.3 統計學方法采用SPSS 24.0進行統計學處理。計數資料的組間比較采用χ2檢驗。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組病變年齡及HPV感染率所有患者(384例)平均年齡(43.45±10.73)歲，各組病變平均年齡逐漸增大。384例患者總的HPV感染率為95.80%，其中高危型感染率95.05%，低危型感染率7.81%。各組病變均以高危型HPV感染為主，且高危型HPV感染率與總體HPV感染率比較，差異無統計學意義，見表1。

2.2 HPV亞型分布情況368例感染病例中，共檢出病毒493株，23種亞型均有檢出。低危型HPV感染占比(6.29%)遠低于高危型占比(93.71%)。CINⅠ、Ⅱ、Ⅲ及宮頸癌中高危型感染占比逐漸升高，而低危型HPV感染占比逐漸降低，趨勢檢驗結果說明低、高危型的病毒感染與病變程度之間存在線性變化(Z=9.085，P=0.003)。不同宮頸病變組別間低危型和高危型HPV感染構成比差異有統計學意義(P=0.028)，以高危型HPV感染為主。見表2。

表1 宮頸上皮內瘤變及宮頸癌中各組病變年齡及HPV感染情況

表2 宮頸上皮內瘤變及宮頸癌中低危型和高危型HPV分布情況[株(%)]

總體病例中最常見的HPV類型為16、58、52、33、18型；其中CINⅠ中最常見感染類型為HPV52、58、56、51、68、16及6型；CINⅡ中最常見的為HPV52、16、58及51型；CINⅢ中最常見的為HPV16、58、33、52及31型；宮頸癌中最常見的為HPV16、18、58、33及52型。HPV16型在CINⅠ、CINⅡ、CINⅢ及宮頸癌中感染率逐漸增高(從9.09%到71.43%)。此外，HPV16、18、58、52、33五種亞型在宮頸癌中感染率高達96.70%，其中16型71.43%，18型7.69%，而52、58、33三種類型為17.58%。見表3。

表3 宮頸上皮內瘤變及宮頸癌中不同HPV亞型分布情況 [n(%)]

2.3 HPV多重感染情況368例感染病例中單一亞型感染274例(74.46%)，多重感染94例(25.54%)。在多重感染中，雙重感染69例(18.75%)，三重及以上感染25例(6.79%)；低危+高危感染27例(7.34%)，多重高危感染67例(18.20%)。HPV多重感染在CINⅠ、CINⅡ、CINⅢ及宮頸癌中占比分別為50.00%、30.61%、21.25%、10.34%。統計結果顯示，不同宮頸病變組間單一亞型、多重感染構成比差異有統計學意義(P=0.001)，以單一亞型HPV感染為主。見表4。

表4 宮頸上皮內瘤變及宮頸癌中HPV單一亞型感染和多重感染情況

3 討論

3.1 各級CIN的發病年齡及HPV感染情況HPV是一種雙鏈DNA、無包膜病毒，定向感染皮膚及黏膜的復層鱗狀上皮細胞[3]。高危型HPV持續感染是引起宮頸癌的主要因素，幾乎所有的宮頸鱗狀細胞癌都與HPV感染相關。既往觀點認為，HPV感染導致CIN病變是一個緩慢、漸進和連續的過程，低級別CIN(CINI)發展到高級別CIN(CINⅡ和CINⅢ)直至惡變為宮頸癌需要數年至數十年時間[3, 4]。在本研究中我們發現，患者年齡是隨著病變嚴重程度增加而增高的，從CINⅠ發展到CINⅢ直至宮頸癌大致需要十年時間，這與既往文獻報道基本一致。但是，我們也發現部分年輕CIN患者沒有低級別CIN病變，而發病直接就是高級別CIN病變。這一發現也在Bedell等的文獻中得到了證實[5]，該文獻還指出不是所有的高級別CIN都是由低級別CIN發展而來，CINⅠ可能不是CINⅢ發展的必要條件，有些CINⅢ可以直接從HPV感染的正常上皮細胞進化而來。這種發病機制可能與我們已知的HPV致癌機制不同，可能是由某些基因的甲基化程度所決定，導致的病變不是由量變到質變的線性發展，而是類似“分子開關”模型(全或無)，進展為宮頸癌所需時間也更短。

3.2 宮頸各級CIN病變中HPV各基因亞型分布情況HPV各基因亞型的分布和頻率在不同地區及不同病變中均存在差異。一項集中全世界各國一萬多例宮頸癌患者薈萃分析研究發現，全球范圍內最常見的基因型是HPV16型，第二位為HPV18型，其他基因型如HPV58、52型在亞洲較多[6]。本研究結果與以上結論相符，宮頸癌中最常見的HPV基因型為16、18、58、33、52。此五種高危型HPV在宮頸癌中感染率高達96.70%，其中16、18型高達79.12%，而52、58、33三個亞型占比也達17.58%。各病變組中常見HPV感染亞型均不完全相同且存在變化，且有別于國內其他地區HPV分布研究。劉鍵等[7]深圳地區研究中常見HPV類型為16、18、58、31、33；張勤等[8]重慶地區研究中常見HPV類型為16、18、33、52、58；而本研究中常見HPV類型為16、58、52、33、18。相似之處為16型最常見，52、58、33型也均較常見，不同之處為四川地區18型陽性比率低于前兩研究。其原因除了地域差異外，研究對象的納入標準不同也會導致結果不同。馮余寬等[9]四川地區常見HPV類型為58、16、56、18。范永霞等[10]成都地區常見HPV類型為52、16、53、58、51。其結果不同于本研究是由于前者納入了大量宮頸炎病變患者，而后者是分析的液基細胞樣本。四川地區HPV感染有一定地域性特點，但也要考慮其他研究因素對結果的影響(比如其他研究的對象可能是婦科門診患者或者包含宮頸炎患者，而我們的研究對象是CIN及宮頸癌患者)。HPV基因亞型在不同宮頸病變中的分布和頻率存在變化規律，高危型HPV(主要是16亞型)感染率在CINⅠ、CINⅡ、CINⅢ及宮頸癌中逐漸升高。2015年美國陰道鏡和宮頸病理學會(ASCCP)發布并執行了FDA批準的HPV檢測用于宮頸癌初步篩查的臨時指南[5]，并將HPV16、18作為篩查分流的依據。相比細胞學篩查，HPV篩查結果更客觀且有更高的陰性預測值。但我國HPV感染除常見的16、18型外，58、52、33陽性占比也較高，且均可單獨導致宮頸癌的發生[6, 9]。由此可以推測，在我國四川地區，四價疫苗和九價疫苗的有效保護率會高于文獻報道[11]的70%和90%。在沒有接種九價HPV疫苗患者中，除16、18型外，58、52、33型感染更值得關注。

3.3 HPV多重感染情況現有的大量研究均表明，患者的年齡、性行為、伴侶人數、環境條件、吸煙等多種因素是導致HPV感染的主要原因，而上述一些因素如擁有不同的性伴侶則可導致多重感染的發生[9, 12, 13]。而多重感染各亞型HPV是否存在相互作用，尤其是高危型HPV多重感染對宮頸CIN病變以及宮頸癌的發生是否會有協同作用這一問題則鮮見有研究。為了探索HPV多重感染尤其是高危型HPV多重感染是否會加重CIN病變、是否會比單一亞型感染更加容易致癌，本文對各級別CIN及宮頸癌的多重HPV感染情況進行了研究。可以發現，CINⅠ、CINⅡ、CIN Ⅲ及宮頸癌中多重感染率從50.00%到10.34%明顯是逐漸減低的。這一結果至少說明了兩點： ①HPV多重感染率沒有隨著病變嚴重程度增加而增高，相反是降低的，因此可以認為HPV多重感染對病變的發展并沒有協同促進作用；②從多重感染的亞型分布來看，隨著病變加重、HPV多重感染率下降，漸少的亞型主要是低危型HPV，而高危型HPV也有不同程度的減少，由此可見絕大多數HPV感染是一過性的。對于第一點，Chaturvedi等[14]也通過對5871名性活躍婦女HPV感染情況研究發現，多重感染患宮頸癌風險與單一感染總體相似，幾乎沒有多重感染的HPV之間存在協同相互作用的證據，多重感染中的HPV是隨機發生并獨立導致宮頸疾病。VanHoof等[15]通過激光捕獲顯微切割-HPV PCR基因分型(LCM-PCR)技術，從CIN和正常上皮切片中的各個不同病變區域的上皮細胞中準確地檢測出特定類型的HPV DNA。通過LCM-PCR發現，在93%的病變區域中每一種HPV類型均只與一種獨立的CIN病變相關，而在7%多重感染病變區域中，也大部分是由兩個獨立的CIN病變碰撞產生。由此作者也總結出，一種HPV感染一個獨立的宮頸上皮區域，引起一種獨立的病變(CINⅠ、CINⅡ或CINⅢ)。對于第二點，其原因一方面可能是低危型HPV DNA在感染中多以游離形式存在，宿主免疫系統可將其清除；而高危型HPV DNA最初也以游離形成存在，但隨著持續性感染，病毒可將其部分DNA片段(包括E6/E7 DNA)整合入宿主DNA，導致原癌基因被激活。到這個時候宿主免疫系統就無法將其完全清除，進而進展為高級別上皮內瘤變及宮頸癌[3, 16, 17]。而另一方面正如VanHoof等的研究結果提示，一種HPV感染引起一種獨立的病變，病變獨立且具有排它性即HPV間可能存在競爭性抑制效應[15]。當然，這還需要更多的科學研究來證實。綜上所述，結合近來最新的研究和我們的臨床研究結果，我們認為HPV多重感染并未增加癌的風險，當然不同HPV亞型感染之間的相互關系與作用，值得我們深入研究。