茵連化濁解毒湯對膽結石小鼠血生化指標、膽汁代謝譜的影響及其機制分析

張正偉 吳佳玉 李 斌

膽結石是臨床常見的肝膽系統(tǒng)疾病，其中膽固醇結石是最常見的結石類型，目前尚缺乏有效的藥物治療手段，臨床上以外科手術切除膽囊為重要的治療方式。中醫(yī)理論認為膽結石屬于“膽脹”“脅痛”“虛勞”范疇，濕濁和熱毒分別作為陰邪和陽邪在膽結石的形成中起到重要作用，濁毒理論也是中醫(yī)理論中膽結石形成的重要理論[1，2]。鄭州大學附屬洛陽中心醫(yī)院藥學部以濁毒理論為基礎，將化濁解毒法作為治療大法，自擬茵連化濁解毒湯為基礎方用于膽結石的治療，為了明確該湯劑治療膽結石的效果，本研究通過高脂、高膽固醇、高熱量的導石飼料喂養(yǎng)的方式建立了膽結石小鼠模型，用茵連化濁解毒湯干預后分析了血生化指標、膽汁代謝譜及肝臟內(nèi)膽汁酸代謝蛋白Abcb11、Abcc2的表達，旨在為臨床實踐中應用茵連化濁解毒湯治療膽結石提供參考和依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料選擇C57BL/6雄性小鼠作為實驗動物，許可證號：SCXK(豫)2020-0002，購買于普萊柯生物工程有限公司。茵連化濁解毒湯(黃芩9 g，黃連6 g，蒲公英15 g，砂仁6 g，豆蔻9 g，茯苓15 g，白術10 g，半枝蓮9 g，白花蛇舌草15 g)由醫(yī)院藥劑科配制，濃縮得到含有0.72 g/ml生藥的藥液。超純RNA提取試劑盒(DNase I)、SuperRTcDNA第一鏈合成試劑盒、UltraSYBR Mixture試劑購自北京康為世紀公司。生化分析儀購自Nova公司，熒光定量PCR儀購自Bio-rad公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 動物分組及實驗方法C57BL/6小鼠隨機分為對照組、模型組、實驗組。模型組和實驗組小鼠按照下列方法建立膽結石模型：給予高脂、高熱量、高膽固醇(脂肪15%、膽固醇1%、膽酸0.5%)的飼料進行喂養(yǎng)、連續(xù)8周。實驗組小鼠在高脂、高熱量、高膽固醇飼料喂養(yǎng)的過程中給予茵連化濁解毒湯10 ml/kg灌胃，每日1次；對照組及模型組小鼠給予生理鹽水10 ml/kg灌胃。

1.2.2 血液指標的測定造模8周，處死大鼠后采集血液標本，在全自動生化分析儀中測定總膽紅素(TBIL)、直接膽紅素(DBIL)、谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)、總膽固醇(TC)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)的含量。

1.2.3 膽汁代謝指標的測定造模8周，處死大鼠后采集膽汁標本，在全自動生化分析儀中測定總膽汁酸(TBA)、丙氨酸(Gla)及TC、LDL-C的含量。

1.2.4 肝臟中Abcb11、Abcc2表達的測定造模8周后，處死大鼠后采集肝臟組織，采用超純RNA提取試劑盒(DNase I)和SuperRTcDNA第一鏈合成試劑盒進行實驗，分離肝臟中的RNA并合成為cDNA；取cDNA與UltraSYBR Mixture試劑混合為PCR反應體系，通過PCR反應擴增Abcb11、Abcc2，根據(jù)擴增曲線計算mRNA表達水平。

1.3 統(tǒng)計學方法采用SPSS 20.0軟件錄入數(shù)據(jù)，3組間計量資料的分析采用方差分析，P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 3組小鼠血生化指標比較與對照組比較，模型組血液中TBIL、DBIL、ALT、AST、TC、LDL-C的含量明顯升高，HDL的含量明顯減少(P<0.05)；與模型組比較，實驗組血液中TBIL、DBIL、ALT、AST、TC、LDL-C的含量明顯減少，HDL的含量明顯升高(P<0.05)。見表1、表2。

表1 3組小鼠血液中肝功能相關生化指標比較 (只，

表2 3組小鼠血液中脂代謝相關生化指標比較(只，

2.2 3組小鼠膽汁代謝指標比較與對照組比較，模型組膽汁中TBA、Gla、TC、LDL-C的含量明顯升高(P<0.05)；與模型組比較，實驗組膽汁中TBA、Gla、TC、LDL-C的含量明顯減少(P<0.05)。見表3。

表3 3組小鼠膽汁代謝指標比較 (只，

2.3 3組小鼠肝臟中Abcb11、Abcc2表達水平比較與對照組比較，模型組肝臟中Abcb11、Abcc2的mRNA表達水平明顯減少(P<0.05)；與模型組比較，實驗組肝臟中Abcb11、Abcc2的mRNA表達水平明顯升高(P<0.05)。見表4。

表4 3組小鼠肝臟中Abcb11、Abcc2表達水平比較 (只，

3 討論

中醫(yī)學中的濁毒理論是受到廣泛認可的膽結石發(fā)病的中醫(yī)病機，濕濁和熱毒分別屬于陰邪和陽邪，能夠引起“膽脹”“脅痛”“虛勞”的發(fā)生，根據(jù)濁毒理論對膽結石進行干預能夠起到確切效果[3]。本研究為了明確濁毒理論在膽結石治療中的價值，首先通過高脂肪、高膽固醇、高熱量飼料的飼養(yǎng)建立了膽結石動物模型。膽固醇結石是最常見的膽結石類型，高脂肪、高膽固醇、高熱量飼料的飼養(yǎng)能夠引起體內(nèi)膽固醇代謝異常、引起膽固醇結晶形成，同時膽結石形成后造成肝內(nèi)膽汁淤積并出現(xiàn)肝功能損害[4，5]。在建立膽結石模型后分析血液中肝功能及脂代謝相關生化指標的變化可知：模型組血液中TBIL、DBIL、ALT、AST、TC、LDL-C的含量明顯升高，HDL的含量明顯減少，提示高脂肪、高膽固醇、高熱量飼料飼養(yǎng)所建立的膽結石小鼠模型存在脂代謝紊亂、肝功能異常。

鄭州大學附屬洛陽中心醫(yī)院藥學部以濁毒理論為基礎，將化濁解毒法作為治療大法，自擬茵連化濁解毒湯用于膽結石的治療，該方劑中的黃芩、黃連、蒲公英、砂仁、豆蔻、茯苓、白術、半枝蓮、白花蛇舌草等中藥材能夠起到清熱解毒、通絡祛瘀的功效，能夠針對膽結石的中醫(yī)病機起到化濁解毒的作用[6]。近代藥理學研究證實，茵連化濁解毒湯中的多種中藥材具有細胞保護作用，能夠起到穩(wěn)定細胞膜、抗炎抗氧化等作用[7，8]。本研究的實驗組在高脂肪、高膽固醇、高熱量飼料的飼養(yǎng)過程中給予茵連化濁解毒湯進行灌胃干預，旨在發(fā)揮該湯劑的化濁解毒作用，通過分析干預后的血生化指標可知：實驗組血液中TBIL、DBIL、ALT、AST、TC、LDL-C的含量明顯低于模型組，HDL的含量明顯高于模型組，提示茵連化濁解毒湯對膽結石模型小鼠的肝功能及脂代謝均具有改善作用。

膽汁分泌及代謝的異常在膽固醇結石形成的過程中起到重要作用，膽汁中的主要成分為膽汁酸，同時還含有Gla、苯丙氨酸、甲硫氨酸、賴氨酸等多種代謝產(chǎn)物[9]。膽汁分泌的異常及膽固醇結石的形成存在相互促進、相互作用的關系，膽汁分泌的異常能夠誘導膽固醇結石的形成、膽固醇結石形成后對膽管的阻塞會加重膽汁分泌的異常[10]。本研究在造模后分析了膽結石模型小鼠膽汁中代謝指標的變化并發(fā)現(xiàn)：模型組膽汁中TBA、Gla、TC、LDL-C的含量明顯升高，提示膽結石模型小鼠的膽汁代謝發(fā)生了明顯的紊亂。在使用茵連化濁解毒湯灌胃干預后觀察到：實驗組膽汁中TBA、Gla、TC、LDL-C的含量明顯低于模型組，提示茵連化濁解毒湯對膽結石模型小鼠的膽汁代謝具有改善作用。

ATP結合盒超家族的成員Abcb11及Abcc2在膽汁酸的分泌、肝膽管細胞內(nèi)外膽汁酸的運輸中起到重要調(diào)控作用。Abcb11作為肝細胞的膽汁酸輸出泵，參與牛磺酸、鵝去氧膽酸、熊去氧膽酸等膽汁酸鹽的轉(zhuǎn)運，能夠促進肝膽管細胞內(nèi)外膽汁酸鹽的轉(zhuǎn)運[11]；Abcc2主要參與有機陰離子從肝細胞向膽汁的分泌[12]。當Abcb11及Abcc2表達發(fā)生異常時，膽汁酸鹽及相應陰離子的分泌發(fā)生障礙，進而出現(xiàn)膽汁代謝的障礙及膽囊結石的形成。本研究對肝臟內(nèi)Abcb11及Abcc2表達的分析顯示：模型組肝臟內(nèi)Abcb11及Abcc2的表達水平明顯減少，而實驗組肝臟內(nèi)Abcb11及Abcc2的表達水平明顯升高。由此表明茵連化濁解毒湯對膽結石模型小鼠肝臟內(nèi)Abcb11及Abcc2的表達具有促進作用，這可能是茵連化濁解毒發(fā)揮膽結石治療作用的分子機制。

綜上所述，茵連化濁解毒湯用于膽結石小鼠能夠通過增加Abcb11、Abcc2的表達來改善肝功能、調(diào)節(jié)膽汁代謝，該湯劑是治療膽結石的潛在藥物。