靶向乙型肝炎病毒表面抗原藥物的研究進展

陳靜文， 毛日成， 張繼明

慢性乙型病毒性肝炎（CHB）被定義為乙型肝炎（乙肝）病毒表面抗原（HBsAg）和/或乙肝病毒 （HBV） DNA陽性超過6個月[1]。據WHO報道[2]，至2015年全球約有2.57億人患有CHB，其中有887 000人死于CHB晚期并發癥，如肝硬化和肝癌等。因為共價閉合環狀DNA（cccDNA）池的存在，乙肝的治療并不能實現完全治愈，但可以達到“功能性治愈”[1]，即停止治療后HBsAg仍保持陰性（伴或不伴抗-HBsAg抗體陽轉）、HBV DNA檢測不到、肝臟生物化學指標正常，肝組織明顯改善。長期核苷（酸）類似物（NA）治療HBsAg陰轉率為0～3%，聚乙二醇干擾素 α（polyethylene glycol interferon α，PEG-IFNα） 單藥治療的HBsAg陰轉率為3%～7%[3]，顯然，需要更高效的藥物來降低表面抗原從而實現功能性治愈。本文就HBsAg的結構、功能和近些年研發的靶向表面抗原的藥物進展作一綜述。

已知HBsAg由一組反應性抗原決定簇α和亞決定簇dy、wr組成，它們以等位基因對呈現[4]。所以，HBsAg 陽性血清可分為4種主要亞型：HBsAg/adw、HBsAg/ayw、HBsAg/adr和HBsAg/ayr。

1 HBsAg的結構

HBsAg是HBV顆粒的包膜蛋白，具有不同結構域和糖基化狀態的大（L）、中（M）、小（S）三種蛋白。電子顯微鏡下可以觀察到表面抗原的三種形態：與空包膜對應的直徑22 nm的球形缺陷顆粒、直徑22 nm長度可變的細絲和直徑42 nm的活性病毒粒子（Dane粒子）。這3種蛋白在內質網中合成，并在內質網和高爾基體中發生糖基化，它們的合成由提供3個不同長度的羧基末端共線型HBsAg蛋白的單一開放閱讀框指定[5]。小蛋白（226個氨基酸）表達量最高，在病毒粒子和亞病毒顆粒中占主要成分，并且由于其有與細胞中宿主來源脂質的自組裝的能力，所以在易位過程中不會被切割氨基酸殘基，得以完整分泌。中蛋白（包含pre-S2結構域的55個額外殘基）受相同啟動子調控，分泌過程也與小蛋白類似。而大蛋白的轉錄受特定但較弱的啟動子（pre-S1）調控。HBV大蛋白（L-HBsAg）包含pre-S2和pre-S1結構域的108-119個附加殘基，是病毒粒子和細絲的重要組成部分，占包膜蛋白的10%～20 %。但在22 nm球形顆粒中，只占了2%[5-6]。小蛋白和大部分的大蛋白通過與硫酸乙酰肝素蛋白聚糖 （heparan sulfate proteoglycan， HSPG） 位點[7]和牛磺膽酸鈉共轉運多肽 （sodium taurocholate cotransporting polypeptide， NTCP）結合而具有感染性。

2 HBsAg的功能

2.1 啟動感染過程

從結構上看，HBsAg位于病毒顆粒的最外層，是病毒與細胞相互作用的前哨， 它們與細胞表面的受體結合， 介導了病毒的吸附與侵入[8]。多項研究證實了pre-S1結構域中的肽在膜附著過程中必不可少，這些肽與人肝細胞膜特異性結合，并且可以被單克隆抗體抑制[9]。然而，在鑒定出與S-HBsAg蛋白特異性結合的肝細胞結合內皮因子Ⅱ后，也提出了S-HBsAg蛋白參與附著[10]。

2.2 包裹病毒成分

HBsAg是HBV顆粒的包膜蛋白，它可以結合HBV中和抗體anti-HBsAg，阻止這些抗體對完整病毒顆粒的中和作用，將病毒基因組傳遞給新的細胞[11]。

2.3 判斷抗病毒治療

HBsAg陽性是乙肝病毒感染的標志，臨床上推薦以HBsAg水平來判斷開始PEG-IFNα治療的時機。指南中介紹[1]，對NA經治CHB患者中符合條件的優勢人群聯合PEG-IFNα可使部分患者獲得臨床治愈。治療前HBsAg低水平（＜l 500 IU/mL）及治療中HBsAg快速下降（12周或24周時HBsAg ＜200 IU/mL或下降＞1 lg IU/mL）的患者，聯合治療后HBsAg陰轉的發生率較高。

2.4 第一代疫苗的基礎

Murphy等[12]利用黑猩猩和被感染的人體血漿接種反應，發現針對HBsAg交叉反應α決定簇的抗體可預防HBV的adw和ayw亞型。

2.5 免疫調節

CD14是促進脂多糖（LPS）結合和Toll樣受體（TLR-4）激活的LPS共受體，有學者提出HBsAg可能通過與CD14的關聯觸發TLR激活[13]，生化分析表明CD14的依賴性結合與HBsAg的來源有關，它改變了亞病毒顆粒的脂質分布[14]。更有研究發現[15]，HBV可通過其編碼的HBsAg蛋白抑制TLR2下游的JNK信號通路從而選擇性地抑制白細胞介素（IL）-12的產生，這從一方面解釋了HBV逃避天然免疫導致持續感染的原因。

3 靶向表面抗原的藥物

3.1 核酸聚合物 （NAP）

NAP屬于單鏈硫代磷酸酯寡核苷酸（PS-ON）家族，具有廣譜抗病毒活性。硫代磷酸化的結構保護寡核苷酸免受核酸酶攻擊，同時還促進NAP與各種Ⅰ類包膜病毒和其他感染因子的融合糖蛋白中存在的兩親α-螺旋結構的疏水表面相互作用[16]。NAP的抗病毒作用取決于寡核苷酸的數量而不是序列，且作用機制與其兩親性有關[17]；其選擇性地阻止亞病毒顆粒[16-17]從攜帶 cccDNA 或整合的 HBV DNA[18]的肝細胞組裝或分泌，從而允許通過宿主介導的免疫激活清除血清中的HBsAg。

3.1.1REP 2139 加拿大Replicor公司在研新藥REP 2139已進入臨床Ⅱ期聯合用藥試驗中。REP 2139是40聚 體PS-ONs，序 列 為（2’OMeA，2’OMe-5-MeC）20，結構上腺苷和胞苷交替，包含所有胞嘧啶的 5-甲基化和所有核糖的 2’O-甲基修飾[19]。

REP 102研究，隨訪了12例患者接受REP 2139-Ca單藥治療的效果，其中9例轉為與PEGIFNα或胸腺素α1的短期聯合治療，發現伴隨著NAP單藥治療，血清HBsAg 降低2～7 lg IU/mL，血清HBV DNA降低3～9 lg拷貝/mL，以及出現血清抗HBsAg 抗體（10～1 712 mIU/mL）[20]。轉為聯合免疫療法的患者中，有8例發生了HBsAg血清學清除，停藥后達到HBV DNA＜116拷貝/mL，所有9例患者在停止治療前都出現了血清抗HBsAg抗體滴度的顯著增加。一項臨床前研究[21]，在慢性鴨HBV（DHBV）感染模型體內評估了由REP 2139與富馬酸替諾福韋二吡呋酯 （TDF） 和恩替卡韋 （ETV） 組成的聯合療法，研究發現當REP 2139與TDF或與TDF和ETV三藥聯合使用時，鴨的血清HBsAg和HBV DNA的降低速度更快，并且與TDF單藥治療相比，停止治療后未觀察到病毒反彈。REP 301研究納入了乙肝e抗原（HBeAg）陰性、HBV/丁型肝炎病毒（HDV）合并感染的患者，發現REP 2139-Ca聯合PEG-IFN的治療實現了HBsAg血清學清除和抗HBsAg抗體快速升高（高達86 532 mIU/mL）[18]。此外，HBsAg 已降至＜1 IU/mL 的患者中加用PGE-IFNα前就出現大幅度的轉氨酶升高，而且完成治療的患者中取消所有治療后，分別有4/11、6/11和7/11例對HBsAg、HBV DNA 和HDV RNA的功能控制目前可維持2年。401研究中，40例HBeAg陰性的患者先接受24周TDF單藥治療，后被隨機均勻分配到實驗組（48周TDF + PEG-IFNα +REP2139-Mg 10例/REP 2165-Mg 10例）和對照組（24周TDF + PEG-IFNα治療后轉為三聯療法繼續治療48周）；治療結束時，70.6%（35/40）的患者出現HBsAg下降 ＞1 lgIU/mL，67.5%（27/40）的患者HBsAg ＜1 IU/mL，60%（24/40）患者獲得HBsAg清除（＜0.05 IU/mL），60%（24/40）的患者獲得乙肝表面抗體（HBsAb）陽轉；34例患者完成48周隨訪，50% （17/34）的患者HBsAg＜1 IU/mL，41% （14/34）的患者獲得HBsAg清除（＜0.05 IU/mL），50% （17/34）患者出現HBsAb陽性[22]。

3.1.2REP 2165 同樣，Replicor公司在研的REP 2165也處于臨床Ⅱ期、與TDF和PEG-IFNα的聯合用藥試驗狀態。REP 2165是一種REP 2139類似物，含有3個等距分布在整個聚合物中的未修飾核糖腺苷，單次給藥后，在小鼠和食蟹猴中顯示出與REP 2139相似的血漿清除率和組織分布，但器官和血液中的藥物蓄積減少[23]。REP 2165的設計目的是通過將2OMe腺苷替換為2OH腺苷來更快地清除序列中的11、21和31位，增加了這些位置對核酸酶攻擊的敏感性。

401研究中的NAP采用了REP 2165-Mg，治療結束后總共有41% （14/34）的患者獲得HBsAg血 清 學 清 除[22]。AASLD2020公 布 了TDF聯 合REP 2165-Mg的無干擾素治療方案在HBV/HDV合并感染的肝硬化患者中進行評估的結果，發現肝硬化患者對TDF、REP 2165-Mg治療和伴隨的轉氨酶驟然升高耐受性良好，同時伴有HDV RNA清除、約3 lg IU/mL的HBsAg 降低和HBsAg血清學轉換，證實了該無干擾素方案治療HBV/HDV合并感染的晚期肝硬化患者是安全有效的[24]。

3.2 其他HBsAg抑制劑

3.2.1GST-HG131 中國福建的廣生堂藥業股份有限公司在研新藥GST-HG131還處于臨床Ⅰ期，具體試驗結果尚待公布。EASL2021報告[25]，GST-HG131臨床前特征，顯示在無細胞毒作用[半數細胞毒性濃度（CC50） ＞100 μmol/L]條件下，能有效抑制HepG2.215細胞分泌 HBsAg[半數有效濃度（EC50） =3.4±nmol/L]、HBeAg（EC50=8 nmol/L）和HBV DNA（EC50=3.3±1.7 nmol/L），與恩替卡韋聯合應用時，具有疊加作用。在AAV-HBV小鼠模型中，GST-HG131在給藥28 d后，血清HBsAg呈劑量依賴性下降（約1 lg IU/mL），與替諾福韋聯合使用可產生疊加活性。GST-HG131耐受性良好，對小鼠體重無明顯影響。其抗病毒作用機制包括強烈抑制 HBsAg 分泌，涉及與末端核苷酸轉移酶 4B（TENT4B）結合和抑制[26]，導致 HBV mRNA 的聚腺苷酸化尾部縮短，從而加速其降解。

3.2.2ALG-010133 美國Aligos Therapeutics公司在研新藥ALG-010133處于臨床Ⅰa/Ⅰb期。ALG-010133 是一種抑制S抗原轉運的寡核苷酸聚合物（STOPS）分子，作用接近于NAP，在體外和CHB的試驗中被發現可深度抑制HBsAg形成。其作用機制目前尚未完全闡明，被認為是通過與特異性蛋白相互作用來實現降低HBsAg水平，在這個過程起核酸適配體的作用[27]。

3.2.3LP-128 中國廣州麓鵬制藥有限公司在研新藥LP-128的臨床Ⅰ期研究已完成首例志愿者給藥，旨在評估單次給藥和多次給藥的有效性和安全性[28]。其作用主要是減少宿主體內HBsAg包裹的乙肝空殼病毒數，恢復空殼病毒耗竭的免疫水平。目前還沒有關于其作用機制的詳細報道。

4 表面抗原清除的臨床意義

cccDNA作為穩定的病毒復制中間產物及病毒RNA轉錄的模板，是停止抗病毒治療后病毒復制反彈的主要原因。實際上即使是急性HBV感染治愈后被感染者體內的HBV cccDNA也不能被完全消除，研究表明即使急性HBV感染患者治愈數十年后，如果使用免疫抑制劑等導致免疫功能低下，仍會發生HBV再激活，由此可見急性HBV感染患者治愈后依然依賴宿主特異性抗HBV的免疫監視作用[29]。因此，盡管清除患者體內cccDNA是理想的治療終點，但目前仍難以實現，故美國肝病研究協會（AASLD）和歐洲肝病研究協會（EASL）提出功能性治愈目標，即實現HBsAg清除伴或不伴抗HBsAg抗體的血清學轉換，而要實現功能性治愈則依賴于恢復宿主特異性抗病毒免疫功能，以達到持久控制HBV感染的目的[30]。

5 應用和展望

WHO提出2030年全面消滅肝炎包括乙型肝炎和丙型肝炎的目標，HBV病毒學治愈是指根除HBV cccDNA和/或所有感染的肝細胞，目前仍難以實現，而HBV的功能性治愈的標志主要是清除HBsAg伴/不伴抗HBsAg抗體血清學轉換。在研的幾種HBsAg抑制劑報告的臨床試驗結果十分可觀，降低HBsAg的速度和效率優于現有的NA和PEG-IFNα，但是僅降低HBsAg也不能達到持久的功能性治愈，很有可能會出現病毒學反跳。隨著降低病毒蛋白表達，誘導病毒蛋白降解或加速循環HBsAg清除等療法及各種免疫相關療法的發展，通過不斷探索聯合治療的方法，未來幾年內有望開發出更高效的實現HBV功能性治愈的療法。