牦牛KIF2A基因克隆及其在卵泡與卵母細胞發育過程的表達規律

楊滿珍，閔星宇，，楊璐瑜，于海玲，，胡宇磊，，朱艷錦，潘幫婷，李 鍵，，熊顯榮，

(1.西南民族大學 畜牧獸醫學院，四川 成都 610041；2.青藏高原動物遺傳育種資源保護與利用國家教育部重點實驗室，四川 成都 610041；3.動物科學國家民委重點實驗室，四川 成都 610041)

Aizawa等[1]在小鼠腦組織首次發現KIF1-5，成功完成了前體cDNA的克隆和測序，并通過Northern Blot分析表明，KIF1、KIF3、KIF5只在小鼠腦組織表達、而KIF2和KIF4在腦和其他組織表達。Debernardi等[2]揭示了人和鼠驅動蛋白的酶促活性區域的空間結構域后，含有驅動蛋白結構的蛋白質被逐漸發現，根據其分子結構及功能的不同被劃分為14個家族[3]。KIF2A(Kinesin family member 2A，KIF2A)、KIF2B、KIF2C(也稱MCAK)、KIF24同屬于驅動蛋白超家族-13(Kinesin superfamily of proteins 13)，該家族的共性是含有一個極保守的動力結構域，該結構域是微管動態變化的重要調控者[4]。在高等真核生物的細胞分裂中，微管的伸長和收縮對紡錘體尺寸、染色體的運動十分重要[5-6]。KIF2A具有微管解聚活性，其通過增加或減少微管末端的蛋白亞基調節神經元的發育、參與機體物質運輸、調控紡錘體的組裝[7-9]。在有絲分裂中，KIF2A定位于紡錘體負末端，與位于正末端的MCAK相互配合維持紡錘體的雙極性[10]。Bufe等[11]研究表明，Wnt信號通路在有絲分裂過程中調控KIF2A與PLK1的活性以確保紡錘體定位和染色體排列正確。

基于KIF2A在細胞有絲分裂過程中的功能研究和發現，近年來，越來越多的研究表明，KIF2A與細胞分裂相關因子相互作用，共同調控減數分裂過程中紡錘體形成和染色體運動。Chen等[12]研究表明，紡錘絲或紡錘體異常會影響甚至破壞卵母細胞的正常分裂和第一極體的排出速率。Eagleson等[13]研究表明，非洲爪蟾早期胚胎中KIF2A耗盡會導致紡錘體形成缺陷，早期胚胎胞質分裂失敗抑制胚胎發育。除此之外，研究表明，KIF2A在人類胎兒生殖細胞(Fetal germ cells，FGCS)4個重要發育階段，以及人卵母細胞減數分裂過程中3個關鍵時期差異表達，KIF2A通過紡錘體的組裝調控染色體排列對人卵母細胞成熟和早期胚胎發育有重要作用[14]。Xu等[15]研究發現，在小鼠卵母細胞中KIF2A主要定位于紡錘體，利用siRNA干擾小鼠卵母細胞KIF2A的表達后，紡錘體組裝和染色體聯會異常，小鼠卵母細胞微絲帽的形成受損。Chen等[16]研究表明，下調小鼠卵母細胞中KIF2A的表達后，會出現染色體排列紊亂，異常的不對稱分裂等現象；檢查點蛋白BubR1被激活，使小鼠卵母細胞發育阻滯于MⅠ期，最終導致第一極體排出的速率降低。綜上，KIF2A基因對細胞分裂、卵母細胞成熟等過程具有重要作用。

牦牛(Bosgrunniens)作為高原地區的優勢種群，具有耐寒、耐粗飼、抗病和抗逆性強等特點，其有“高原之舟”的美譽，是高原地區牧民主要的生產生活資料和經濟來源[17-18]，但與平原牛種相比，牦牛性成熟晚、發情率低、空懷率高，繁殖性能低[19-20]。KIF2A基因可能與牦牛雌性繁殖力相關，但目前關于KIF2A基因的研究主要集中在人和小鼠上，尚未見牦牛KIF2A基因的相關研究報道，KIF2A基因是否參與調控牦牛卵泡發育和卵母細胞成熟尚不清楚。

本研究擬通過RT-PCR技術擴增牦牛KIF2A基因，分析其序列結構和生物學特征，并利用RT-qPCR檢測KIF2A在牦牛各組織中的表達模式；通過免疫組織化學染色分析該基因在牦牛卵巢組織中的表達定位；利用RT-qPCR檢測在不同發育程度卵泡顆粒細胞和不同成熟階段卵母細胞中的表達規律，旨為進一步挖掘KIF2A在牦牛雌性繁殖方面的調控作用提供基礎數據。

1 材料和方法

1.1 樣品的采集和處理

試驗樣品采自成都市青白江區屠宰場，母牦牛屠宰后，立即采集卵巢、心、肝、脾、肺、腎、胃、子宮(n=5)，使用磷酸鹽緩沖溶液(PBS)沖洗后，剪成0.5 cm3的組織塊，裝入凍存管并標記，放入液氮罐中保存。完整卵巢組織用含有1%雙抗的PBS沖洗數遍，隨機取3個用4%多聚甲醛固定液固定用于免疫組織化學染色，其余的卵巢投入含1%雙抗的37 ℃生理鹽水保溫瓶中用于細胞培養。

1.2 主要儀器與試劑、

二氧化碳培養箱(Thermo，美國)；光學顯微鏡(Laika，意大利)；激光共聚焦顯微鏡(Carl Zeiss，德國)；熒光定量PCR儀(Bio-Rad，美國)；超純水系統(MILLI-Q，法國)高通量組織研磨器(新芝，中國)；紫外分光光度計(Biospec-nano，日本)。RNA isolater、PCR相關試劑盒(諾唯贊)；TAE緩沖液、DEPC水(碧云天)；感受態細胞DH5α、DNA膠回收試劑盒(天根生化)；Rabbit Anti-KIF2A antibody(博奧森)；透明質酸酶、瓊脂糖購(索萊寶)；胎牛血清(FBS)、DMEM/F12培養基、Medium 199培養基(Gibco，美國)。

1.3 卵母細胞的分離培養

使用PBS沖洗卵巢組織3次，使用6號針頭注射器將小、中、大卵泡中的卵泡液抽出，分別置于60 mm培養皿中，在顯微鏡下用撿卵針(2.5 mm×2.0 mm×100.0 mm玻璃細管拉制)收集卵丘-卵母細胞復合體(Cumulus-oocytecomplexes，COCs)。同時將剩余卵泡液中的COCs撿去，分別收集到1.5 mL離心管中并標記，3 000 r/min離心5 min后棄上清，PBS清洗3次，沉淀加1 mL培養液(10%FBS、89% DMEM/F12、1%雙抗)得到顆粒細胞備用。使用培養箱37 ℃平衡6 h的卵母細胞成熟液(10% FBS、89% Medium 199、1%雙抗1 μg/mL EGF、0.05 IU/mL FSH、0.05 IU/mL LH、0.5 μg/mL 17β-E2)將COCs清洗3次，取50枚置于0.5%透明質酸酶溶液中處理2 min，使顆粒細胞脫去后收集GⅤ期卵母細胞。剩余COCs轉入卵母細胞成熟液培養液，置于培養箱(二氧化碳5%、38.5 ℃)中培養12，24 h后，分別收集培養到MⅠ期和MⅡ期的卵母細胞。

1.4 cDNA的獲取及cDNA合成

各組織樣用高通量組織研磨器研磨后加入1 mL RNA isolater，使組織、細胞充分溶解，經氯仿離心取上清、異丙醇沉淀、75%乙醇清洗、DEPC水促溶獲得所有樣品總RNA，使用紫外分光光度計檢測RNA濃度和純度，選取OD260/280值介于1.8～2.0的RNA樣本，將上述RNA按照反轉錄試劑盒說明書分別反轉合成cDNA，-20 ℃保存備用。

1.5 引物設計合成與克隆

根據GenBank中預測的野牦牛(Bosmutus)KIF2A基因序列(XM_014479690.1)及內參基因序列GAPDH(XM_014482068.1)，運用Primer Premier 5.0軟件設計引物(表1)。以卵巢cDNA(200 ng/μL)為模板，使用RT-PCR技術擴增KIF2A序列，擴增體系為50 μL，2 × Phanta?Max Master Mix(Dye Plus)25 μL，ddH2O 19 μL，上、下游引物(10 μmol/L)各2 μL，模板2 μL。程序為：95 ℃預變性3 min；95 ℃變性15 s，59 ℃退火15 s，72 ℃延伸30 s，30個循環；72 ℃徹底延伸5 min，4 ℃保存。PCR產物通過濃度為2%的瓊脂糖凝膠電泳分析，將目的條帶切下，產物純化回收，連接轉化后隨機篩選數個陽性菌種送生工生物工程(成都)有限公司測序。

1.6 牦牛KIF2A基因生物信息學分析

牦牛KIF2A基因生物信息學分析工具參見表2。

1.7 KIF2A表達分析

利用RT-qPCR技術，GAPDH作為內參基因，檢測分析KIF2AmRNA在牦牛各組織、不同直徑大小卵泡顆粒細胞以及不同發育程度卵母細胞中的相對表達量。反應體系：2 × AceQ qPCR SYBR Green Master Mix 10 μL，ddH2O 8.2 μL，模板(200 ng/μL) 1 μL，上下游引物(10 μmol/L)各0.4 μL，50×ROX Reference Dye 1 0.4 μL。RT-qPCR反應程序

表1 PCR引物序列及產物信息Tab.1 PCR primer sequences and products information

表2 生物信息學分析內容和工具Tab.2 Bioinformatics analysis contentsand tools

如下：95 ℃預變性5 min；95 ℃變性10 s，60 ℃退火30 s，40個循環；溶解曲線為60～95 ℃ 每10 s增加0.5 ℃。

1.8 免疫組織化學染色分析

從4%多聚甲醛固定液中取出卵巢，PBS沖洗后制作石蠟切片，切片放入二甲苯、梯度酒精、純水中依次洗滌，置于EDTA(pH值9.0)溶液中于烤箱內進行抗原修復15 min，PBS洗滌3次，每次5 min。用紙巾輕輕擦拭組織周圍殘留的PBS，3% H2O2覆蓋避光孵育25 min；3%BSA覆蓋室溫封閉30 min；滴加一抗(單克隆兔抗KIF2A，1∶200稀釋，博奧森)，用封口膜蓋住防止干燥，4 ℃孵育過夜；移去封口膜，滴加二抗(辣根過氧化物酶標記)室溫閉關孵育1 h，滴加DAB顯色液顯色，鏡下觀察顯色程度，純水沖洗切片終止顯色；蘇木精復染；梯度酒精、二甲苯脫水晾干封片；使用共聚焦顯微鏡拍照。

1.9 數據分析

利用2-ΔΔCt法對RT-qPCR結果進行分析，通過SPSS 19.0統計軟件處理，用一般線性模型對各個組織及顆粒細胞、卵母細胞中KIF2A的相對表達量進行比較，當P<0.05時差異顯著。

2 結果與分析

2.1 牦牛KIF2A基因的克隆和序列分析

以卵巢cDNA為模板，PCR擴增KIF2A基因后，經2%瓊脂糖凝膠電泳檢測顯示目的條帶清晰，片段與預期大小一致(圖1-A)。經測序獲得牦牛KIF2A基因全長為1 964 bp，CDS為1 530 bp，編碼509個氨基酸(圖1-B)。利用DNAMAN 6.0軟件將測定序列的CDS與NCBI上黃牛KIF2A基因(NM_001077073.1)的CDS核苷酸序列比對，發現657 bp位點和1 073 bp位點上存在堿基突變，其中657 bp堿基突變(C→G)導致該位點的氨基酸由Gly變為Arg(圖1-C)。

A：M.DL2000 DNA Marker，1.KIF2A基因；B.牦牛KIF2A基因預測序列及推測的氨基酸序列；C.測定序列與黃牛KIF2A編碼區序列差異。A： M.DL2000 DNA Marker，1.KIF2A gene；B. Predicted sequence of KIF2A gene and predicted amino acid sequence of yak;C. The difference between the determination sequence and the KIF2A coding region sequence of cattle.

2.2 牦牛KIF2A基因生物信息學分析

通過DNAMAN將預測的核苷酸序列翻譯成氨基酸序列后，運用表2所列工具分析預測KIF2A蛋白的理化性質，發現其蛋白質分子式為：C2534H4075N727O781S25，分子質量為58.023 ku，脂肪指數81.41，等電點為6.32，帶正、負電荷殘基總數分別為73，77個，整體帶負電。KIF2A在哺乳動物未完全成熟的紅細胞(體外)、酵母和大腸桿菌(體內)的半衰期分別為30，20，10 h。KIF2A含量較高的氨基酸Leu(L)有47個占比為9.2%，含量較低的氨基酸Arg(W)有2個占比0.4%。KIF2A蛋白質中有15種氨基酸親水性數值小于0，總親疏水性平均值為-0.68，該蛋白為疏水性蛋白(圖2-A)。KIF2A蛋白共有90個潛在的磷酸化位點，其中潛在的絲氨酸磷酸化位點最多48個(圖2-B)。通過STRING在線預測，與KIF2A互作的蛋白主要有CENPE、KIF18A、TMED10、PLK1等(圖2-C)。

A.牦牛KIF2A蛋白親疏水性分析；B.牦牛KIF2A蛋白磷酸化位點分析；C.牦牛KIF2A蛋白互作蛋白預測。A.Hydrophilic and hydrophobic analysis of yak KIF2A protein；B.Phosphorylation site analysis of yak KIF2A protein；C.Prediction of yak KIF2A protein interaction protein.

2.3 牦牛KIF2A蛋白質結構功能預測分析

KIF2A蛋白分子具有一個Kinesin動力結構域，該結構域具有水解ATP、運輸物質和微管解聚功能，位于700～1 700 bp(圖3-A)。牦牛KIF2A蛋白二級結構中的無規則卷曲占比最大為49.96%，其次是α-螺旋占23.81%，再次是延伸連和β-轉角占比分別為18.54%，9.69%(圖3-B)。KIF2A蛋白三級結構中主要由α-螺旋、無規則卷曲和延伸鏈纏繞而成，延伸鏈介于α-螺旋、無規則卷曲之間(圖3-C)。

2.4 牦牛KIF2A基因同源性分析與進化樹

利用NCBI同源性比對不同物種間KIF2A氨基酸序列，結果顯示，牦牛與野牛(XM_010845503.1)、瘤牛(XM_027520446.1)和綿羊(XM_015101285.2)的同源性較高，分別為99.87%，99.48%，98.67%，與小鼠(XM_036157878.1)的同源性較低為91.02%(圖4-A)。利用MEGA 6.0軟件對牦牛在內的12個物種KIF2A氨基酸序列構建進化樹，結果顯示，牦牛與野牛首先聚在一起彼此親緣關系較近，二者隨后與瘤牛聚在一起，12個物種中最后與小鼠聚在一起，說明牦牛與小鼠親緣關系較遠(圖4-B)。綜上可知，KIF2A基因在不同物種間進化過程中較為保守。

2.5 牦牛KIF2A基因在各個組織中的表達差異分析

以GAPDH作為內參，利用RT-qPCR檢測KIF2A在卵巢、心、肝、脾、肺、腎、胃、子宮中的相對表達量，結果顯示，KIF2AmRNA在牦牛各個組織中均有表達，其在心臟和卵巢組織表達水平差異不顯著，但二者的表達量顯著高于其他組織(P<0.05)，在胃中的表達量最低(圖5)。

A.牦牛KIF2A蛋白功能結構域分析；B.牦牛KIF2A二級結構；C.牦牛KIF2A蛋白三級結構。A.Functional domain analysis of yak KIF2A protein；B.The secondary structure of yak KIF2A protein；C.The tertiary structure of yak KIF2A protein.

A.不同物種間KIF2A同源性分析；B.牦牛KIF2A系統發育樹。A.Homology analysis of KIF2A among different species；B.Phylogenetic tree of yak KIF2A.

不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。圖7同。Different lowercase letters indicate significant difference(P<0.05).The same as Fig.7.

2.6 KIF2A在牦牛卵巢中的表達定位

通過免疫組織化學法檢測牦牛卵巢中KIF2A表達及定位，如圖6所示，KIF2A在牦牛各級卵泡中都有表達；其中有腔卵泡顆粒細胞的陽性信號最強，卵泡膜細胞和周圍組織中有少量陽性信號，說明KIF2A主要定位于顆粒細胞中。

A.牦牛卵巢概覽圖；B.有腔卵泡；C.有腔卵泡局部放大：GC.壁層顆粒細胞，TC.膜細胞。A.General picture of yak ovary；B.Antral follicle，C.Local enlargement of antral follicle： GC.Granular cell，TC.Theca cells.

2.7 KIF2A在卵泡顆粒細胞、卵母細胞的表達分析

以GAPDH作為內參，使用RT-qPCR檢測KIF2A基因在牦牛不同直徑大小(小、中、大)卵泡顆粒細胞、不同成熟階段卵母細胞(GⅤ、MⅠ、MⅡ)中的表達量。結果顯示，KIF2A基因的相對表達水平伴隨著卵泡發育呈上升趨勢，在大卵泡中的表達水平顯著高于小、中卵泡(P<0.05，圖7-A)。KIF2A在牦牛卵母細胞成熟過程中，其表達量呈下降趨勢，GⅤ期表達水平顯著高于MⅠ期和MⅡ期(P<0.05，圖7-B)。

A.小、中、大卵泡顆粒細胞KIF2A的相對表達水平；B.不同時期卵母細胞KIF2A的相對表達水平。A.Relative expression levels of KIF2A in small，medium and large follicular granulosa cells；B.Relative expression levels of KIF2A in oocytes at different stages.

3 結論與討論

雌性哺乳動物生殖發育是繁衍后代的重要生理過程，其中最為重要的事件即卵泡發育。雖然卵巢在胎兒時期就已經產生，出生前數百萬個卵原細胞增殖分裂成初級卵母細胞，但直到初情期后原始卵泡才被逐漸激活，初級卵母細胞從卵泡中排出，減數分裂后成熟的卵子才具備受精能力[21-23]。細胞分裂時細胞核逐步凝集成染色體，排列于赤道，微管聚集在染色體周圍不斷重排形成紡錘體移向兩極，極微管、動力微管連接兩級紡錘體與動力馬達分子配合，染色體上的動粒結構與多根微管結合，形成微管纖維，核膜解體后，姐妹染色單體分開移向兩極[24-26]，核質徹底分裂成2個子細胞。研究表明，紡錘絲或紡錘體異常會導致卵母細胞質量下降，進而導致不孕或流產[27-28]。在細胞分裂過程中PLK1被激活并結合MRN、KIF2A構成復合物，磷酸化KIF2A增強其解聚活性，調控卵母細胞減數分裂過程中微管細胞骨架、微絲的長度，確保紡錘體的生成、促進染色體分離[29]。因此，探究KIF2A在卵泡發育、卵母細胞成熟過程中表達規律具有重要意義。

為了探究牦牛KIF2A基因與卵泡發育、卵母細胞成熟的相關性，本試驗克隆了牦牛KIF2A基因，并獲得完整的CDS全長1 530 bp，編碼509個氨基酸。本研究發現，牦牛KIF2A蛋白共有90個磷酸化位點，早期的研究表明，KIF2A微管解聚的活性是由一些蛋白激酶在特定位點磷酸化后被激活的[30-31]。通過物種間基因進化分析發現，KIF2A基因與黃牛、野牛的同源性較高，且親緣關系較近，提示該基因在物種進化過程中高度保守。Gao等[32]研究表明，KIF2A在昆蟲類與小鼠之間高度保守[33]，其同家族基因KIF2C在人和斑馬魚之間也高度保守。另外測序所得牦牛KIF2A基因CDS序列與NCBI上黃牛CDS序列相比有2個堿基突變，其中1個導致了氨基酸改變，這種差異可能與牦牛長期生活在高原地區有關，但該氨基酸的突變是否影響到KIF2A蛋白的功能，而影響牦牛的繁殖性能還需要進一步研究。在功能結構域的預測分析過程中發現，牦牛KIF2A富含豐富的螺旋結構域，在700～1 700 bp處具有一個Kinesin動力結構域，該結構域具有水解ATP、運輸物質和微管解聚功能。有研究表明，其他KIFs的動力結構域在N端或C端，KIF2A的動力結構域在蛋白質的中心部分[34]，該結構域是精子鞭毛運動[35]、卵母細胞減數分裂、紡錘體組裝、染色體的聯會[36-37]動力來源之一。因此，推測KIF2A基因對牦牛卵泡發育以及卵母細胞的成熟有重要作用。

隨著卵泡發育，卵泡膜分內外2層，卵泡腔內主要是壁顆粒細胞、卵丘顆粒細胞、卵母細胞，顆粒細胞合成分泌黏多糖包裹卵母細胞，顆粒細胞膜的突起是為卵母細胞提供營養和傳遞信息的重要樞紐[38-40]。免疫組織化學結果表明，KIF2A在牦牛卵巢組織各級卵泡中均有表達，陽性信號隨著卵泡直徑增加逐漸增強，主要定位于顆粒細胞中，提示KIF2A可能是通過顆粒細胞發揮其生物學功能。顆粒細胞與卵泡膜細胞通過分泌細胞因子、分泌蛋白以及類固醇激素等調控卵泡發育以及卵母細胞的成熟[41]。Zhang等[42]發現，KIF2A的同家族基因Oocyte-G1在不同年齡段小鼠卵巢組織中差異表達，在卵泡中主要定位于卵母細胞的細胞質及其周圍一些顆粒細胞中，且過表達Oocyte-G1會使小鼠卵泡發育遲緩。綜上，推斷KIF2A可能通過顆粒細胞參與調控牦牛卵巢卵泡發育和卵母細胞成熟。

為了進一步探究KIF2A在牦牛雌性生殖細胞中的表達規律，本研究通過RT-qPCR檢測牦牛不同發育程度卵泡顆粒細胞、不同成熟階段卵母細胞KIF2A基因的表達量。結果顯示，KIF2A在小、中、大卵泡顆粒細胞中差異表達，KIF2A在牦牛不同成熟階段卵母細胞時序表達，其在GⅤ期的表達量顯著高于MⅠ、MⅡ期。隨著卵泡的發育，卵泡中顆粒細胞KIF2A的表達增加，可能是由于大卵泡時期卵母細胞需要積累大量營養，顆粒細胞分泌大量類固醇激素、細胞因子和蛋白[41-43]，為減數第二次分裂做準備，因此，這一時期的卵母細胞對物質運輸的需要尤為迫切，大量的酶被逐漸激活，尤其是卵泡發育與卵母細胞成熟過程中所需的蛋白因子；而KIF2A的Kinesin動力結構域可能為這一時期卵泡內諸多細胞的物質運輸、分裂分化提供動力。據文獻報道，細胞內Kinesin、Dynein和Myosin共同承擔了細胞內物質運輸的任務[44]，KIFs的Kinesin動力結構域和豐富的螺旋結構域使得其易于折疊和改變形狀，滿足細胞內不同物質的運輸需求。而卵母細胞成熟過程中KIF2A表達量逐漸下降的原因，可能與CyclinB1的降解和MPF活性(Maturation-Promoting Factor，MPF)的缺失有相關性，研究表明，卵母細胞從初級卵母細胞發育到次級卵母細胞必然會使CyclinB1降解和MPF活性缺失[45-46]。因此，推測KIF2A的表達下降可能是由MPF的上調導致的，但具體調控機制有待進一步研究。

本研究克隆得到牦牛KIF2A基因CDS序列全長1 964 bp，其中CDS為1 530 bp，編碼509個氨基酸。KIF2A在物種進化過程中高度保守；KIF2AmRNA在牦牛各組織中廣泛表達，并且在牦牛不同發育程度卵泡顆粒細胞、不同成熟階段卵母細胞中時序表達。提示，該基因可能參與調控牦牛卵泡發育與卵母細胞成熟。以上研究結果可為牦牛卵泡生長發育調控機理及功能的研究提供可靠的理論依據。