棉花WRKY7基因克隆及其對黃萎病抗性分析

曾焱明，胡 廣，賈 培，唐 葉，王炳婷，武 盼，陸承哲，陳愛民，彭清忠，吳家和

(1.吉首大學 生物資源與環境科學學院，湖南 吉首 416000；2.中國科學院 微生物研究所，植物基因組學國家重點實驗室，北京 100101；3.九圣禾種業股份有限公司,農業農村部西北內陸棉花品種創制重點實驗室，新疆 昌吉 831100)

植物在漫長的發育歷史中，進化出了應對一系列生物脅迫和環境脅迫的機制。例如，通過結構形態變化防治病害侵入組織結構抗性[1]；植物相關組織在病原菌入侵時，通過合成植保素來提高植物抗病性的生理生化抗性[2]；植物防御病原菌入侵及其他損傷因子危害時，通過水楊酸(Salicylic acid，SA)、茉莉酸(Jasmonic acid，JA)等植物激素及其介導的信號通路參與防御反應的植物激素介導的抗性[3]；通過病原物模式分子引發的免疫反應(PAMP-triggered immunity，PTI)和效應分子引發的免疫反應 (Effector-triggered immunity，ETI)來抵御病原菌侵害的抗病基因介導的抗性[4]。

轉錄因子(Transcription factor，TF)通過與真核基因啟動子區域的順式作用元件特異結合，從而激活或抑制下游基因的轉錄。這些轉錄因子主要包括WRKY、MYB、NAC、bZIP等。其中WRKY是植物特有的一個轉錄因子大家族，通常由1～2個保守WRKY結構域構成，該結構域的N端為WRKYGQK序列，C端為(C-X4-5-C-X22-23-H-X1-H或C-X7-C-X23-H-X1-C)鋅指結構。根據WRKY結構域的數量和鋅指結構的特征，可以分為Ⅰ類、Ⅱ類和Ⅲ類[5-6]。WRKY一般與靶基因啟動子區的W-box元件序列(T)TGAC(C/T)結合，進而調控下游基因的轉錄[7-8]。

植物WRKY在受到病原菌等刺激時能夠快速表達，調控下游抗病基因的表達，在生物抗病性方面具有十分關鍵的作用。在擬南芥中，有許多WRKY轉錄因子編碼基因都受到病原菌和抗病激素誘導，主要包括AtWRKY3、AtWRKY4、AtWRKY18、AtWRKY22、AtWRKY27、AtWRKY28、AtWRKY29、AtWRKY30、AtWRKY33、AtWRKY38、AtWRKY40、AtWRKY46、AtWRKY48、AtWRKY53、AtWRKY58、AtWRKY62、AtWRKY70等轉錄因子編碼基因[8-10]。在水稻中，同樣存在不少WRKY基因響應病原菌誘導，如：OsWRKY7、OsWRKY10、OsWRKY11、OsWRKY17、OsWRKY28、OsWRKY30、OsWRKY32、OsWRKY45、OsWRKY62、OsWRKY64、OsWRKY70、OsWRKY76、OsWRKY82等[11-14]。在棉花中也有一些抗病相關的WRKY報道[15-19]，但是棉花中抗病WRKY蛋白仍有許多沒有進行研究。因此，探究棉花中WRKY轉錄因子的抗病性研究有著重要的理論和實際應用價值。

黃萎病作為影響棉花產量和質量的主要病害，有“棉花癌癥”的俗稱。我國的黃萎病病原菌主要為大麗輪枝菌(Verticilliumdahliae)，是一種土傳性、植物維管束病害。由于大麗輪枝菌具有復雜、存活時間長、寄生在植物維管束內等特征，因此，目前對其防治手段有限，防治效果不理想。培育抗病品種被認為是防治黃萎病最適宜的方法，因此，克隆和鑒定抗病基因成為當前抗病育種培育的主要手段。本研究從陸地棉(Gossypiumhirsutum)中分離一個抗病相關的轉錄因子WRKY編碼基因，命名為GhWRKY7。GhWRKY7蛋白定位在細胞核內，受到大麗輪枝菌和抗病激素SA和JA的誘導，GhWRKY7在棉花葉和根中表達明顯高于莖稈中；當黃萎病菌侵染棉花時，GhWRKY7沉默植株對大麗輪枝菌抗性明顯低于對照，且其棉花抗病標記基因PR1、PR3、PR4、PR5、PDF1.2、PAL1和CYP71B36表達顯著下調。進一步研究揭示GhWRKY7基因能夠轉錄激活GhCYP71B36的表達，促進植保素Camalexin的合成。結果表明，GhWRKY7基因調控如植保素Camalexin合成等相關下游基因的表達，提高棉花植株對大麗輪枝菌的抗性。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

陸地棉材料為中棉所35號和本氏煙草(Nicotianabenthamiana)，保存于中國科學院微生物研究所植物基因組學國家重點實驗室。

大腸桿菌菌株(Escherichiacoli)DH5α、根癌農桿菌菌株(Agrobacteriumtumefaciens)GV3101、大麗輪枝菌菌株V991都由本實驗室保存。

煙草脆裂病毒(Tobaccorattlevirus，TRV)載體：pYL-156(陰性對照載體)、pYL-156-PDS(陽性對照載體)和pYL-192(輔助載體)以及pCAMBIA1302-GFP載體、pBI121-GUS載體均保存于本實驗室。

植物RNA提取試劑盒、質粒提取試劑盒和Master qPCR Mix(SYBR Green Ⅰ with UDG)試劑盒均購自北京擎科生物科技有限公司；各種限制性內切酶及其相關Buffer試劑購自寶日醫生物技術(北京)有限公司；基因片段克隆PCR反應所需試劑和反轉錄試劑盒購自北京全式金生物技術有限公司；PCR產物純化回收試劑盒及PCR切膠回收試劑盒購自Omega Bio-Tek；DNA連接酶相關試劑購自南京諾唯贊醫療科技有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 抗病WRKY序列比對分析及進化樹構建 根據文獻報道，從擬南芥基因庫(https：//www.arabidopsis.org/index.jsp)和水稻基因庫(https：//ricedata.cn/gene/)中下載抗病相關WRKY氨基酸序列。將下載的抗病AtWRKY和抗病OsWRKY與陸地棉植株中克隆的一個抗病基因GhWRKY7(Gh_D05G2499)編碼蛋白進行氨基酸序列比對，使用MAGE 5.2軟件生成系統進化樹，在線iTOL(https://itol.embl.de/)對進化樹進行修飾。

1.2.2 植物材料培育 濃硫酸脫絨后，選取顆粒飽滿、品相相當的棉花種子浸泡于水中，37 ℃過夜。轉移種子至濕紙巾內，潮濕黑暗室溫環境下萌發。待種子根部長至2～3 cm時，選取長勢一致的幼苗，仔細去殼后種入混合土壤中(蛭石∶營養土=1∶1)，蓋上保鮮膜，培養箱內培育(溫度為25 ℃，照明為光照16 h / 黑暗8 h)；待種子根長達到3 cm左右時，選取長勢相當的幼苗，去殼后轉到水培盒中，盒內加入B5營養液(每7 d換1次)，并附上保鮮膜，放入培養箱內培育，培育條件同土培，待子葉展開后，去掉保鮮膜。每天定時關注幼苗生長情況，確保植株正常生長以便用于試驗需要。

將煙草種子撒在一個裝有水分充足混合土壤(營養土 ∶蛭石=1∶1)的小花盆中，蓋上保鮮膜放入培養箱中。

1.2.3 棉花RNA提取及逆轉錄cDNA合成 采集樣品植株，立即液氮研磨。按試劑盒說明書操作，提取棉花總RNA并檢測濃度，-80 ℃保存。cDNA合成參照試劑盒說明書進行逆轉錄，-20 ℃保存以備后續試驗。

1.2.4 Quantitative Real-time-PCR 選優質逆轉錄cDNA為模板，設計目的基因特異引物(表1)。以棉花UBQ7作為內參基因，設計內參基因引物(表1)按照試劑說明書配制反應體系，設置運行程序。重復3次生物學試驗，按2-ΔΔCt計算基因的相對表達量。

1.2.5 大麗輪枝菌的活化培育與接菌處理 將保存的大麗輪枝菌液涂布于PDA平板，28 ℃培養2～3 d。從平板上挑取菌絲，轉接至察氏培養基中，28 ℃，200 r/min，3～4 d。紗布過濾菌絲后，顯微鏡下用血球計數板統計孢子數量(Spores)，稀釋孢子液至1.0×106spores/mL。接菌處理：選取正常生長約14 d的水培棉花植株進行統一傷根處理后，將培養液換成大麗輪枝菌孢子液(1.0×106spores/mL)繼續培養。在0，12，24，36，48 h分別取樣進行GhWRKY7相對表達量分析。參照Zhang等[16]報道，對棉花植株進行接菌處理，重復3次生物學試驗，分別在接菌21 d后，觀察統計棉花發病株數和發病程度，并計算發病率和發病指數。

1.2.6 SA和JA激素處理 選取生長14 d左右長勢相當的棉花植株，取濃度0.1 mol/L的水楊酸和茉莉酸溶液各10 mL，均勻噴灑至棉花真葉表面。在0，1.5，4，7，12，24 h分別取樣，-80 ℃保存。

1.2.7 載體構建及農桿菌培養 以BamH Ⅰ和KpnⅠ為目標基因片段插入點，選取GhWRKY7基因特異性片段設計引物(表1)，并在引物前加入酶切位點及保護堿基，克隆回收該片段。對pYL-156載體和回收片段用BamHⅠ和KpnⅠ限制性內切酶37 ℃酶切2 h，純化后的片段與線性載體進行連接反應，構建TRV病毒表達載體pYL-156-GhWRKY7。

pCAMBIA1302-GFP載體以NcoⅠ和SpeⅠ酶切位點與GhWRKY7基因片段連接，構建 pCAMBIA1302-GhWRKY7-GFP載體。pBI121-GUS載體以ScaⅠ和BamH Ⅰ雙酶切處理，GhCYP71B36啟動子(GhCYP71B36pro)替換35S啟動子(35Spro)，構建報告載體pBI121-GhCYP71B36pro-GUS；以XbaⅠ和ScaⅠ雙酶切處理，GhWRKY7替換GUS，構建表達載體pBI121-GhWRKY7。

將構建好的質粒轉入大腸桿菌DH5α，涂布在含卡那霉素(50 mg/mL)抗性的LB固體培養基上，37 ℃過夜培養。挑選正常生長的單菌落進行測序鑒定，獲得含GhWRKY7特異性片段的病毒表達載體。用電擊法將構建好的質粒載體分別轉入農桿菌GV3101，涂布在含卡那霉素(50 mg/mL)和利福平(25 mg/mL)抗性的LB固體培養基上，28 ℃培養1～2 d，挑選陽性克隆進行測序驗證，成功轉入農桿菌的菌液-80 ℃保存。

1.2.8 沉默植株培育 從-80 ℃取出構建成功的農桿菌，接種到含相應抗性的LB液體培養基中，28 ℃，200 r/min過夜培養。收集菌體后用MMA(0.01 mol/L MES，0.01 mol/L MgCl2，0.2 mol/L AS)混合液重選菌體，將OD600調至1.2。將含陽性對照、陰性對照和重組載體的農桿菌重懸液分別與輔助載體的農桿菌重懸液按1∶1等體積混合，室溫黑暗靜置2～3 h。

選取正常生長至兩子葉完全展開且長勢相當的棉花植株，用無菌注射器針頭在棉花子葉下表皮劃出傷口，注射靜置好的混合菌液，至整片子葉被充分浸潤，注射好的棉花植株黑暗避光生長12 h后，轉入培養箱正常培育。

1.2.9 煙草瞬時表達 重懸菌液后，將OD600調至0.8，室溫避光靜置2～3 h。選取生長健康的煙草植株，用無菌注射器針頭在無損葉片的下表皮劃出傷口，注射靜置好的菌液，黑暗避光12 h后，轉入培養箱。

1.2.10 亞細胞定位分析 分別注射含pCAMBIA1302-GhWRKY7-GFP和pCAMBIA1302-GFP載體的農桿菌到煙草葉片24 h后，用激光共聚焦顯微鏡Leica SP8觀察熒光結果。

1.2.11 GUS染色 將注射好的煙草葉片在24 h后剪下，浸泡在90%丙酮中，4 ℃過夜脫色。PBS緩沖液漂洗后，GUS染液避光37 ℃放置1～3 d，觀察葉片染色情況，用70%乙醇漂洗染色成功的葉片，至葉片呈白色，便于觀察試驗結果并進行比較。

表1 引物序列Tab.1 Primer sequence

2 結果與分析

2.1 生物信息學分析抗病WRKY蛋白

前期初步報道了8個棉花抗病相關WRKY蛋白對大麗輪枝菌響應情況[15]，擬對GhWRKY7的抗病性進行深入研究。將GhWRKY7蛋白序列與28個擬南芥抗病WRKY蛋白和25個水稻抗病WRKY蛋白進行序列比對，結果顯示，抗病相關WRKY在Ⅰ類、Ⅱ類和Ⅲ類中均存在，GhWRKY7和AtWRKY7均屬于Ⅱ類(圖1)；有趣的是抗病相關WRKY蛋白在3個類型都存在，表明不同WRKY結構域數量和鋅指結構類型都有可能參與其調控植物抗病響應。

2.2 GhWRKY7-GFP融合蛋白亞細胞定位

將GhWRKY7基因克隆并插入pCAMBIA1302-GFP植物表達載體(35S∶GFP)，得到pCAMBIA1302-GhWRKY7-GFP載體(35S∶GhWRKY7-GFP)，轉化農桿菌進行煙草葉片瞬時表達分析，結果如圖2所示，在激光共聚焦顯微鏡Leica SP8下觀察到35S∶GhWRKY7-GFP僅在植物細胞核呈現明顯的綠色熒光，細胞內其他部分沒有熒光。對照35S∶GFP在煙草葉片細胞中也呈現正常綠色熒光，在細胞膜和細胞核中均有表達，該結果表明，GhWRKY7蛋白定位于植物細胞核中。

2.3 GhWRKY7組織特異性表達和接菌誘導表達分析

利用qPCR方法分析GhWRKY7在棉花的根、莖和葉器官中的相對表達量，結果表明，GhWRKY7雖然在3個組織部位均有表達，但是其在根與葉中的表達水平顯著高于莖(圖3-A)。在對大麗輪枝菌及水楊酸和茉莉酸抗病激素處理后，采集自不同時間點的棉花檢測GhWRKY7表達，結果表明，GhWRKY7的相對表達量變化較大。從圖3-B可以看出，相對于接菌0 h，GhWRKY7表達量在接菌后24，36，48 h呈現顯著增加。表明GhWRKY7基因表達受大麗輪枝菌誘導響應，暗示其參與調控棉花抗大麗輪枝菌的抗性。在水楊酸處理后，GhWRKY7表達量與0 h相比，在1.5，4，7，12，24 h均上調，其中在12 h表達量達到最大值(圖3-C)。在茉莉酸處理后，GhWRKY7表達量在1.5 h顯著上升達到最大值(P<0.05)，此后到24 h其表達量雖有回落，但是仍然顯著高于0 h表達量(P<0.05)(圖3-D)。這些結果表明，GhWRKY7基因表達受水楊酸和茉莉酸抗病激素誘導，暗示其抗病性可能涉及水楊酸和茉莉酸抗病激素信號通路。

Ⅰ類由2個WRKY結構域和C-X4-5-C-X22-23-H-X1-H鋅指結構構成；Ⅱ類由1個WRKY結構域和C-X4-5-C-X22-23-H-X1-H鋅指結構構成；Ⅲ類由1個WRKY結構域和C-X7-C-X23-H-X1-C鋅指結構構成。Group Ⅰ consists of two WRKY domains and a C-X4-5-C-X22-23-H-X1-H zinc finger structure；Group Ⅱ composed of a WRKY domain and a C-X4-5-C-X22-23-H-X1-H zinc finger structure；Group Ⅲ consists of a WRKY domain and a C-X7-C-X23-H-X1-C zinc finger structure.

A.35S∶GFP表達框示意圖；B.35S∶ GhWRKY7-GFP表達框示意圖；C.35S∶GhWRKY7-GFP和對照組35S∶GFP在激光共聚焦顯微鏡下細胞內分布。A.Schematic diagram of 35S∶GFP expression frame；B.Schematic diagram of 35S∶GhWRKY7-GFP expression frame；C.The distribution of 35S∶GhWRKY7-GFP and control 35S∶GFP under laser confocal microscope.

A.GhWRKY7組織表達分析；B.大麗輪枝菌對GhWRKY7誘導表達分析；C、D.SA和JA對GhWRKY7誘導表達分析。不同字母表示差異顯著(P<0.05)。圖4—6同。A.Tissue expression analysis of GhWRKY7；B.Induced expression analysis of GhWRKY7 by V.dahliae；C，D.Expression analysis of GhWRKY7 induced by SA and JA.The different alphabets stand for significant difference(P<0.05).The same as Fig.4—6.

2.4 GhWRKY7沉默植株對大麗輪枝菌的抗性下降

為了驗證GhWRKY7是否參與調控棉花對大麗輪枝菌抗性，利用VIGS技術培育GhWRKY7基因沉默植株進一步分析GhWRKY7基因的抗病功能。利用TRV載體構建了GhWRKY7沉默載體(圖4-A)。試驗設置陽性對照pYL-156-PDS，當植株真葉出現明顯白化現象時(圖4-B)，表明TRV沉默系統在棉花中能夠沉默內源基因的表達。此時，利用qPCR分析GhWRKY7在沉默植株中的相對表達量，結果表明，沉默植株中GhWRKY7基因的平均相對表達量下降了50%以上(圖4-C)。

為進一步研究GhWRKY7的抗病功能，對GhWRKY7沉默植株接種大麗輪枝菌，觀察抗病表型，結果顯示，接菌21 d后，GhWRKY7沉默植株(TRV∶GhWRKY7)葉片發黃、萎蔫脫落現象等病征明顯高于對照組(TRV∶00，圖5-A)。TRV∶GhWRKY7植株的發病高達94.44%，而對照組為83.33%；試驗組病情指數達76.04，對照組為58.33(圖5-B，C)。為進一步確認大麗輪枝菌對沉默植株的浸染，將發病植株和未接菌植株的棉花主莖稈進行切面分析，觀察維管束褐化情況，結果表明，TRV∶GhWRKY7植株維管束褐化程度明顯高于對照組，而未接菌的棉花莖組織的維管束沒有褐化現象(圖5-D)。發病植株莖段的病菌恢復培養結果顯示，沉默植株的病原菌菌落數明顯高于對照組(圖5-E)。綜上所述，這些結果表明，GhWRKY7基因正調控棉花對大麗輪枝菌的抗性。

2.5 GhWRKY7參與棉花抗病性涉及SA和JA信號通路

通過前面試驗表明，GhWRKY7基因表達響應SA和JA激素的誘導(圖3-C、D)。利用qPCR技術檢測沉默植株接菌21 d后，檢測SA和JA抗病標志基因表達水平；3個SA相關基因GhPR1、GhPR5和GhPAL1表達水平在GhWRKY7基因沉默植株中顯著下降；3個JA相關基因GhPR3、GhPR4和GhPDF1.2及植保素(Camalexin)合成相關基因GhCYP71B36表達在沉默植株中也呈顯著下降水平(P<0.05)。結果表明，GhWRKY7沉默嚴重降低了7個抗病基因的表達(圖6)，進一步表明了GhWRKY7參與植株抗病性調控可能涉及SA和JA信號轉導通路。

2.6 GhWRKY7促進GhCYP71B36轉錄表達提高棉花抗病性

細胞色素P450(Cytochrome P450，CYP)編碼基因在植物基因組中比例高達1%，在植物化學物質的生物合成途徑中必不可少，有助于植物應對生物脅迫和環境脅迫時的化學防御機制[20]，其中CYP71是植物P450中最大的集團。據文獻[21-22]報道，AtWRKY33能轉錄激活AtCYP71B15(PAD3)的

A.pYL-156-GhWRKY7沉默載體構建示意圖，其中包含強啟動子(35Spro)、NOSter終止子序列和用于各種目的基因片段構建的多克隆位點(Multiple clone sites，MCS)，GhWRKY7基因特異性片段大小為300 bp；B.陽性植株葉片白化表型；C.陰性對照與沉默植株中GhWRKY7基因相對表達量分析。

A.GhWRKY7沉默植株與對照組發病表型；B.植株發病率；C.病情指數；D.接菌棉花主莖稈切面維管束表型：WT為未接菌正常發育棉花植株；TRV∶00和TRV∶GhWRKY7為對照和沉默植株接菌21 d后，發病植株的主莖稈切面表型；E.接菌植株莖段恢復培養后，大麗輪枝菌生長情況。

表達，從而促進植保素Camalexin的合成，提高植物抗病性。將AtCYP71B15基因序列在棉花基因庫中進行Blast比對，獲得棉花同源基因GhCYP71B36，經過前面的分析表明，沉默GhWRKY7植株在接菌狀態下，降低了GhCYP71B36的表達水平(圖6-C)。因此，本研究利用GUS報告系統來分析棉花WRKY7是否也激活GhCYP71B36表達。首先克隆了GhCYP71B36基因的啟動子，分別構建相應的激發載體和報告載體(圖7-A)。如圖7-B所示，僅僅注射含GhCYP71B36pro-GUS重組質粒農桿菌的煙草葉片部分顯示較淺的GUS藍色，而GhCYP71B36pro-GUS在與GhWRKY7等量共注射的煙草葉片部分，GUS藍色明顯加深，說明GhWRKY7能促進GhCYP71B36轉錄，提高植保素Camalexin合成，從而提高棉花的抗病性。

A.GhWRKY7沉默植株與對照組中SA抗病標志基因相對表達量；B.JA抗病標志基因相對表達量；C.GhCYP71B36相對表達量。GhWRKY7沉默植株與對照組的表達量測定于大麗輪枝菌浸染后21 d。A.Relative expression levels of three SA marker genes in GhWRKY7-silenced plants and control plants; B. Relative expression levels of three JA marker genes；C.Relative expression levels of GhCYP71B36. GhWRKY7-silenced plants and control group infection with V.dahliae at 21 days were sampled.

A.pBI121-GhWRKY7表達載體與pBI121-GhCYP71B36pro-GUS報告載體構建示意圖；B.左為煙草瞬時表達的GUS染色結果，右為煙草葉片各部分注射情況。陽性對照pBI121-GUS菌液。A.Schematic diagram of construction of pBI121-GhWRKY7 expression vector and pBI121-GhCYP71B36pro-GUS reporting vector；B.GUS staining results of transient expression of tobacco on the left，on the right is the injection of each part of tobacco leaf.Positive control pBI121-GUS bacterial solution.

3 結論與討論

本研究從陸地棉中分離出了植物抗病基因GhWRKY7，通過構建TRV病毒載體，獲得棉花GhWRKY7沉默植株并對其接種大麗輪枝菌，21 d后觀察沉默植株與對照發病情況不同，對其抗病相關基因進行研究分析，驗證了GhWRKY7基因在棉花中對抗大麗輪枝菌侵染起到正向調控作用；揭示了GhWRKY7受到SA和JA激素誘導參與棉花抗病；進一步分析GhWRKY7通過促進如GhCYP71B36的轉錄激活，提高植保素Camalexin合成，增強植株對黃萎病的抗性。

WRKY作為植物中特有的轉錄因子大家族，參與植物防衛反應的信號轉導，在植物抗病中起到重要作用。本研究中，當GhWRKY7沉默時，SA相關基因GhPR1、GhPR5和GhPAL1表達水平顯著下降，同時3個JA相關基因GhPR3、GhPR4和GhPDF1.2也呈顯著下降水平。結果表明，GhWRKY7沉默嚴重降低了7個抗病基因的表達；同時，GhWRKY7表達也受到抗病激素SA和JA的誘導；結果揭示，棉花WRKY7通過調控抗病激素SA和JA相關的抗病基因表達，同時又受到SA和JA激素的誘導表達，來影響植株對大麗輪枝菌的抗性。在其他植物中也有類似的報道，如SA誘導提高甘蔗WRKY5的表達，從而調節對青枯病鐮刀菌的抗性[23]。在番茄里，SA上調SlWRKY8的表達，過表達SlWRKY8提高植株對丁香假單胞菌的抗性[24]。Kuki等[25]從小麥分離出4個WRKY轉錄因子TaWRKY49、TaWRKY92、TaWRKY112和TaWRKY142，都能誘導SA標志基因PR1的過表達，其中TaWRKY142同時誘導JA標志基因PDF1.2表達。在擬南芥中，抑制AtWRKY70表達會激活JA途徑中COI1基因表達，AtWRKY70過表達會提高對SA介導的白粉病菌抗性，同時降低對JA介導黑斑病菌的抗性等[26]。由此可見，GhWRKY7和一些報道WRKY轉錄因子都是通過參與激活或抑制SA和JA途徑來提高植株對病原菌的抗性。

本研究發現，沉默GhWRKY7能夠顯著降低植保素合成的關鍵基因GhCYP71B36的表達。通過該基因的啟動子進行細胞內轉錄激活分析顯示，GhWRKY7能夠促進GhCYP71B36表達，提高植保素Camalexin合成，從而提高棉花對大麗輪枝菌的抗性。在擬南芥中，WRKY33在磷酸化修飾后能夠轉錄激活AtCYP71B15(PAD3)的表達，促進植保素Camalexin的合成，提高植株的抗病性[21-22]。由此可見，GhWRKY7可能也是通過磷酸化修飾途徑來調控GhCYP71B36表達，從而促進植保素Camalexin的合成；關于GhWRKY7磷酸化修飾功能的轉變值得進一步研究。

本研究揭示GhWRKY7基因表達受到大麗輪枝菌入侵和抗病激素JA和SA誘導表達；沉默該基因顯著降低了植株的抗病性。GhWRKY7蛋白定位在細胞核中，能夠激活CYP71B36轉錄，促進植保素Camalexin合成，提高植株對大麗輪枝菌的抗性。作為棉花防衛途徑中重要的調控蛋白，GhWRKY7可以作為棉花育種候選基因來培育棉花抗病新品種，保障棉花的安全生產。