黃芩素通過誘導(dǎo)活性氧產(chǎn)生抑制MET/Akt信號通路促進人結(jié)腸癌SW480細(xì)胞凋亡

徐佳麗，路上云，王 佳，石東星，邱服斌

（山西醫(yī)科大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院營養(yǎng)與食品衛(wèi)生學(xué)教研室，山西 太原 030001）

結(jié)腸癌是最常見的惡性腫瘤之一。近年來，結(jié)腸癌在我國的發(fā)病率和死亡率仍不斷上升。盡管在診斷和治療方面取得了很大進展，然而由于早期癥狀不明顯，被發(fā)現(xiàn)時患者已經(jīng)處于中晚期，治療效果較差，結(jié)腸癌的防治形勢仍較為嚴(yán)峻［1-2］。目前，結(jié)腸癌的治療方法主要為手術(shù)切除、化學(xué)治療和物理治療等，易引發(fā)不良反應(yīng)和各種并發(fā)癥，患者預(yù)后較差，死亡率高［3］。

中藥及其活性成分有多種生物活性，日益受到人們關(guān)注。黃芩素（baicalein）是中藥黃芩的主要活性成分，具有抗炎、抗心血管疾病和抗菌等活性［4-6］，廣泛應(yīng)用于多種疾病的預(yù)防與治療。此外，越來越多的研究也表明，黃芩素具有很好的抗腫瘤活性，可通過調(diào)控磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B（phosphatidylinositol 3-kinase/protein kinase B，PI3K/Akt）、絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）、雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin，mTOR）和NF-κB家族等信號通路，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡［4，7-9］，發(fā)揮抗乳腺癌、肝癌、甲狀腺癌、肺癌、胃癌和宮頸癌等作用［10-15］。有研究發(fā)現(xiàn)，黃芩素能夠促進MAPK的激活，調(diào)節(jié)Akt/mTOR信號通路，引起人結(jié)腸癌細(xì)胞的凋亡［16］，防止大鼠結(jié)腸組織病變［17］，表明黃芩素很可能在預(yù)防和治療結(jié)腸癌的過程中發(fā)揮重要作用。

結(jié)腸組織中間充質(zhì)表皮轉(zhuǎn)化因子（mesenchymalepithelial transition factor，MET）和Akt等異常激活與結(jié)腸癌的發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移和預(yù)后密切相關(guān)［18］。MET是一種關(guān)鍵的酪氨酸激酶［19］，可以調(diào)控PI3K/Akt信號通路，抑制甲狀腺癌細(xì)胞增殖［20］，增加骨肉瘤細(xì)胞凋亡率［21］等，為此推測黃芩素可能通過調(diào)控MET/Akt信號通路來影響結(jié)腸癌細(xì)胞凋亡。已有研究表明，活性氧（reactive oxygen species，ROS）的產(chǎn)生及其對下游信號通路的調(diào)控與多種腫瘤細(xì)胞的凋亡密切相關(guān)［22-24］。但黃芩素是否通過誘導(dǎo)ROS生成抑制MET/Akt途徑而促進結(jié)腸癌細(xì)胞發(fā)生凋亡尚不清楚。因此，本研究通過觀察黃芩素對SW480細(xì)胞中ROS水平及MET和Akt蛋白表達的影響，探究其對結(jié)腸癌細(xì)胞抑制和凋亡誘導(dǎo)作用，為黃芩素的開發(fā)應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 藥品、試劑和主要儀器

黃芩素（純度＞98%），中國云南西力生物公司，溶于二甲亞砜配置成濃度為80 mmol·L-1的母液。DMEM高糖培養(yǎng)基、RIPA裂解緩沖液、BCA蛋白濃度測定試劑盒和0.25%胰酶溶液，武漢博士德公司；胎牛血清，杭州四季青公司；二甲亞砜和磷酸緩沖液（phosphate buffered sopution，PBST），北京索萊寶公司；兔抗人活化胱天蛋白酶3多抗、兔抗人活化聚腺苷二磷酸核糖聚合酶（ADP-ribosepolymerase，PARP）多抗、兔抗人磷酸化MET（phosphorylated-MET，p-MET）單抗、兔抗人磷酸化Akt（p-Akt）單抗和兔抗人磷酸化重組人源組蛋白（p-histone H3，p-H3）多抗，美國 CST公司；兔抗人β肌動蛋白多抗，南京巴傲得生物科技有限公司；小鼠抗人MET多抗和小鼠抗人H3多抗，沈陽萬類生物科技有限公司；小鼠抗人Akt多抗，美國Santa公司；辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔和山羊抗小鼠IgG抗體（二抗），武漢三鷹生物技術(shù)有限公司；超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）和過氧化氫酶（catalase，CAT）生化試劑盒，南京建成生物工程研究所；Annexin V-FITC/PI細(xì)胞凋亡檢測試劑盒，北京博爾邁生物技術(shù)有限公司；ROS免疫熒光測試劑盒，上海碧云天公司。生物安全柜（ZHJH-C1112B），上海智誠分析儀器制造有限公司；細(xì)胞恒溫培養(yǎng)箱（CCL-170B-8），新加坡ESCO公司；倒置顯微鏡（T5），日本Olympus公司；離心機，美國Thermo Forma公司；電泳儀及轉(zhuǎn)膜系統(tǒng)，美國Bio-Rad公司；化學(xué)發(fā)光成像儀（BG-gdsAUTO 710），北京百晶生物技術(shù)有限公司。

1.2 細(xì)胞、細(xì)胞培養(yǎng)、分組和處理

人結(jié)腸癌細(xì)胞SW480由山西省腫瘤醫(yī)院動物實驗室饋贈。將SW480細(xì)胞在含10%胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)基中，37℃，5%CO2及飽和濕度條件下進行常規(guī)培養(yǎng)。細(xì)胞以每孔1×106的密度接種于6孔板，使其24 h內(nèi)生長密度達到60%～80%。將黃芩素（80 mmol·L-1）儲備液用DMSO稀釋成40 mmol·L-1工作液備用。在培養(yǎng)基中分別加入工作液使黃芩素終濃度分別為0（細(xì)胞對照組），20，40和80 μmol·L-1，處理細(xì)胞48 h。

1.3 光鏡和結(jié)晶紫染色法檢測細(xì)胞形態(tài)和存活率

取1.2分組處理的細(xì)胞，在光鏡下觀察細(xì)胞狀態(tài)并拍照，然后棄培養(yǎng)液，每孔加2 mL 1%戊二醛固定15 min，棄戊二醛，然后每孔加2 mL 0.02%結(jié)晶紫溶液染色30 min，洗凈晾干，加入8 mL 75%乙醇溶解4～6 h，酶標(biāo)儀595 nm 下檢測吸光度（A595nm）值，75%乙醇溶液為空白，計算細(xì)胞存活率。細(xì)胞存活率（%）=（給藥組A595nm-空白組A595nm）/（細(xì)胞對照組A595nm-空白組A595nm）×100%。

1.4 免疫熒光檢測ROS水平

細(xì)胞以每孔1×106的密度接種于6孔板，分為細(xì)胞對照組，黃芩素20，40和80 μmol·L-1組，干預(yù)20 h。棄細(xì)胞上清液，每孔加入 200 μL（稀釋比 1∶1000）的2'，7'-二氯二氫熒光素二乙酸酯（2，7-dichlorodihydrofluorescein diacetate，DCFH-DA），37℃培養(yǎng)箱孵育20 min。用無血清細(xì)胞培養(yǎng)液洗滌細(xì)胞3次，充分去除未進入細(xì)胞的DCFH-DA，用熒光顯微鏡觀察，以熒光強弱反映ROS水平。

1.5 生化試劑盒檢測SOD和CAT活性

收集1.2分組處理細(xì)胞，提取各組細(xì)胞總蛋白，并用BCA蛋白濃度測定試劑盒檢測各組蛋白濃度。根據(jù)試劑盒說明書操作要求檢測細(xì)胞內(nèi)SOD和CAT的活性。

1.6 流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡率

取1.2分組處理的細(xì)胞，胰酶消化，收集細(xì)胞，反復(fù)洗滌后加入85 μL結(jié)合緩沖液重懸細(xì)胞，轉(zhuǎn)入流式細(xì)胞管內(nèi)，避光加入5 μL碘化丙啶（propidium iodide，PI）染液和 10 μL Annexin Ⅴ，避光孵育30 min，最后加入400 μL結(jié)合緩沖溶液，混勻后使用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡率。

1.7 Western印跡法檢測凋亡相關(guān)蛋白水平和磷酸化水平

取1.2分組處理的細(xì)胞，提取各組細(xì)胞總蛋白。用BCA蛋白濃度測定試劑盒檢測各組蛋白濃度。變性后進行聚丙烯酰胺凝膠電泳，濕法轉(zhuǎn)膜，5%脫脂牛奶室溫封閉2 h，分別加入相應(yīng)一抗（抗活化胱天蛋白酶3、活化PARP、Akt、p-Akt、MET、p-MET和p-H3抗體，均1∶1000；抗H3抗體，1∶400；抗β肌動蛋白抗體，1∶8000），4℃孵育過夜；孵育結(jié)束后PBST洗滌3次，每次10 min，加入相應(yīng)二抗（1∶10 000），室溫孵育2 h，PBST漂洗3次后ECL發(fā)光液顯色，于凝膠成像系統(tǒng)下成像，用ImageJ軟件檢測蛋白條帶積分吸光度值，以目標(biāo)蛋白與內(nèi)參蛋白條帶積分吸光度比值表示目標(biāo)蛋白相對表達水平，以磷酸化蛋白與總蛋白積分吸光度比值表示蛋白磷酸化水平。

1.8 統(tǒng)計學(xué)分析

實驗結(jié)果數(shù)據(jù)以±s表示。采用SPSS 25.0軟件進行單因素方差分析（One-way ANOVA），組間兩兩比較采用Tukey檢驗，量效關(guān)系采用pearson相關(guān)分析。P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 黃芩素對SW480細(xì)胞形態(tài)和存活率的影響

光鏡下觀察各組細(xì)胞形態(tài)（圖1A）顯示，細(xì)胞對照組細(xì)胞形態(tài)正常，細(xì)胞輪廓清晰可見，均處于貼壁狀態(tài)；黃芩素20，40和80 μmol·L-1組隨濃度增加貼壁細(xì)胞數(shù)量逐漸減少，部分細(xì)胞輪廓模糊。結(jié)晶紫染色結(jié)果顯示，與細(xì)胞對照組相比，黃芩素20，40和80 μmol·L-1組貼壁細(xì)胞數(shù)量明顯減少（圖1B1）。圖1B2結(jié)果顯示，黃芩素可濃度依懶性降低細(xì)胞存活率（r=-0.928，P＜0.01）。

Fig.1 Effect of baicalein on cell viability of SW480.SW480 cells were treated with baicalein for 48 h.A was the images observed under a light microscope.B1 was the images of SW480 cells detected by crystal violet staining，B2 was the the semi-quantitative result of B1.Cell viability(%)=（A595 nmof baicalein group-A595 nmof blank group）/（A595 nmof cell control group-A595 nmof blank group）×100%.±s，n=3.＊＊P＜0.01，compared with cell control（0）group.

2.2 黃芩素對SW480細(xì)胞ROS生成的影響

與細(xì)胞對照組相比，黃芩素20，40和80 μmol·L-1處理20 h后，細(xì)胞內(nèi)熒光強度顯著增強（P＜0.01），表明黃芩素可誘導(dǎo)ROS生成（圖2）。

Fig.2 Effect of baicalein on reactive oxygen species（ROS） generation in SW480 cells by fluorescence probe.The cells were treated with baicalein for 20 h.B was the semi-quantitative result of A.FI：fluorense intensity.±s，n=3.＊＊P＜0.01，compared with cell control group.

2.3 黃芩素對SW480細(xì)胞SOD和CAT活性的影響

與細(xì)胞對照組相比，黃芩素處理48 h后，SW480細(xì)胞SOD和CAT活性明顯降低（P＜0.05，P＜0.01），表明黃芩素誘導(dǎo)ROS的產(chǎn)生可能與抑制SOD和CAT的活性有關(guān)（表1）。

Tab.1 Effect of baicalein on activities of superoxide dismutase(SOD)and catalase(CAT)in SW480 cells

2.4 黃芩素對SW480細(xì)胞凋亡的影響

流式細(xì)胞儀檢測結(jié)果顯示（圖3），與細(xì)胞對照組相比，黃芩素 40 和 80 μmol·L-1處理 48 h 后，SW480細(xì)胞凋亡率明顯升高（P＜0.01）。黃芩素可濃度依賴性誘導(dǎo)SW480細(xì)胞凋亡（r=0.988，P＜0.01）。

Fig.3 Effect of baicalein on apoptosis of SW480 cells detected by flow cytermetry.See Fig.1 for the cell treatment.±s，n=3.＊＊P＜0.01，compared with cell control group.

2.5 黃芩素對SW480細(xì)胞活化胱天蛋白酶3和活化PARP蛋白表達的影響

Western印跡結(jié)果顯示（圖4），與細(xì)胞對照組相比，黃芩素40和80 μmol·L-1組SW480細(xì)胞中活化胱天蛋白酶3和活化PARP蛋白水平明顯升高（P＜0.05，P＜0.01），表明黃芩素可通過活化胱天蛋白酶依賴性凋亡途徑誘導(dǎo)SW480細(xì)胞死亡。

Fig.4 Effect of baicalein on protein expression levels of cleaved-polymerase（PARP）and cleaved-caspase 3 in SW480 cells by Western blotting.See Fig.1 for the cell treatment.B was the semi-quantitative result of A.±s，n=3.＊P＜0.05，＊＊P＜0.01，compared with cell control group.

2.6 黃芩素對SW480細(xì)胞MET/Akt信號通路相關(guān)蛋白磷酸化水平的影響

與細(xì)胞對照組相比，黃芩素20，40和80 μmol·L-1組 SW480細(xì)胞中 p-MET/MET，p-Akt/Akt和p-H3/H3比值明顯降低（P＜0.05，P＜0.01）（圖5）。

Fig.5 Effect of baicalein on mesenchymal-epithelial transition factor（MET），protein kinase B（MET/Akt）pathway related protein phosplorylation levels in SW490 cells by Western blotting.See Fig.1 for the cell treatment.B was the semi-quantitative result of A.±s，n=3.＊P＜0.05，＊＊P＜0.01，compared with cell control group.

3 討論

本研究結(jié)果顯示，黃芩素可誘導(dǎo)ROS產(chǎn)生，抑制MET/Akt信號通路，從而抑制SW480細(xì)胞增殖，促進結(jié)腸癌細(xì)胞凋亡。

ROS是機體氧化應(yīng)激時產(chǎn)生的主要分子，一直以來被認(rèn)為是腫瘤發(fā)生、發(fā)展和復(fù)發(fā)的重要因素［25-27］。在本研究中，黃芩素干預(yù)會明顯抑制SW480細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)細(xì)胞皺縮并發(fā)生凋亡；SW480細(xì)胞內(nèi)ROS熒光強度明顯增加，而抗氧化酶SOD和CAT活力均明顯下調(diào)，表明黃芩素可誘導(dǎo)結(jié)腸癌SW480細(xì)胞產(chǎn)生ROS，抑制抗氧化酶活力。提示ROS可能在調(diào)節(jié)SW480細(xì)胞凋亡中發(fā)揮重要作用。

胱天蛋白酶3是胱天蛋白酶家族的重要成員，是發(fā)生凋亡的標(biāo)志性蛋白［28］。胱天蛋白酶3在內(nèi)源性通路中的激活可以調(diào)控細(xì)胞凋亡的啟動與執(zhí)行［29］。本研究結(jié)果表明，黃芩素干預(yù)后，SW480細(xì)胞活化胱天蛋白酶3和活化PARP蛋白表達水平明顯增加，說明黃芩素可誘導(dǎo)SW480細(xì)胞凋亡。

研究報道，調(diào)控細(xì)胞凋亡可能與一系列蛋白表達有關(guān)，例如MAPK，NF-κB和MET等。MET在細(xì)胞增殖、代謝及腫瘤產(chǎn)生、轉(zhuǎn)移中扮演著重要角色，是近年來抗腫瘤研究的熱門靶點。T-淋巴因子激活的殺傷細(xì)胞來源的蛋白激酶（T-lymphokine-activated killer cell-originated protein kinase，TOPK）在結(jié)腸癌、肺癌和乳腺癌等癌癥中高度表達［30-32］。p-H3作為TOPK的底物，是最廣泛使用的有絲分裂標(biāo)記物［33］。研究表明，MET可以激活TOPK進而激活A(yù)kt促進結(jié)腸癌發(fā)生［25］。本研究結(jié)果顯示，經(jīng)黃芩素處理后，SW480細(xì)胞內(nèi)p-MET，p-H3和p-Akt蛋白表達水平明顯下調(diào)，表明黃芩素可能影響腫瘤細(xì)胞MET/Akt信號通路，進而誘導(dǎo)SW480細(xì)胞凋亡。

綜上，本研究表明，誘導(dǎo)人結(jié)腸癌SW480細(xì)胞產(chǎn)生ROS，抑制MET/Akt信號途徑，激活胱天蛋白酶3，可能是黃芩素誘導(dǎo)SW480細(xì)胞凋亡的機制之一。本研究為結(jié)腸癌防治及黃芩素的開發(fā)提供理論依據(jù)。