基于肝X受體探討健脾祛痰法對高脂血癥大鼠肝內膽固醇代謝通路的影響

洪詩曉，李墨辭，涂文玲，郭明章

(福建中醫藥大學 中醫學院，福建 福州 350122)

近年來，高膽固醇血癥成為動脈粥樣硬化(Atherosclerosis，AS)的高危因素，而AS可進一步導致冠心病、腦卒中等高危疾病[1]。研究發現，我國成人高脂血癥的患病率逐漸升高，已達20%，且該癥患病人群有年輕化趨勢[2]。西醫臨床多以他汀類、貝特類等為主要抗脂手段，長期服用則出現肌肉疼痛、橫紋肌溶解、痙攣等副作用，而中藥具有副作用低、療效顯著、愈后良好的優勢。因此，明確高膽固醇血癥的發病機理，尋找安全有效的中醫藥治療高脂血癥的方法為臨床迫切所需。

肝X受體(Liver X receptor，LXR)作為核受體，它在肝組織、腸道以及其他組織中廣泛存在，目前普遍認為，其表達是調節體內脂質代謝的重要途徑之一。LXR中的亞型之一，LXRα促進膽汁酸合成，從而降低血脂的作用途徑，主要通過前反饋激活CYP7A1導致膽汁酸合成增加[3]。LXR還可通過影響下游因子ABCG5、ABCG8的表達，促進膽固醇直接排入膽汁以助膽固醇排出體外[4]。近年來的研究表明，中醫運用健脾祛痰法治療高脂血癥及其引發的心血管疾病，與LXR通過對下游因子的影響作用，促進肝臟中膽固醇分解代謝并排出體外的途徑較為相似。其中，健脾祛痰法經典方溫膽湯化裁方在改善血液脂質水平，抵抗血液黏稠凝聚等療效明顯，但其具體作用機理尚未明確[5-7]。因此，本課題以LXR為切入點，探索健脾祛痰法對肝內膽固醇分解代謝及排出通路的影響機制，以期深入研究其代謝途徑，并為今后用藥提供理論依據。

1 材料與儀器

1.1 實驗動物

40只SPF級健康雄性SD大鼠，體質量(180±20)g，購自上海吉輝實驗動物飼養有限公司(許可證號：SCXK(滬)2017-0012)。動物飼養于福建中醫藥大學SPF級動物實驗中心，照明周期以12 h/12 h交替，換氣頻率為10～20次/h，溫度(23±2)℃。每組動物均自由飲水。本課題通過福建中醫藥大學實驗動物倫理委員會審查，批準文號：FJTCM IACUC 2020069。

1.2 藥物及飼料

本課題方藥溫膽湯化裁方藥物均購自福建中醫藥大學附屬第三人民醫院中藥房，組成為：薏米30 g、茯苓30 g、浙貝10 g、竹茹10 g、扁豆10 g、枳殼10 g、桔梗15 g、陳皮5 g、甘草5 g。配置方法：用蒸餾水將中藥材水煎30 min，提取兩次。將兩次煎液混合后用雙層紗布過濾，待藥液中無明顯雜質后，水浴加熱蒸發濃縮，該藥液配置完畢后需置于4℃冰箱保存，每次取用時須放置至常溫，方可進行灌胃。給藥劑量：溫膽湯化裁方3組灌藥的劑量通過人與大鼠體表面積比率換算法計算為6 g/kg、12 g/kg、25 g/kg。其余兩組分別按相應比例蒸餾水代替溫膽湯化裁方灌服，每次用藥體積均按1 mL/100 g計算，本次實驗給藥與造模同時進行。本課題使用的高脂飼料均購自上海帆泊生物技術有限公司，配方見表1。

表1 高脂飼料配方

1.3 主要試劑及儀器

1.3.1 試劑 主要試劑或試劑盒如下：大鼠膽固醇7a羥化酶(CYP7A1)、G5(ABCG5)、G8(ABCG8)試劑盒。江蘇酶免(SOD)、(MDA)試劑盒(TBA法)、江蘇酶免(GSH-PX)試劑盒(比色法)(江蘇酶免實業有限公司，批號如下：MM-0685R1、MM-70740R1、MM-70743R1、A001-3-2、A003-1-2、A005-1-2)。Trizol (RNA 提取試劑盒)、cDNA一鏈合成試劑盒、Gelred、SYBR Green熒光定量試劑盒(Vazyme公司，批號分別為：R401-01、R123-01、GR501-01、Q311)；PCR Mix、DNA maker II(北京艾德萊公司，批號分別為：PC0903、DM0702)。

1.3.2 儀器 本研究使用儀器見表2。

表2 主要實驗儀器

2 方法

2.1 分組、造模與給藥

40只大鼠分開適應性喂養7 d后，按體質量隨機平均分配為5組，分組情況和每組飼養情況見表3。

表3 大鼠分組情況

2.2 給藥方法及標本采集

從造模第一天起同時給藥，按1 mL/100 g鼠體質量的比例計算藥量。連續灌胃4周，取材前一晚禁食不禁水。20%烏拉坦(0.6 mL/100 g)腹腔注射麻醉，待麻醉后經腹主動脈取血，分離血清以便后續實驗使用；迅速取下肝左葉同樣部位組織，部分置于凍存管中保存于-80 ℃冰箱待測，部分置于4%多聚甲醛液中固定備用。

2.3 檢測指標及檢測方法

2.3.1 血清脂質含量 測定血清TC、TG、HDL、LDL 的含量：血液常溫靜置2 h，3 000 r/min離心10 min，抽取上清液，全自動生化分析儀檢測上清液相關指標。

2.3.2 肝功及病理指標檢測 使用生化檢測方法對肝組織中超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-PX)和脂質過氧化物(MDA)的病理指標進行檢測。

2.3.3 肝臟形態學觀察 將已固定的肝組織進行包埋、切片、HE染色，光學顯微鏡下觀察其病理形態。

2.3.4 分子生物學檢測 采用qPCR方法對LXRαmRNA表達水平進行測定。取適量肝組織進行碾磨，提取RNA，用紫外分析儀測其濃度與純度。進行PCR擴增時以mRNA逆轉錄的cDNA為模板。反應體系為：TB Green Ex Taq(TilRaseH Plus)(2x)10 μL、ROX Reference Dye Ⅱ(50x)0.4 μL，上下游引物各0.8 μL，ddH2O 6 μL，cDNA 2 μL。反應條件為：90 ℃ 30 s、90 ℃ 10 s、60 ℃ 30 s、95 ℃ 15 s、60 ℃ 1 min，40個循環。按照反轉錄試劑盒上的說明進行操作，其中，引物序列見表4。

表4 引物序列

2.3.5 ELISA法檢測肝組織中CYP7A1、ABCG5和ABCG8的蛋白表達水平 分組、加樣、溫育、顯色等操作按說明書依次進行。終止反應后用450 nm 波長測量各孔的吸光度(OD值)。

2.4 統計學方法

3 結果

3.1 大鼠體質量變化情況

實驗期間，正常組大鼠體型勻稱，皮毛順滑光澤，活動靈活，性情較為溫順；模型組大鼠體型肥胖，行動較為懶惰，與正常組相比皮毛較為暗淡蓬亂，易被激怒。各組大鼠體質量變化見表5。實驗末期，模型組大鼠體質量增長速度高于正常組大鼠(P<0.01)。與模型組比較，低劑量組大鼠體質量增長無差異，中、高劑量組體質量增量降低(P<0.01)。

表5 各組大鼠體質量增量比較

3.2 各組大鼠血清TC、TG、HDL、LDL 含量變化

與正常組比較，模型組TC、TG、LDL急劇上升(P<0.001，P<0.001，P<0.05)，HDL急劇下降(P<0.001)，這提示模型構建成功。與模型組比較，低劑量組TG明顯降低(P<0.001)。中、高劑量組TC、TG顯著降低(P<0.01，P<0.001)、LDL各自有不同程度的下降(P<0.05，P<0.001)、HDL顯著增高(P<0.001)，差異具有統計學意義。這表明溫膽湯化裁方在不同劑量時，均有相應的降脂效果。見表6。

表6 各組大鼠血清TG、TC、HDL、LDL含量比較

3.3 各組大鼠肝組織中SOD、GSH-PX、MDA的比較

模型組MDA明顯上升(P<0.001)，SOD、GSH-PX顯著下降(P<0.001)。低劑量組有所下降，但差異并無統計學意義。中、高劑量組MDA隨著藥物劑量的增長，其結果呈逐漸下降趨勢(P<0.01，P<0.001)，而SOD、GSH-PX也隨藥物劑量的增加呈現不同程度的上升趨勢(P<0.01，P<0.001)。見表7。

表7 各組大鼠肝組織SOD、GSH-PX、MDA水平組間比較

3.4 各組大鼠肝臟組織形態學變化

正常組大鼠細胞排列呈以中央靜脈為圓心的條索狀，無空洞，細胞結構完整，未見異常凋亡，無明顯脂肪樣變性。模型組大鼠細胞排列凌亂，難以辨認細胞邊界和肝小葉形態，細胞可見壞死或脂質樣改變、中性粒細胞浸潤，且出現大量空洞；與模型組比較，各治療組均有所改善，其中，以高劑量組病理改善效果為佳。見圖1。

3.5 各組大鼠肝組織中LXRαmRNA表達水平變化

模型組LXRαmRNA表達相對于正常組降低(P<0.05)。與模型組比較，低、中、高劑量組LXRαmRNA水平變化隨著給藥濃度增加而增加，其中，低、中劑量組差異無統計學意義，高劑量組LXRαmRNA表達水平則顯著增加(P<0.01)。見表8。

注：A為正常組，B為模型組，C為低劑量組，D為中劑量組，E為高劑量組。圖1 溫膽湯化裁方對高膽固醇血癥大鼠肝組織形態學變化的影響(HE，×400)

表8 各組大鼠肝組織中LXRαmRNA表達水平的變化

3.6 各組大鼠肝組織中CYP7A1、ABCG5和ABCG8的蛋白表達水平變化

與正常組比較，模型組大鼠肝組織CYP7A1、ABCG5和ABCG8的蛋白表達水平均明顯降低(P<0.001，P<0.05，P<0.001)。與模型組比較，低劑量組CYP7A1、ABCG5的蛋白表達水平明顯增高(P<0.01)，ABCG8的蛋白表達水平無統計學意義(P>0.05)；中、高劑量組CYP7A1、ABCG5和ABCG8蛋白表達水平明顯上升(P<0.05，P<0.01，P<0.001)。見表9。

表9 各組大鼠肝組織中CYP7A1、ABCG5和ABCG8的蛋白表達水平變化

4 討論

在傳統中醫理論中，雖無明確高脂血癥病名，但在論述此類病癥時，多以“膏”“痰”“濕”表述[8]。當體內臟腑陰陽不平衡時，氣血津液的生化代謝也會出現障礙，最后聚積成為痰濕。在中醫理論中，生痰之源為脾胃，若脾胃陰陽失調，功能不健，則津液積聚不能代謝，最后成為痰濕脂膏入血脈，脂質含量必然隨之增高。因此有醫家提出，高脂血癥雖病位在血液，但其致病本質還在于脾胃失調，不能運化黏稠的代謝產物，最終堆積則為血濁，堵塞脈道。

本病脾胃為虛，痰濁脂膏為實，證屬本虛標實，治療當以健運脾胃、祛痰化濕。通過增強脾胃運化的功能，使得積聚的痰濕脂膏運化排出，則高脂血癥得以改善。這種治法，與現代醫學研究中通過調控LXR對下游因子的影響，促進肝臟中膽固醇分解代謝并排出體外的途徑非常相近。從研究結果看，①模型組大鼠的TC、TG、LDL均顯著增高，且HE染色結果顯示其肝組織細胞出現脂質變性，說明在高脂飼料喂養下，該組大鼠體內膽固醇出現病理性堆積，進一步出現高膽固醇血癥，而通過溫膽湯化裁方干預的大鼠，其TC、TG、LDL均有不同程度的降低，其中，高劑量組效果最為明顯。這表明溫膽湯化裁方可有效減少大鼠肝組織脂肪變性，幫助脂質代謝，從而防治高膽固醇血癥；②從qPCR結果看，模型組大鼠LXRαmRNA表達水平明顯降低，通過藥物干預后，LXRαmRNA表達水平逐步上升，其中，高劑量組的效果最為明顯。這說明溫膽湯化裁方可有效提高LXRαmRNA表達水平，促進其激活CYP7A1，導致膽汁酸合成增加，使膽固醇向膽汁酸轉化，從而達到降低血脂的目的；③從CYP7A1、ABCG5和ABCG8的蛋白表達水平的變化結果看，模型組大鼠表達均降低，而中藥組大鼠表達則逐漸上升，數據顯示溫膽湯化裁方中、高劑量組的蛋白表達水平均增加明顯。這表明在溫膽湯化裁方干預下，限速酶CYP7A1增強自身表達，促進了膽固醇合成為膽汁酸。ABCG5和ABCG8表達的增強也對膽固醇向膽汁中排放具有推動作用，從而達到降低體內脂質的目的[9-12]。

因此，本研究探討健脾祛痰法，研究其對LXR通路的影響機制，并在選方上選用了以理氣化痰、和胃利膽為主的溫膽湯化裁方。在原方半夏、竹茹、枳實、陳皮、甘草、茯苓的基礎上減半夏，加浙貝、扁豆、薏米、桔梗。方中浙貝、竹茹、陳皮、桔梗、枳殼祛痰理氣，茯苓、扁豆、薏米、甘草健脾祛濕。全方以脾胃痰濕較盛之多見證候而立，可改善血液濃、黏、凝、聚狀態[13-17]，臨床上適應人群較廣，副作用低，適合長期服用，對于高脂血癥的臨床具有未病防治、既病防變的獨特優勢。

綜上，本研究結果表明：溫膽湯化裁方可有效降低肝組織脂質變性，增強膽汁酸合成，促進膽固醇向膽汁中排放，從而有效防治高脂血癥。其作用機制與上調CYP7A1表達，促進膽汁酸轉化，上調ABCG5和ABCG8的蛋白表達，促進膽固醇排放有關。相比于臨床上運用西藥治療，該方效果明顯，且副作用少、不良反應小，對治療高脂血癥，降低心腦血管疾病有防治作用。