阿里紅多糖對大鼠腦缺血灌注損傷的保護(hù)及JAK/STAT信號通路的影響

王 明

(南陽市第二人民醫(yī)院 神經(jīng)內(nèi)科監(jiān)護(hù)室，河南 南陽 473000)

腦缺血再灌注損傷(Cerebral ischemia reperfusion injury，CIRI)是指腦組織缺血一定時間后，恢復(fù)血液供應(yīng)，腦功能不僅沒有好轉(zhuǎn)反而加重的現(xiàn)象，是臨床缺血性腦卒中治療的常見并發(fā)癥[1]，也成為影響缺血性腦卒中臨床治療效果和預(yù)后的主要因素。CIRI發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，臨床治療途徑多樣，包括抗凝、抗血小板聚集、神經(jīng)保護(hù)、抑制鈣超載、抗氧化作用等[2]。近期研究[3]發(fā)現(xiàn)炎癥反應(yīng)在CIRI中扮演重要的角色，過度的炎癥反應(yīng)能夠加劇腦組織的繼發(fā)性損傷。Janus蛋白酪氨酸激酶(JAK)/信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子(STAT)通路是介導(dǎo)炎癥反應(yīng)的常見通路，有研究表明該通路與CIRI的病理生理過程密切相關(guān)[4]。因此，通過抑制JAK/STAT信號通路來治療CIRI成為可能。阿里紅多糖為阿里紅的主要藥用成分之一，具有抗炎、抗氧化、抗腫瘤等作用[5-6]。有研究報道阿里紅多糖具有保護(hù)中樞神經(jīng)元，表現(xiàn)出在神經(jīng)系統(tǒng)疾病治療中的潛在價值[7]，但其是否在CIRI的治療中發(fā)揮作用，國內(nèi)外還未見相關(guān)報道。因此本實(shí)驗(yàn)通過建立大鼠CIRI模型，阿里紅多糖干預(yù)治療，從JAK/STAT信號通路探討其作用的可能機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動物 SPF級雄性SD大鼠60只，體質(zhì)量150～250 g，購自于河南省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心，編號：SCXK(豫)2020-0012。分組飼養(yǎng)于南陽醫(yī)學(xué)高等專科學(xué)校實(shí)驗(yàn)動物中心，室溫控制在20～25 ℃，空氣濕度控制在50%～55%，飲食與飲水均標(biāo)準(zhǔn)化供給。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)試劑與藥品 阿里紅多糖(四川省維克奇生物科技有限公司，wkq-08919)，臨用前用生理鹽水配成20 mg/mL；白介素-6(IL-6)(批號：20201103-31063A)、腫瘤壞死因子α(TNF-α)(批號：20201103-31076A)與白介素-10(IL-10)(批號：20201103-31093A)試劑盒皆購自南京建成生物制品研究所；抗體、一抗和山羊抗免疫球蛋白G(IgG)二抗(1∶1 000稀釋，#ab6721)(Abcam公司，美國)；病理切片及染色試劑均由我院病理科提供。

1.1.3 實(shí)驗(yàn)儀器 RT-6100酶標(biāo)儀(美國Rayto公司)；L500低溫離心機(jī)(中國湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開發(fā)有限公司)；TS100顯微鏡(日本nikon公司)。

1.2 方法

1.2.1 動物分組、給藥及建模 60只大鼠隨機(jī)平均分為3組，分別為假手術(shù)組、模型組、阿里紅多糖干預(yù)組，其中模型組、阿里紅多糖干預(yù)組參考文獻(xiàn)[8]制備CIRI大鼠模型，模型制作成功的標(biāo)準(zhǔn)：捏著尾部將大鼠提起會出現(xiàn)左前肢彎曲內(nèi)收，活動時出現(xiàn)追尾征；而假手術(shù)組除不插線結(jié)扎外，其余步驟同模型組。阿里紅干預(yù)組給予40 mg/(kg·d)阿里紅多糖灌胃，而模型組與假手術(shù)組分別給予等量生理鹽水灌胃，連續(xù)灌胃7 d。

1.2.2 神經(jīng)功能評分 分別于灌胃后1 d、3 d和7 d對各組大鼠進(jìn)行神經(jīng)功能評分，具體評分標(biāo)準(zhǔn)參考文獻(xiàn)[9]。

1.2.3 ELISA法檢測血清炎癥因子表達(dá) 神經(jīng)功能評分實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，通過尾靜脈采血，以2 000 rpm離心15～20 min后收集上層血清，抗體反應(yīng)后顯色，酶標(biāo)儀檢測450 nm處吸光度，然后根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算IL-6、TNF-α與IL-10含量。

1.2.4 Western blot檢測JAK2和STAT3蛋白的表達(dá) 斷頭處死大鼠，冰面上分離腦組織，勻漿，4 ℃、12 000 rpm離心10 min后收集總蛋白。通過8%的SDS-PAGE分離每個樣品中等量(50 μg)的蛋白質(zhì)，并將其轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上。室溫下用5%脫脂牛奶封閉2 h。隨后，將膜與JAK2和STAT3一抗在4 ℃下孵育過夜，然后將膜與二抗在室溫下孵育1 h。使用化學(xué)發(fā)光試劑顯示，使用軟件分析灰度計算JAK2和STAT3蛋白相對于GAPDH的表達(dá)量。

1.2.5 腦組織病理學(xué)切片觀察 斷頭處死大鼠，分離腦組織，去掉小腦，甲醛固定，置于4 ℃冰箱內(nèi)保存7 d，然后經(jīng)過不同濃度乙醇脫水、滲透、石蠟包埋。通過切片機(jī)將包埋的石蠟組織切片，厚度5 μm，經(jīng)過HE染色，光學(xué)顯微鏡下觀察各組大鼠腦組織神經(jīng)元形態(tài)結(jié)構(gòu)。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠神經(jīng)功能評分比較

與假手術(shù)組比較，模型組大鼠神經(jīng)功能評分明顯升高(P<0.05)；與模型組比較，阿里紅多糖干預(yù)組大鼠在灌胃3 d、7 d后神經(jīng)功能評分明顯降低(P<0.05)，但在灌胃1 d后神經(jīng)功能評分沒有明顯差異(P>0.05)。具體結(jié)果見表1。

表1 阿里紅多糖對各組大鼠神經(jīng)功能評分的影響 分)

2.2 各組大鼠血清IL-6、TNF-α與IL-10含量比較

與假手術(shù)組比較，模型組大鼠血清TNF-α、IL-6含量明顯升高，IL-10含量明顯降低(P<0.05)；與模型組比較，阿里紅多糖干預(yù)組大鼠血清TNF-α、IL-6含量明顯降低，IL-10含量明顯升高(P<0.05)。具體結(jié)果見表2。

表2 阿里紅多糖對各組大鼠血清炎性因子的影響

2.3 各組大鼠腦組織JAK2和STAT3蛋白的表達(dá)

與假手術(shù)組比較，模型組大鼠JAK2和STAT3蛋白表達(dá)水平明顯升高(P<0.05)；與模型組比較，阿里紅多糖干預(yù)組大鼠JAK2和STAT3蛋白表達(dá)水平明顯降低(P<0.05)。具體結(jié)果見圖1、表3。

圖1 各組大鼠腦組織JAK2和STAT3蛋白表達(dá)電泳圖

表3 阿里紅多糖對各組大鼠腦組織JAK2和STAT3蛋白表達(dá)的影響

2.4 各組大鼠腦神經(jīng)元形態(tài)的特點(diǎn)

光學(xué)顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)，假手術(shù)組大鼠神經(jīng)元形態(tài)結(jié)構(gòu)完整，無異常改變；模型組大鼠神經(jīng)元腫脹變形，排列紊亂，細(xì)胞核變淺或消失，呈現(xiàn)明顯的病理變化；阿里紅多糖干預(yù)組大鼠神經(jīng)元病變程度得到明顯改善。具體結(jié)果見圖2。

圖2 各組大鼠腦組織形態(tài)(HE染色，×100)

3 討論

缺血性腦卒中也稱為腦梗死，在中醫(yī)學(xué)中俗稱“中風(fēng)”，是目前導(dǎo)致我國成人殘疾、死亡的首要病因[10]。溶栓治療通過實(shí)現(xiàn)血流再通，是臨床缺血性腦卒中早期治療的主要方法，但由此導(dǎo)致的缺血再灌注損傷嚴(yán)重影響患者的治療效果和預(yù)后。

神經(jīng)功能評分被認(rèn)為是評價藥物對腦功能作用的重要指標(biāo)[11]，評分越高說明神經(jīng)元損傷越重，反之越輕。通過本實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)模型組大鼠神經(jīng)功能評分明顯升高(P<0.05)，說明CIRI模型制備成功；通過阿里紅多糖干預(yù)3 d和7 d后大鼠神經(jīng)功能評分明顯降低(P<0.05)，提示阿里紅多糖對CIRI大鼠具有一定的治療作用。CIRI發(fā)病機(jī)制至今不明，近來研究表明炎癥反應(yīng)在CIRI損傷中占有重要地位[12]。在炎癥反應(yīng)中，炎癥因子發(fā)揮重要的作用，其中IL-6、TNF-α與IL-10是炎癥反應(yīng)中常見的三種炎癥因子。IL-6是由小膠質(zhì)細(xì)胞和神經(jīng)細(xì)胞分泌產(chǎn)生的細(xì)胞因子，正常或低表達(dá)時具有對腦組織保護(hù)和修復(fù)的作用，高表達(dá)時具有加劇神經(jīng)損傷作用[13]；TNF-α屬于全身炎癥反應(yīng)的啟動因子，可以促進(jìn)其他炎癥因子的釋放，從而放大炎癥反應(yīng)的級聯(lián)效應(yīng)[14]；IL-10是由多種免疫細(xì)胞分泌產(chǎn)生的抗炎因子，能夠抑制IL-6、TNF-α等促炎因子的合成和釋放，并且還能抑制多種趨化因子導(dǎo)致的免疫放大反應(yīng)，抑制炎癥反應(yīng)，減輕組織損傷[15]。通過本實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)模型組大鼠血清TNF-α、IL-6含量明顯升高，IL-10含量明顯降低(P<0.05)，說明CIRI模型大鼠體內(nèi)產(chǎn)生嚴(yán)重炎癥反應(yīng)；通過阿里紅多糖干預(yù)作用后TNF-α、IL-6含量明顯降低，IL-10含量明顯升高(P<0.05)，說明阿里紅多糖明顯抑制CIRI模型大鼠體內(nèi)的炎癥反應(yīng)。JAK/STAT信號通路是與炎癥反應(yīng)密切相關(guān)的一條干擾細(xì)胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的通路[16]，其中JAK2和STAT3廣泛存在于中樞神經(jīng)系統(tǒng)中，與腦缺血后的腦組織損傷密切相關(guān)[17]。許多炎癥因子都是通過JAK2/STAT3信號通路來誘導(dǎo)神經(jīng)細(xì)胞凋亡，引起腦組織損傷，因此抑制JAK2/STAT3信號通路，能夠?qū)δX組織起到保護(hù)作用[18]。通過本實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)模型組大鼠JAK2和STAT3蛋白表達(dá)水平明顯升高(P<0.05)，但通過阿里紅多糖干預(yù)后大鼠JAK2和STAT3蛋白表達(dá)水平明顯降低(P<0.05)，說明阿里紅多糖是通過JAK2/STAT3信號通路來抑制大鼠體內(nèi)的炎癥反應(yīng)。

阿里紅為主產(chǎn)于我國西部和東北地區(qū)，尤其是新疆的多孔菌科藥用層孔菌的干燥子實(shí)體，阿里紅多糖為其主要藥用成分之一，具有非常好的抗炎作用。有文獻(xiàn)報道其通過抗炎對心肌缺血再灌注損傷具有保護(hù)作用[19]，且在神經(jīng)系統(tǒng)疾病的治療中表現(xiàn)出潛在價值[7]，因此，有理由相信阿里紅多糖在CIRI中具有治療作用，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果與預(yù)測相符。

綜上所述，阿里紅多糖是通過抑制腦內(nèi)JAK2/STAT3信號通路來減輕CIRI體內(nèi)炎癥反應(yīng)，從而避免腦組織神經(jīng)元損傷。