地黃飲片至標(biāo)準(zhǔn)湯劑物質(zhì)傳遞研究

萬瑩瑩，杜微波，陳敬然，張志強，沈建梅

(北京康仁堂藥業(yè)有限公司，中藥配方顆粒關(guān)鍵技術(shù)國家地方聯(lián)合工程研究中心，北京市中藥配方顆粒工程技術(shù)研究中心，北京 101301)

地黃為玄參科植物地黃RehmanniaglutinosaLibosch.的塊根，性寒，味甘，歸心、肝、腎經(jīng)，具有清熱涼血、養(yǎng)陰生津等功效[1]。環(huán)烯醚萜苷類、苯乙醇苷類成分是地黃主要活性成分及發(fā)揮療效的物質(zhì)基礎(chǔ)[2-4]，其極性普遍較大，易溶于水，受煎煮時間及溫度影響，含量變化顯著[5-7]。且鮮地黃中不含異毛蕊花糖苷，通過一定溫度及時間的加工炮制后，產(chǎn)生毛蕊花糖苷向異毛蕊花糖苷轉(zhuǎn)化的現(xiàn)象[8-9]。近年來，對地黃HPLC指紋圖譜建立的研究多有報道[10-11]，為地黃的質(zhì)量評價提供了一定參考。中藥飲片標(biāo)準(zhǔn)湯劑是飲片以中醫(yī)藥理論和臨床應(yīng)用作為依據(jù)，以水為提取溶劑，經(jīng)標(biāo)準(zhǔn)化工藝制備而成。中藥配方顆粒以標(biāo)準(zhǔn)湯劑作為其發(fā)揮藥效作用的基準(zhǔn)物質(zhì)，是保證與傳統(tǒng)中醫(yī)臨床質(zhì)量療效一致性的關(guān)鍵，因此，對其進行物質(zhì)成分分析尤為重要。但以現(xiàn)有研究基礎(chǔ)不能全面分析飲片-標(biāo)準(zhǔn)湯劑物質(zhì)傳遞情況，闡明標(biāo)準(zhǔn)湯劑的物質(zhì)分布。目前也未見地黃飲片-標(biāo)準(zhǔn)湯劑物質(zhì)傳遞過程分析。隨著技術(shù)的發(fā)展，已有學(xué)者將超高效液相色譜(UPLC)技術(shù)應(yīng)用于中藥指紋圖譜研究中[12]，UPLC具有快速高效、靈敏度高、準(zhǔn)確度高等優(yōu)點，有較好的應(yīng)用前景。本研究擬建立能夠反映地黃飲片-標(biāo)準(zhǔn)湯劑質(zhì)量的UPLC特征圖譜，并利用液質(zhì)對9個特征峰進行結(jié)構(gòu)推斷，結(jié)合新的公式-K值，分析地黃飲片-標(biāo)準(zhǔn)湯劑物質(zhì)變化情況，明確傳遞規(guī)律，闡釋地黃標(biāo)準(zhǔn)湯劑物質(zhì)分布，為科學(xué)、合理地篩選地黃標(biāo)準(zhǔn)湯劑質(zhì)量控制指標(biāo)成分提供依據(jù)。

1 儀器及試藥

1.1 儀器

ACQUITY UPLC?H-Class超高效液相色譜儀(美國Waters公司)；Agilent Extend C18(2.1 mm×100 mm，1.8 μm)色譜柱(美國Agilent公司)；Agilent 6530 Q-TOF高分辨飛行時間質(zhì)譜儀(美國Agilent公司)；KQ-300DB超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；LGJ-50FD真空冷凍干燥機(北京松源華興科技發(fā)展有限公司)。

1.2 試藥及試劑

毛蕊花糖苷(中國食品藥品檢定研究院，批號：111530-201512，純度：96.7%)；地黃(生地黃)(中國食品藥品檢定研究院，批號：121180-201506)；乙腈、甲酸為色譜純均購于Fisher Chemical；水為屈臣氏蒸餾水；15批地黃標(biāo)準(zhǔn)湯劑樣品，均由北京康仁堂制藥有限公司制備。標(biāo)準(zhǔn)湯劑樣品信息見表1。

表1 材料來源

2 方法與結(jié)果

2.1 地黃標(biāo)準(zhǔn)湯劑制備

按2020版《中國藥典》地黃飲片炮制的規(guī)定進行炮制，獲得地黃飲片。取飲片于砂鍋中，浸泡30 min，一煎加入飲片量9倍水，武火(500 W)煮沸后，文火煎煮20 min，趁熱過濾，迅速冷卻，備用；二煎加飲片量7倍水，武火煮沸后，文火(200 W)煎煮15 min，趁熱過濾，迅速冷卻備用；合并濾液，濃縮(50 ℃以下)，濃縮至料液比約為1∶1(密度為1.05～1.10 g/mL(50 ℃))，冷凍干燥，即得。

2.2 特征圖譜的建立

2.2.1 色譜條件及系統(tǒng)適用性試驗 以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑(2.1 mm×100 mm，1.8 μm)；以乙腈(含0.1%甲酸)為流動相A，以0.1%甲酸為流動相B，按表2中的規(guī)定進行洗脫；檢測波長為334 nm；柱溫45 ℃；流速0.45 mL/min；進樣體積5 μL；理論塔板數(shù)按毛蕊花糖苷峰計算應(yīng)均不低于5 000。

表2 流動相梯度洗脫程序

2.2.2 參照物溶液制備 取地黃(生地黃)對照藥材，研細(xì)，取約0.2 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入水20 mL，密塞，超聲處理(功率250 W，頻率40 kHz)30 min，放冷，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，作為對照藥材參照物溶液。另取毛蕊花糖苷對照品適量，精密稱定，加水制成每1 mL含毛蕊花糖苷3 μg的溶液，搖勻，作為對照品參照物溶液。

2.2.3 供試品溶液制備 取標(biāo)準(zhǔn)湯劑凍干粉適量，研細(xì)，取約0.2 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入水20 mL，密塞，超聲處理(功率250 W，頻率40 kHz)30 min，放冷，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.2.4 方法學(xué)考察 ① 重復(fù)性試驗：按照“2.2.3”項下方法制備供試品溶液6份，記錄其特征圖譜，以毛蕊花糖苷為參照峰，計算各特征峰的相對保留時間和峰面積。相對保留時間RSD為0.02%～0.11%，相對峰面積RSD為1.16%～4.96%，表明該方法重復(fù)性良好。② 中間精密度試驗：采用不同儀器按照“2.2.3”項下方法獲得6份供試品溶液的特征圖譜，以毛蕊花糖苷為參照峰，計算各特征峰的相對保留時間和峰面積。相對保留時間RSD為0.14%～1.22%，相對峰面積RSD為1.27%～5.66%；不同儀器間相對保留時間RSD為0.01%～0.18%，相對峰面積RSD為1.31%～17.75%，表明在不同儀器間該特征圖譜的相對保留時間符合分析要求，但相對峰面積差異較大。③ 穩(wěn)定性試驗：精密吸取同一供試品溶液，分別于0 h、2 h、4 h、6 h、8 h、10 h、12 h、24 h進樣測定，記錄色譜圖，并以毛蕊花糖苷為參照物峰，計算各特征峰的相對保留時間和峰面積，相對保留時間RSD為0.04%～0.35%，相對峰面積RSD為2.24%～5.43%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)測定結(jié)果穩(wěn)定。

2.2.5 特征峰的推斷與確認(rèn) 按照“2.2”項下方法制備15批標(biāo)準(zhǔn)湯劑供試品溶液并測定，使用《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)》(2012.1版本)，以1號為參照圖譜，按中位數(shù)計算，進行共有峰標(biāo)識，生成對照圖譜，并確定峰3為毛蕊花糖苷，見圖1。利用高效液相串聯(lián)高分辨飛行時間質(zhì)譜儀對9個特征峰進行結(jié)構(gòu)推斷，確定了7個特征峰的分子式，并參考地黃化學(xué)成分相關(guān)文獻，推斷了6個特征峰，其中峰1、7、8為環(huán)烯醚萜苷類，峰2、3、4、5為苯乙醇苷類成分，推斷結(jié)果見下表3，化合物結(jié)構(gòu)見圖2。

圖2 特征峰化學(xué)結(jié)構(gòu)

表3 質(zhì)譜成分推測結(jié)果

圖1 地黃標(biāo)準(zhǔn)湯劑對照特征圖譜

2.3 飲片至標(biāo)準(zhǔn)湯劑物質(zhì)傳遞分析

按照“2.2”項下“特征圖譜的建立”方法獲得15批飲片的特征圖譜數(shù)據(jù)，以9個特征峰峰面積、樣品濃度及出膏率計算K值，分析飲片至標(biāo)準(zhǔn)湯劑物質(zhì)傳遞情況，結(jié)果見表4。

K=標(biāo)準(zhǔn)湯劑特征峰面積×飲片濃度×出膏率飲片特征峰面積×標(biāo)準(zhǔn)湯劑濃度

由表4可知，15批地黃飲片與標(biāo)準(zhǔn)湯劑各峰都進行了物質(zhì)傳遞，除峰4、9外，其余各峰K值<1，均在0.12～0.68范圍內(nèi)，表明傳遞趨勢相同且效率相近；峰4、9中均有多個批次K值>1，表明傳遞過程中可能存在物質(zhì)轉(zhuǎn)化，從而成分得到有效富集，但受產(chǎn)地因素影響較大。

表4 飲片至標(biāo)準(zhǔn)湯劑K值

3 討論

地黃標(biāo)準(zhǔn)湯劑作為中藥飲片的水煎液，物質(zhì)基礎(chǔ)主要為水溶性成分，其中環(huán)烯醚萜苷類、苯乙醇苷類為主要活性物質(zhì)，水溶性好，但對熱敏感，飲片-標(biāo)準(zhǔn)湯劑煎煮過程存在成分的損失和轉(zhuǎn)化，且物質(zhì)傳遞規(guī)律及分布無法監(jiān)控。因此針對標(biāo)準(zhǔn)湯劑中主要活性物質(zhì)，利用UPLC建立了真實反映標(biāo)準(zhǔn)湯劑物質(zhì)傳遞規(guī)律及分布的特征圖譜，該方法精密度和穩(wěn)定性良好。

目前特征圖譜多采用相似度、特征峰相對保留時間及特征峰數(shù)目等評價方式，均屬于定性評價，不適用于物質(zhì)傳遞規(guī)律的總結(jié)。指標(biāo)成分轉(zhuǎn)移率以成分含量的相對值進行定量評價，能夠表明物質(zhì)成分的變化趨勢，但僅適用于有對照品參照的成分。因此針對標(biāo)準(zhǔn)湯劑中該類成分，依據(jù)指標(biāo)成分轉(zhuǎn)移率公式，建立基于特征圖譜分析物質(zhì)傳遞規(guī)律的新公式-K值，以峰面積進行比對，在缺少成分對照品的前提下也能夠進行分析，同時降低了多因子對于結(jié)果分析的影響，能夠科學(xué)地分析飲片-標(biāo)準(zhǔn)湯劑物質(zhì)傳遞規(guī)律。

通過K值分析，地黃飲片-標(biāo)準(zhǔn)湯劑過程中9個特征峰均進行了傳遞，除峰4、9外，其余各峰K值均<1。有研究表明，環(huán)烯醚萜苷類成分在不同炮制品中含量有顯著差異，結(jié)合的糖越多，分解速度越慢[7]，由特征峰化學(xué)結(jié)構(gòu)可知，地黃標(biāo)準(zhǔn)湯劑中成分多含雙糖結(jié)構(gòu)，表明結(jié)合二糖的環(huán)烯醚萜苷在湯劑中較為穩(wěn)定，能夠?qū)崿F(xiàn)其有效的轉(zhuǎn)移；而峰4中有9個批次K值>1，地黃標(biāo)準(zhǔn)湯劑中同時含有毛蕊花糖苷和異毛蕊花糖苷，根據(jù)文獻[9]報道,毛蕊花糖苷與異毛蕊花糖苷在一定條件下可以相互轉(zhuǎn)化，其峰4的K值>1可能與毛蕊花糖苷在煎煮過程中動態(tài)轉(zhuǎn)化為異毛蕊花糖苷有關(guān)；峰9未推斷出化學(xué)結(jié)構(gòu)，但其K>1，表明有其他成分向其轉(zhuǎn)化。由此可知，地黃標(biāo)準(zhǔn)湯劑中上述成分傳遞規(guī)律符合環(huán)烯醚萜苷類及苯乙醇苷類成分的特性，表明K值能夠輔助分析飲片-標(biāo)準(zhǔn)湯劑的物質(zhì)傳遞情況，利用該傳遞規(guī)律可更好地指導(dǎo)中藥配方顆粒的生產(chǎn)和控制。

本研究利用地黃標(biāo)準(zhǔn)湯劑專屬性UPLC特征圖譜方法，結(jié)合新的評價公式-K值，能夠表明飲片-標(biāo)準(zhǔn)湯劑物質(zhì)變化規(guī)律，明確地黃標(biāo)準(zhǔn)湯劑的物質(zhì)分布，指導(dǎo)標(biāo)準(zhǔn)湯劑質(zhì)量控制指標(biāo)的合理篩選，為后續(xù)以標(biāo)準(zhǔn)湯劑為基準(zhǔn)的配方顆粒或經(jīng)典方制劑質(zhì)量控制提供依據(jù)，也為其他品種飲片-標(biāo)準(zhǔn)湯劑物質(zhì)傳遞分析提供借鑒。