基于網絡藥理學的大果木姜子油治療心力衰竭作用機制研究

陳向云，湯小芳，李 軍，黃朝霞，楊桃梅，楊長福，李堯鋒*

(1.貴州中醫藥大學 基礎醫學院，貴州 貴陽 550025；2.貴州中醫藥大學 中藥民族藥資源研究院，貴州 貴陽 550025)

心力衰竭(Heart failure，HF)是世界范圍內發病率和死亡率較高的主要臨床問題，其特征是心室收縮和/或舒張功能受損，其臨床癥狀表現為呼吸困難、乏力、水腫、心悸心慌等，是多種心血管疾病的終末期表現[1]。HF常反復發作，病死率高，治療難度大。近年來，HF在全球范圍內日益普遍，且發病率逐年升高，是人類極為關注的公共衛生問題之一。HF發病機制復雜，神經內分泌系統過度激活、心肌能量供應不足或能量代謝障礙等與之有關[1-2]。

中醫藥在防治心力衰竭上積累了豐富經驗，現代中醫家根據HF臨床表現將其歸屬于“喘證”“心悸”“心痹”“胸痹”等范疇，認為心氣不足、氣滯血瘀是心力衰竭的主要病理基礎[3-6]。大果木姜子(CinnamomummigaoH.W.Li)，又稱苗藥米槁，是貴州苗族民間的常用藥材，其性溫，味辛，無毒，具有溫中散寒、理氣止痛、祛濕、行氣的功能。大果木姜子及其水蒸汽法蒸餾得到的大果木姜子油收載于《貴州省中藥材、民族藥材質量標準》[7]。現代藥理學研究發現，大果木姜子油可減少心肌耗氧量，增加心肌供氧，抗心律失常，改善急性心肌缺血和心房顫動癥狀[8-10]。近年來，以大果木姜子油為主要成分開發的新藥，如理氣活血滴丸、心腦寧膠囊、心胃止痛膠囊，為貴州省民族藥重要產品，其在防治心血管疾病領域中的應用尤為突出，大果木姜子油應用前景廣闊。因此，深入研究大果木姜子油在心血管疾病防治中的作用機制，將為其推廣應用提供有力支撐。網絡藥理學可系統分析中藥療效成分及作用機制，可為中藥防治疾病提供潛在靶點分析[11]，利用該方法可清晰呈現大果木姜子油藥效作用機制。因此，本研究首先利用異丙腎上腺素(ISO)誘導復制HF大鼠模型，通過動物藥理學實驗明確大果木姜子油的療效；然后利用網絡藥理學分析和分子對接發現大果木姜子油治療心力衰竭的有效成分及作用靶點，進一步揭示其作用機制，以期為臨床應用和藥物開發提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物 清潔級雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠80只，體質量180～220 g，購自長沙天勤生物技術有限公司(生產許可證號：SCXK(湘)2014-0010)。大鼠飼養于貴州中醫藥大學基礎醫學實驗中心動物房(溫度20～25 ℃，相對濕度50%～65%，明暗相間各12 h)。

1.1.2 藥物 大果木姜子油(由貴州益佰制藥股份有限公司提供，批號：180428，按照中國發明專利(專利號：2013105216915)，采用水蒸氣蒸餾法獲得大果木姜子油，1 mL大果木姜子油含生藥材32.2 g)。鹽酸異丙基腎上腺素(ISO，美國SIGMA公司，5 g in poly btl，批號：I5627)；馬來酸依那普利片(揚子江藥業集團江蘇制藥股份有限公司，規格：10 mg/片，批號：20180111)。

1.1.3 試劑與儀器 大鼠腦鈉肽(Brain natriuretic peptide，BNP)ELISA試劑盒(武漢伊萊瑞特生物科技股份有限公司，批號：EL-R0126c)；蘇木素伊紅(Hematoxylin-Eosin staining，HE)染色試劑盒(北京索萊寶科技有限公司，批號：20180312)。

BL-420S生物機能實驗系統和HX-101E動物呼吸機(成都泰盟科技有限公司)；Varioskan Flash全波長掃描式多功能讀數儀(美國Thermo Scientific公司)；EG1150H石蠟包埋機、RM2235病理切片機、HI1210攤片機(德國Leica公司)；BX53正置顯微鏡(奧林巴斯(中國)有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 分組與模型制備 先將SD大鼠隨機分為兩組：正常組10只，模型組70只；正常組注射等量的0.9%生理鹽水，模型組皮下注射ISO(5 mg/kg，每天1次，連續給藥7 d)建立心力衰竭大鼠模型，28 d后，模型組大鼠血清BNP 水平與正常組相比顯著升高，說明造模成功[12]。然后將造模成功大鼠分為7組，分別是HF組、Tween-80組、Migao-25組(25 μL/kg)、Migao-50組(50 μL/kg)、Migao-100組(100 μL/kg)、Migao-120組(120 μL/kg)、依那普利組(20 mg/kg)。

1.2.2 給藥方法 用5% Tween-80水溶液作為助溶劑，加入大果木姜子油，超聲破碎儀處理10 min，配制成分別含2.5、5、10、12 μL/mL的大果木姜子油溶液，存儲于4 ℃待用。正常組、HF組大鼠灌胃等容積蒸餾水，Tween-80組大鼠灌胃5% Tween-80的水溶液，各給藥組大鼠灌胃相應藥物，每天1次，連續給藥治療28 d。

1.2.3 血流動力學監測 稱量大鼠體質量，采用25%烏拉坦腹腔注射麻醉后，將大鼠仰臥位固定于手術臺上，頭頸部自然伸直，消毒備皮后，沿頸正中線切開皮膚，做氣管插管，接小動物呼吸機。然后采用鈍性分離的方法分離出右側頸總動脈。靜脈留置針預充含肝素的生理鹽水(含肝素500 U/mL)，將靜脈留置針一端沿大鼠右側頸總動脈向心方向插管進入左心室，靜脈留置針另一端接入壓力換能器。待大鼠呼吸正常后，壓力換能器與BL-420S生物機能實驗系統相連，記錄大鼠血流動力學指標：左心室收縮壓(LVSP)、左心室終末舒張壓(LVEDP)、左心室內壓最大上升/下降速率(±dp/dtmax)。

1.2.4 ELISA法檢測血清BNP含量 大鼠頸總動脈取血，血液室溫靜置15 min后，于4 ℃離心20 min(2 500 r/min)。收集上清，采用雙抗體夾心酶聯免疫吸附法測定大鼠血清BNP水平，嚴格按照試劑盒說明書步驟操作。

1.2.5 HE染色法觀察心肌組織形態學情況 取左心室，固定于4%多聚甲醛溶液中，24 h后流水緩慢沖洗去除留在組織上的固定液，經梯度酒精脫水和二甲苯透明后，將標本進行浸蠟、包埋、切片、貼片、烘片，制成石蠟切片。石蠟切片放入蘇木精染色液中20 min，分化液分化5 s，自來水浸泡15 min，置于伊紅染色液中2 min，自來水沖洗，然后常規脫水，透明，中性樹膠封片后，正置顯微鏡下觀察。

1.2.6 大果木姜子油活性成分及作用靶點收集與篩選 根據趙立春等[13]報道的大果木姜子油鑒定出的化學成分，在中藥系統藥理學數據庫和分析平臺(TSMSP，http：//lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php)中查找這些化學成分，按照Lipinski類藥五規則[14](MW<500Da，Hacc≤10，Hdon≤5，-230%對這些化學成分進行篩選，獲得符合條件的大果木姜子油活性成分，并記錄其TCMSP ID。在TCMSP數據庫中查找這些活性成分的作用靶點，經Uniprot數據庫對這些靶點進行標準化。然后利用Cytoscape 3.7.1軟件(https：//cytoscape.org/)繪制大果木姜子油活性成分與作用靶點網絡關系圖。

1.2.7 大果木姜子油治療心力衰竭候選靶點篩選 以“Heart failure”為關鍵詞，在比較毒理基因組學數據庫(CTD，http：//ctdbase.org/)和Drugbank數據庫(https：//go.drugbank.com/)中獲取疾病的關鍵基因或靶標，在CTD數據庫中選擇標記為M(Marker/Mechanism)或 T (Therapeutic)的基因，這些基因與疾病有明確的關聯，為疾病治療靶標或標志物。將疾病治療靶點與大果木姜子油活性成分作用靶點進行Venn分析(http：//bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn/)，找出共有基因，作為大果木姜子油治療心力衰竭候選靶點。

1.2.8 分子對接 在TCMSP數據庫中下載大果木姜子油活性成分的mol2結構，建立小分子配體結構庫。在PDB數據庫中下載大果木姜子油治療心力衰竭候選靶點蛋白的三維結構，保存為pdb格式，作為受體庫。采用SYBYL?-X 2.1.1軟件(Tripos Inc.，USA)對小分子進行分子力學優化，配體優化過程基于Tripos力場Minimize 程序，加氫，加電荷，參數設置為：優化次數設置為10 000、能量收斂標準設置為 0.005 kcal/mol·A、賦予Gasteiger-Hückel電荷，基于 Powell能量梯度法優化得到最低能量構象，以mol2格式文件保存，作為配體小分子用于對接。通過該軟件Surflex-Dock模塊進行分子對接研究，以打分函數Total-Score為標準評價中藥成分與靶標間相互作用，Total-Score>5表明小分子配體與蛋白有較好的結合活性，Total-Score值越大兩者結合活性越強[15]。

1.2.9 蛋白互作分析 為了分析作用靶點之間的關系，將靶點蛋白導入STRING數據庫(https：//string-db.org/)中，分析蛋白互作關系，分析結果導出Excel格式，再導入Cytoscape3.7.1軟件繪制蛋白互作網絡圖。

1.2.10 蛋白富集分析 使用在線工具DAVID(https：//david.ncifcrf.gov/)對大果木姜子油治療心力衰竭候選靶點進行GO分子功能(GO-MF)和KEGG通路富集分析，以P<0.05作為顯著分析的臨界值。

1.3 統計學方法

2 結果

2.1 大果木姜子油對HF模型大鼠血流動力學指標的影響

與正常組比較，HF組大鼠LVSP、±dp/dtmax均顯著降低，LVEDP顯著升高，表明HF組大鼠心肌舒縮功能下降，心衰大鼠模型建立已成功。與HF組大鼠比較，Tween-80組大鼠血流動力學指標無變化；Migao-25組大鼠LVSP、±dp/dtmax升高，LVEDP降低，但差異不顯著；Migao-50、Migao-100、Migao-120組和依那普利組大鼠LVSP、±dp/dtmax顯著升高，LVEDP顯著降低，表明大果木姜子油可明顯改善HF模型大鼠血流動力學指標，且呈劑量依賴性。見表1。

表1 各組大鼠血流動力學指標情況

2.2 大果木姜子油對HF模型大鼠血清BNP水平的影響

與正常組比較，HF組大鼠血清BNP水平顯著升高。與HF組大鼠比較，Tween-80組大鼠血清BNP水平基本無差異；Migao-25組大鼠血清BNP水平有所降低，但差異不顯著；Migao-50、Migao-100、Migao-120組和依那普利組大鼠血清BNP水平顯著降低，且呈劑量依賴性。結果見表1。

2.3 大果木姜子油對HF模型大鼠心肌組織形態學變化的影響

由以上結果發現，大果木姜子油100 μL/kg具有較好療效，將該藥物組大鼠與正常組、疾病模型組比較，進行心肌組織形態學觀察。HE染色結果如圖1所示：正常組大鼠心臟被膜完整，心室肌輪廓清晰，心肌細胞排列整齊，心肌纖維連接緊密，胞核清晰，胞漿染色均勻，未見炎性細胞浸潤；HF組和Tween-80組大鼠心肌細胞失去正常結構形態，部分出現不同程度壞死，肌纖維斷裂、排列紊亂，部分肌纖維結構疏松且腫大，周圍有炎性細胞浸潤及成纖維細胞增生。Migao-100組和依那普利組大鼠心臟被膜完整，心室肌輪廓較清晰，心肌纖維排列較整齊，未出現明顯壞死現象，炎細胞浸潤及成纖維細胞增生明顯減輕。

圖1 各組大鼠心肌組織形態學觀察結果(bar=40 μm)

2.4 大果木姜子油活性成分篩選及作用靶點收集

基于TCMSP數據庫查找大果木姜子油的化學成分，同時符合OB>30%和Lipinski類藥五規則條件的作為活性成分，得到20個(見表2)。在TCMSP數據庫中查找這20個活性成分的作用靶點，獲54個作用靶點，構建大果木姜子油活性成分與作用靶點網絡互作圖，其中共有74個節點，265個邊，節點代表活性成分或作用靶點，邊代表活性成分與作用靶點的互作關系(見圖2)。

表2 大果木姜子油活性成分基本信息

圖2 大果木姜子油活性成分與作用靶點網絡互作

2.5 大果木姜子油治療HF作用靶點篩選

在CTD數據庫和Drugbank數據庫中篩選獲得疾病治療靶點107個。大果木姜子油活性成分的54個作用靶點與這107個疾病關鍵靶點經Venn分析得到6個共同靶點(見圖3)，此共同靶點作為大果木姜子油治療HF的關鍵候選作用靶點。靶點具體信息見表3。

圖3 大果木姜子油活性成分作用靶點與疾病相關靶點Venn圖

表3 大果木姜子油治療心力衰竭候選作用靶點信息

2.6 大果木姜子油治療心力衰竭候選作用靶點的分子對接驗證

為了更好地闡釋和驗證大果木姜子油活性成分與關鍵候選作用靶點之間的結合活性，利用SYBYL-X 2.1.1軟件對活性成分和關鍵靶點進行分子對接分析，發現除ADRA2C外其余候選靶點與活性成分(愈創醇、萜品烯-4-醇、沉香螺旋醇、芳樟醇、石竹烯氧化物、龍腦、檜烯)有較好結合活性，見表4。將有較好結合活性的活性成分和作用靶點構建網絡關系圖，見圖4A。

表4 大果木姜子油活性成分與作用靶點的分子對接分析結果

圖4 大果木姜子油活性成分-作用靶點-疾病網絡(A)及作用靶點蛋白互作關系(B)

2.7 大果木姜子油治療心力衰竭作用靶點蛋白互作分析

為了進一步探討大果木姜子油活性成分治療作用靶點間的互作關系，將這5個靶點導入STRING數據庫進行蛋白互作分析(見圖4B)，發現它們之間存在互作關系，其中PTGS2與4個蛋白存在互作關系，PTGS1、NOS2和NOS3各與3個蛋白存在互作關系，GSK3B與1個蛋白存在互作關系，表明大果木姜子油在治療心力衰竭上作用于一個特定的蛋白互作網絡中。

2.8 大果木姜子油治療心力衰竭作用靶點GO分子功能和KEGG通路分析

使用DAVID在線工具進行GO-MF和KEGG通路富集分析(P<0.05)，GO分子功能條目有血紅素結合、前列腺素內過氧化物合酶活性、一氧化氮合酶活性等(見表5)，KEGG通路分析得到這些靶點與精氨酸生物合成、代謝通路、精氨酸和脯氨酸代謝等有關(見表6)。

表5 GO分子功能注釋

表6 KEGG通路富集分析

3 討論

網絡藥理學整合了計算機科學、分子細胞生物學、蛋白組學及藥理學等多個學科成果，從整體觀認識藥物與機體的作用關系，與中醫整體觀、辨證論治原則一致，為中醫藥防治疾病的現代化研究提供了新思路。大果木姜子油在防治心肌缺血和心房顫動方面療效顯著，但對其治療心力衰竭鮮有報道。本研究首先從動物藥理學證實了大果木姜子油對心力衰竭的治療效果，后利用網絡藥理學揭示了大果木姜子油治療心力衰竭的作用機制。

BNP是心臟神經內分泌激素，是評價心室功能障礙的重要標記物，為臨床診斷、判斷心力衰竭嚴重程度的敏感指標；血流動力學參數也可反映左心室功能不全情況。本研究通過動物實驗研究發現，大果木姜子油(50、100和120 μL/kg)可顯著升高ISO致心力衰竭模型大鼠的LVSP和±dp/dtmax、降低LVEDP，改善血流動力學紊亂，并降低模型大鼠血清BNP水平；大果木姜子油治療模型大鼠的最適給藥濃度為100 μL/kg，若按生藥材量為3.22 g/kg，為后期研究奠定了基礎；大果木姜子油(100 μL/kg)可顯著改善模型大鼠心肌組織形態學變化，這些結果表明，大果木姜子油可改善ISO所致心力衰竭大鼠的心臟功能障礙。

網絡藥理學和分子對接研究發現，大果木姜子油治療心力衰竭共有7個活性成分，分別是愈創醇、萜品烯-4-醇、沉香螺旋醇、芳樟醇、石竹烯氧化物、龍腦、檜烯。這些大果木姜子油活性成分作用于一個特定的蛋白互作網絡，該網絡中的靶點蛋白與調節前列腺素和一氧化氮代謝有關，進而也與心力衰竭疾病調控機制有關。PTGS1和PTGS2是兩種不同的同工酶，介導花生四烯酸轉化為前列腺素(Prostaglandin，PG)，是PG合成的重要一步。PTGS1是組成性表達的，主要參與體內動態平衡；PTGS2是可誘導的，通常產生前列腺素類物質，介導對諸如感染和炎癥等生理應激的反應[16-17]。哺乳動物基因Ptgs1、Ptgs2分別編碼COX-1(Cyclooxygenase-1)、COX-2(Cyclooxygenase-2)，COX-1和COX-2分別是PTGS1和PTGS2的別稱[18]。在剪切應力、血管內皮生長因子和凝血酶的作用下，內皮細胞中COX-1表達增加。COX-1參與血小板中血栓素A2的合成，血栓素A2介導血小板聚集和血管收縮[19]。研究發現，COX-2在心力衰竭患者心肌的纖維瘢痕部位有豐富表達，提示其與心衰過程中炎癥反應及瘢痕形成有關[20]。COX-2誘導的前列腺素可抑制心肌損傷，PGI2是心臟缺血預處理后COX-2的主要產物，PGI2對心肌細胞有保護作用[21-23]。藥物研究發現，上調COX-2表達，可改善左心功能，減輕心肌纖維化[24]；抑制COX-2可增加有心血管疾病或左心室損傷病史患者的心力衰竭癥狀發生風險[25-26]。一氧化氮合酶在NO信號中尤為重要，心力衰竭時NO生物利用度降低，這是NOS功能障礙的結果，其后果是收縮功能障礙、肥厚和不利的重構，因此一氧化氮合酶功能的改變是心力衰竭綜合征的一個主要因素。NOS的功能障礙存在于心力衰竭等多種心臟疾病中，可導致心肌收縮功能障礙、不良重塑和肥大，在心力衰竭疾病中，已發現NOS2的表達與心肌收縮功能障礙和病理性肥大有關[27-29]。因此，在HF防治中，特異性抑制NOS2是一種值得關注的治療方法。但在HF中，NOS3的表達水平減少，NOS3活性的降低減少了NO產生，這對衰竭的心臟有著極大危害。研究發現，心肌梗死后，NOS3基因敲除小鼠表現出更嚴重的心室重構、肥厚和收縮功能障礙[30]；心肌細胞靶向的NOS3表達挽救了壓力超負荷后的左室重構[31]。此外，在患有心力衰竭肺動脈高壓的患者中發現，NOS3多態性與跨肺壓力梯度相關，且可能與平均肺動脈壓和舒張期肺動脈壓差相關[32]。GSK-3是心肌細胞生長和凋亡調節的重要因子，參與心臟的多個病理過程，它的去調節可導致嚴重的收縮與舒張功能障礙及進展性心力衰竭[33]。研究發現，心力衰竭期間GSK-3的下調可能是補償性的，對GSK-3的持續抑制可引起代償性肥大，抑制細胞凋亡和纖維化，并增加心臟收縮力，且GSK-3抑制的抗凋亡作用是由髓細胞白血病因子1介導的[34]。研究還發現，COX-2可調控GSK-3的磷酸化[35-37]。由以上文獻分析發現，這些治療靶點與前列腺素內過氧化物合酶活性和一氧化氮合酶活性有關，與GO分子功能注釋和KEGG通路分析一致。

綜上，本課題從動物藥理學實驗研究發現，大果木姜子油可改善心力衰竭大鼠的血流動力學紊亂、降低BNP水平、改善心肌組織形態學變化；利用網絡藥理學方法分析了大果木姜子油治療心力衰竭的作用及機制，發現了大果木姜子油治療心力衰竭的靶點集中于一個蛋白互作網絡中，其與前列腺素內過氧化物合酶活性和一氧化氮合酶活性有關，這些結果為今后深入研究大果木姜子油治療心力衰竭的作用機制提供了依據。