血管緊張素II促進心臟成纖維細胞轉分化的實驗條件優化*

馮 姍， 徐文麗， 吳濟民， 王 蕊， 趙明明， 曹 寧， 陳顯達，王帥星， 張 咪， 谷慧君， 張幼怡， 肖 晗△（北京大學第三醫院心內科血管醫學研究所，國家衛生健康委心血管分子生物學與調節肽重點實驗室，分子心血管學教育部重點實驗室，心血管受體研究北京市重點實驗室，北京 009；石河子大學醫學院新疆地方與民族高發病教育部重點實驗室，新疆 石河子 83000）

在病理條件下，心肌間質出現膠原過度沉積，引起心臟纖維化。心臟纖維化是多種心血管疾病的共同特征，并最終導致心力衰竭。心臟中成纖維細胞（cardiac fibroblast，CFs）向肌成纖維細胞轉分化是心臟纖維化的重要病理過程［1］，已成為治療心血管疾病的關鍵環節。但是篩選抑制CFs 轉分化藥物的實驗條件尚未經系統地評估和優化，是影響實驗穩定性和可重復性的關鍵因素。在轉分化后，肌成纖維細胞高表達特征性的α-平滑肌肌動蛋白（α-smooth muscle actin，α-SMA），同時合成和分泌細胞外基質的能力增強［2-4］，從而促進心臟纖維化［5-7］。血管緊張素II（angiotensin II，Ang II）是促進CFs 轉分化為肌成纖維細胞的重要因素［8］，因此廣泛應用于構建體外誘導CFs 轉分化的細胞模型。目前心臟CFs 轉分化的相關研究選擇的細胞代數有第1 代（passage 1，P1）、P2、P3 等，選擇的Ang II 刺激時程有24 和48 h等，細胞培養液血清濃度有0%、1%、10% 等［9-13］。本研究擬評估和比較Ang II 引起CFs 轉分化的實驗條件，為實驗研究體系的規范化提供數據支持。

材料和方法

1 動物

新生（1～2日齡）和8周齡SPF 級雄性C57BL/6小鼠，體質量22～24 g，均購自北京大學醫學部實驗動物中心，許可證號SCXK（京）2021-0006，用于分離成年小鼠（4 只/10 cm 皿）和新生小鼠（40 只/10 cm 皿）CFs。動物飼養和使用均完全遵照北京大學醫學部實驗相關倫理標準。本研究已獲得北京大學生物醫學倫理委員會實驗動物福利倫理分會批準，批準號為LA2018112。

2 主要試劑

Ang II 購自Sigma-Aldrich；膠原酶Ⅱ和DMEM 培養液購自Gibco；逆轉錄試劑盒購自Promega；Trizol、Hoechest 33342 和Alexa Fluor 488 偶聯的熒光Ⅱ抗購自Invitrogen；抗α-SMA、I 型膠原（collagen type I，Col I）和纖連蛋白（fibronectin，FN）抗體購自Abcam；抗GAPDH 抗體購自Cell Signaling Technology；山羊抗兔IgG（H+L）抗體購自北京中杉金橋生物技術有限公司；Neonatal Heart Dissociation Kit購自Miltenyi Biotec。

3 主要方法

3.1 成年小鼠CFs 的分離與培養取8 周齡雄性C57BL/6小鼠，斷頸后用乙醇消毒，剪開胸腔，取出心臟，修剪去除心耳和主動脈，置于預冷的PBS 中。將心臟剪碎至1 mm×1 mm×1 mm 的糜狀，加入5 mL 的0.1% 膠原酶Ⅱ并置于轉速為120 r/min 的恒溫磁力攪拌器中，37 ℃恒溫消化8 min。小心吸走上清，加入膠原酶，重復8～10 次上述過程，直至心臟消化完全。從第2 次消化開始，取上清加入等體積完全培養液，混合均勻。細胞懸液以室溫轉速200×g離心5 min，用完全培養液將細胞重懸，種于細胞培養皿中，置于37 ℃、5% CO2條件下培養。24 h 后更換培養液繼續培養，此時貼壁的CFs 為原代細胞。采用免疫熒光法檢測波形蛋白（vimentin）以鑒定CFs。

3.2 新生小鼠CFs 的分離與培養采用Neonatal Heart Dissociation Kit 進行分離。步驟如下：取40 只1～2 d 小鼠心臟，剪掉心臟上的血管組織，在預冷的平衡鹽溶液（Hanks balanced salt solution，HBSS）中沖洗2 遍，用剪刀把心臟組織剪碎并放入含有酶液的組織解離管中，利用Gentle MACS Octo Dissociator儀器消化心臟；消化結束后立即用完全培養液終止消化，70 μm 濾網過濾，200×g離心5 min，棄上清，使用紅細胞裂解液去除紅細胞，200×g離心5 min。用完全培養液重懸細胞沉淀，種于10 cm 細胞培養皿中，置于37 ℃、5% CO2培養箱中培養2 h，進行差速貼壁，去除未貼壁細胞，已貼壁為原代的CFs。用免疫熒光法檢測vimentin對CFs進行鑒定。

3.3 細胞傳代成年小鼠和新生小鼠CFs 生長至匯合度達90% 時，用1 mL 2.5 g/L 的胰蛋白酶37 ℃消化1 min 至細胞變圓，棄酶液，加入3 mL 完全培養液終止消化。細胞計數后，調整細胞數至1.6×106接種于10 cm細胞培養皿中繼續培養。

3.4 實驗分組CFs 傳代至不同細胞代數（P1～P4），用完全培養液培養過夜后，更換為含不同濃度（0%、2% 和5%）胎牛血清（fetal bovine serum，FBS）的培養液，正常培養或加入終濃度為10?6mol/L的Ang II繼續培養，分別記為對照（control，Ctrl）組和Ang II組，24或48 h后收集樣品進行檢測。

3.5 Western blot提取各組細胞樣品，使用二喹啉甲酸法（bicinchoninic acid，BCA）測定樣品中蛋白濃度，取相同質量的蛋白樣品進行SDS-PAGE，轉至硝酸纖維素膜。用TBST 緩沖液配制的5% 脫脂牛奶室溫封閉1 h 后，分別加入Ⅰ抗［α-SMA（1∶20 000）、Col I（1∶1 000）、FN（1∶1 000）和GAPDH（1∶10 000）］4 ℃孵育過夜。TBST 漂洗3 次，每次10 min，加入山羊抗兔的Ⅱ抗（稀釋比例分別為1∶40 000、1∶2 000、1∶2 000和1∶20 000）室溫孵育1 h。TBST 漂洗3 次，每次10 min。使用GeneSys ECL 化學發光法系統成像。用ImageJ 圖像分析軟件測量灰度值，采用目的蛋白/GAPDH灰度值比值來計算蛋白的表達水平。

3.6 固定細胞免疫熒光技術棄掉培養液用PBS洗滌后加入4% 多聚甲醛室溫固定30 min，PBS 洗3次，每次5 min。用0.1% 的TritonX-100 室溫破膜10 min，再用PBS洗3次，每次5 min。用1% 牛血清白蛋白室溫封閉30 min 后加PBS 稀釋的Ⅰ抗（1∶100）4 ℃孵育過夜。用PBS洗3次，每次5 min后，加入PBS稀釋的Alexa Fluor 488偶聯的熒光Ⅱ抗（1∶200）室溫避光孵育1 h。PBS 洗3 次，每次5 min，Hoechst 33342染細胞核6 min。利用Array Scan 高內涵系統采集各通道熒光，并分析熒光強度。

3.7 qPCR用Trizol 試劑提取細胞中的RNA，采用Promega 試劑盒逆轉錄后使用Bio-Rad CFX96 Touch進行qPCR（1 μg RNA）檢測。以GAPDH 為內參照，通過2?ΔΔCt法比較目的基因的表達差異。引物由北京睿博興科生物技術有限公司合成，序列見表1。

表1 qPCR引物序列Table 1.Sequences of the primers for qPCR

4 統計學處理

采用Prism 8 軟件進行統計學分析。數據以均數±標準誤（mean±SEM）表示。多組間均數比較采用單因素方差分析（one-way ANOVA）或Kruskal-Wallis檢驗。以P<0.05為差異有統計學意義。

結 果

1 成年小鼠CFs不同代數比較，P1成年小鼠CFs在Ang II刺激后轉分化標志物表達顯著增加

成年小鼠CFs傳代的處理流程及鑒定如圖1A、B所示。細胞免疫熒光結果顯示，僅P1 成年小鼠CFs接受Ang II 刺激48 h 后，其α-SMA、Col I 和FN 的平均熒光強度較對照組顯著增強（P<0.05）；處于P2～P4 的CFs 中α-SMA、Col I 和FN 平均熒光強度與對照組相比均無顯著變化（P>0.05），見圖1C。qPCR和Western blot 結果同樣顯示，僅P1 CFs 接受Ang II刺激48 h 后，其α-SMA、Col I 和FN 表達水平顯著上升（P<0.05），見圖1D、E。且隨著代數增加，基礎狀態下，P4 CFs中α-SMA 和Col I平均熒光強度（圖1C）和表達水平（圖1D）較P1 CFs顯著上升。

2 新生小鼠CFs不同代數比較，P1新生小鼠CFs在Ang II刺激后，轉分化標志物表達顯著增加

新生小鼠CFs傳代的處理流程及鑒定如圖2A、B所示。與成年小鼠類似，細胞免疫熒光結果顯示，僅P1 新生小鼠CFs 接受Ang II 刺激48 h 后，其α-SMA、Col I 和FN 的平均熒光強度較對照組顯著增強（P<0.05）；處于P2～P4 的CFs 中α-SMA、Col I 和FN 平均熒光強度與對照組相比均無顯著變化（P>0.05），見圖2C。qPCR 和Western blot 結果也顯示，僅P1 CFs接受Ang II 刺激48 h 后，其α-SMA、Col I 和FN 表達水平顯著上升（P<0.05），見圖2D、E。且隨著代數增加，基礎狀態下，P4 CFs 中α-SMA、Col I和FN 表達水平較P1 CFs顯著上升，見圖2D。

3 Ang II 刺激成年小鼠CFs 不同時程比較，Ang II分別刺激24和48 h均可引起成年小鼠CFs轉分化

成年小鼠CFs細胞的處理如圖3A所示。細胞免疫熒光結果顯示，Ang II 分別處理24 和48 h 后，P1 CFs 中α-SMA、Col I 和FN 的平均熒光強度與對照組相比 均顯 著增 強（P<0.05），見 圖3B。 qPCR 和Western blot 結果顯示，P1 CFs 給予Ang II 刺激24 和48 h，細胞中α-SMA、Col I 和FN 的mRNA 和蛋白表達水平與對照組相比均顯著升高（P<0.05），見圖3C、D。

Figure 1.Transdifferentiation of adult mouse cardiac fibroblasts in different passages（P1 to P4）induced by Ang II for 48 h.A：the schematic diagram of cell culture；B：vimentin in adult mouse cardiac fibroblasts observed by immunofluorescence staining（scale bar=20 μm）；C：immunofluorescence staining（scale bar=25 μm）and average fluorescence intensity of α-SMA，Col I and FN；D：the mRNA expression of α-SMA, Col I and FN detected by qPCR；E：the protein expression of α-SMA，Col I and FN detected by Western blot.Mean±SEM. n=6.*P<0.05,**P<0.01 vs Ctrl（P1）group.圖1 成年小鼠成纖維細胞不同代數（P1～P4）給予Ang II刺激48 h后的轉分化情況

Figure 2.Transdifferentiation of neonatal mouse cardiac fibroblasts in different passages（P1 to P4）induced by Ang II for 48 h.A：the schematic diagram of cell culture；B：vimentin in neonatal mouse cardiac fibroblasts observed by immunofluorescence staining（scale bar=20 μm）；C：immunofluorescence staining（scale bar =25 μm）and average fluorescence intensity of α-SMA，Col I and FN；D：the mRNA expression of α-SMA，Col I and FN detected by qPCR；E：the protein expression of α-SMA，Col I and FN detected by Western blot.Mean±SEM. n=6.*P<0.05，**P<0.01 vs Ctrl（P1）group.圖2 新生小鼠成纖維細胞不同代數（P1～P4）給予Ang II刺激48 h后的轉分化情況

4 Ang II 刺激新生小鼠CFs 不同時程比較，Ang II刺激48 h可引起P1新生小鼠CFs轉分化

新生小鼠CFs細胞的處理如圖4A所示。細胞免疫熒光結果顯示，Ang II處理24和48 h后，P1新生小鼠CFs中α-SMA 和Col I的平均熒光強度與對照組相比均顯著增強（P<0.05），但FN的平均熒光強度僅在刺激48 h 后顯著增強，見圖4B。qPCR 和Western blot 結果均顯示，Ang II 處理24 和48 h 后，P1 CFs 中α-SMA 的mRNA 和蛋白表達水平與對照組相比均顯著上升（P<0.01），但Col I 和FN 的表達水平僅在刺激48 h后顯著升高，見圖4C、D。

5 比較不同血清濃度培養液培養成年小鼠CFs，在含0% 和2% FBS 的培養液培養時，CFs 受Ang II 刺激后轉分化更顯著

成年小鼠CFs細胞的處理如圖5A所示。細胞免疫熒光結果顯示，在含0% 和2% FBS 的培養液中培養時，P1 CFs接受Ang II刺激48 h后，其α-SMA、Col I和FN的平均熒光強度與對照組相比均顯著增強（P<0.05），見圖5B。qPCR 和Western blot 結果顯示，這些標志物的mRNA 和蛋白水平變化與免疫熒光的結果一致，見圖5C、D。值得注意的是，在無Ang II刺激情況下，5% FBS 培養液與0% FBS 培養液相比，CFs中α-SMA、Col I 和FN 的mRNA 表達水平均顯著升高，見圖5C。

6 比較不同血清濃度培養液培養新生小鼠CFs，在含0% 和2% FBS 的培養液培養時，CFs 受Ang II 刺激后轉分化更顯著

新生小鼠CFs細胞的處理如圖6A所示。細胞免疫熒光結果顯示，分別在含0% 和2% FBS 的培養液中培養時，P1 新生小鼠CFs 接受Ang II 刺激48 h 后，其α-SMA、Col I和FN 的平均熒光強度與對照組相比顯著增強（P<0.05）；在含5% FBS 的培養液中培養時，CFs中α-SMA、Col I和FN的平均熒光強度與對照組相比無顯著差異，見圖6B。qPCR 和Western blot結果呈現了一致的變化趨勢，見圖6C、D。同樣在無Ang II刺激情況下，5% FBS 培養液與0% FBS 培養液相比，CFs中α-SMA、Col I和FN的mRNA表達水平均顯著升高，見圖6C。

討 論

本研究對成年小鼠和新生小鼠CFs 轉分化的實驗條件進行了評估，結果表明成年小鼠CFs 最適宜的實驗條件為：P1，含0%或2% FBS的培養液，Ang II刺激24 或48 h；新生小鼠CFs 最適宜的實驗條件為：P1，含0%或2% FBS的培養液，Ang II刺激48 h。

CFs具有強大的分化潛能，增殖能力強且代謝旺盛，可體外培養、多次傳代［14-17］。有研究提出，當在培養皿中培養時，與P0 的大鼠CFs 相比，P1～P3 細胞的大小顯著增加，細胞中的肌成纖維細胞標志物α-SMA、vimentin、前列腺素和Col I表達水平顯著升高，大鼠CFs 隨著傳代數的增加，肌成纖維細胞的含量增多［18-19］。本研究利用Ang II 在不同細胞代數情況下刺激成年小鼠和新生小鼠的CFs，結果顯示P1 成年小鼠和新生小鼠CFs 在接受Ang II 刺激48 h 后均可出現顯著轉分化，隨著細胞傳代次數的增加，成年小鼠和新生小鼠CFs 自身也可以出現轉分化，導致Ang II無法進一步誘導轉分化。

據報道，用Ang II 刺激成年小鼠和新生小鼠CFs 24 h 可顯著上調細胞內肌成纖維細胞的標志物α-SMA 的表達，刺激至48 h 時，表達水平持續上升［20］。本研究使用Ang II 刺激P1 成年小鼠CFs 24 或48 h，刺激P1 新生小鼠CFs 48 h，均可出現顯著的轉分化。在Ang II 刺激P1 新生小鼠CFs 24 h 時，僅轉分化標志物α-SMA 的表達顯著升高，細胞外基質蛋白Col I和FN 的表達無顯著差異。結合之前的研究，我們推斷在Ang II 刺激P1 新生小鼠CFs 24 h 時，可能由于刺激時間較短，不足以誘導細胞發生顯著的轉分化導致構建模型不穩定。所以，使用Ang II 構建成年小鼠細胞模型時，刺激時程24 和48 h 均適用；而構建新生小鼠細胞模型時，選擇48 h更合適。

FBS 是一種含有細胞生長和維持所需營養物質的復合物［21］。研究顯示，FBS 以劑量依賴的方式激活小鼠CFs中TGF-β1信號通路，促進CFs轉分化［22］。本研究對在含0% FBS、2% FBS 和5% FBS 的培養液中培養的成年小鼠和新生小鼠CFs 給予Ang II 刺激48 h 后，觀察成年小鼠和新生小鼠CFs 僅在含0% 和2% FBS 的培養液中培養時，細胞發生顯著的轉分化。我們的結果還顯示，在無Ang II 刺激情況下，5% FBS 培養液與0% FBS 培養液相比，CFs 中α-SMA、Col I 和FN 的mRNA 表達水平均顯著升高。因此，我們推斷導致上述差異的原因可能是在高血清狀態下，血清會促進CFs轉分化導致Ang II無法進一步誘導細胞的轉分化，過高的血清濃度均會影響成年小鼠和新生小鼠CFs的轉分化。

Figure 3.Transdifferentiation of adult mouse cardiac fibroblasts after Ang II stimulation for 24 and 48 h.A：the schematic diagram of cell culture；B：immunofluorescence staining（scale bar =25 μm）and average fluorescence intensity of α-SMA，Col I and FN；C：the mRNA expression of α-SMA，Col I and FN detected by qPCR；D：the protein expression of α-SMA，Col I and FN detected by Western blot.Mean±SEM. n=6.*P<0.05，**P<0.01 vs Ctrl（24 h）group；#P<0.05，##P<0.01 vs Ctrl（48 h）group.圖3 成年小鼠成纖維細胞在Ang II刺激24和48 h后的轉分化情況

Figure 5.Transdifferentiation of adult mouse cardiac fibroblasts in media containing different concentrations（0%，2% and 5%）of fe?tal bovine serum（FBS）after Ang II stimulation for 48 h.A：the schematic diagram of cell culture；B：immunofluores?cence staining（scale bar=25 μm）and average fluorescence intensity of α-SMA，Col I and FN；C：the mRNA expression of α-SMA，Col I and FN detected by qPCR；D：the protein expression of α-SMA，Col I and FN detected by Western blot.Mean±SEM. n=6.*P<0.05，**P<0.01 vs Ctrl（0% FBS）group；*P<0.05，**P<0.01 vs Ctrl（2% FBS）group.圖5 成年小鼠成纖維細胞在不同血清濃度（0%、2%和5%）培養液培養時，給予Ang II刺激48 h后的轉分化情況

Figure 6.Transdifferentiation of neonatal mouse cardiac fibroblasts in media containing different concentrations（0%，2% and 5%）of fetal bovine serum（FBS）after Ang II stimulation for 48 h.A：the schematic diagram of cell culture；B：immunofluores?cence staining（scale bar=25 μm）and average fluorescence intensity of α-SMA，Col I and FN；C：the mRNA expression of α-SMA，Col I and FN detected by qPCR；D：the protein expression of α-SMA，Col I and FN detected by Western blot.Mean±SEM. n=6.*P<0.05，**P<0.01 vs Ctrl（0% FBS）group；#P<0.05，##P<0.01 vs Ctrl（2% FBS）group.圖6 新生小鼠成纖維細胞在不同血清濃度（0%、2%和5%）培養液培養時，給予Ang II刺激48 h后的轉分化情況

綜上所述，本研究進一步優化Ang II 誘導的CFs轉分化細胞模型的實驗條件，主要通過對成年小鼠和新生小鼠CFs 的不同代數、不同處理時程和不同血清濃度培養液培養進行評估，顯示在含0% 或2%FBS 的培養液中用Ang II 刺激P1 成年小鼠24 或48 h均可以出現顯著的轉分化，在含0% 或2% FBS 的培養液中用Ang II刺激P1新生小鼠48 h可以出現顯著的轉分化。以上分別是CFs轉分化成年小鼠/新生小鼠細胞模型的較優的實驗條件。本研究將為后續對于心臟纖維化的相關研究奠定實驗基礎。