慢性阻塞性肺疾病小鼠模型制備方法的比較研究*

梅曉峰， 趙 鵬，3， 盧瑞龍， 崔莉莉， 田燕歌，3， 李建生，3△

（河南中醫藥大學1呼吸疾病中醫藥防治省部共建協同創新中心，2河南省中醫藥防治呼吸病重點實驗室，3中醫藥科學院，河南 鄭州 450046）

慢性阻塞性肺疾病（chronic obstructive pulmo?nary disease，COPD）是一種以持續氣流受限為特征的可預防和治療的疾病［1］。據世界經濟論壇評估，2030 年，COPD 全球經濟負擔將達每年50 萬億美元［2］。COPD 已成為威脅公眾健康的第三大死亡原因疾病［3］，香煙煙霧（cigarette smoke，CS）暴露、細菌及病毒感染均是誘發和加重COPD 的重要因素。COPD 病理機制復雜，動物模型是闡釋發病機制、尋找有效藥物的重要工具。因此，建立穩定可靠的COPD模型具有重要意義。

大鼠、豚鼠、小鼠和雪貂等常用于制備COPD 模型，其中小鼠具有成本低、體積小、易于飼養和基因組改造技術成熟等優勢，是復制人類疾病模型的最常用動物［4］。COPD 模型制備的方法主要包括CS 熏吸、氣管內滴注細菌或脂多糖及吸入SO2等［5-6］，但大多方法周期長，病變持續時間短。本課題組前期成功建立了香煙聯合肺炎克雷伯桿菌（Klebsiella pneu?moniae，KP）感染的大鼠模型，具有成模早，病理表現接近臨床，且病變持續時間長的優勢［7］。本研究在前期工作基礎上，綜合多種致病因素，采用CS 暴露、KP 感染、聚肌胞苷酸（polyinosinic-polycytidylic acid，Poly I：C）滴鼻、CS 暴露聯合KP 感染和CS 聯合Poly I：C 滴鼻5 種方法建立COPD 模型，通過比較單一及復合致病因素的致病特點及病變程度，以期建立一種穩定可靠、且與臨床病理特征相符合的小鼠模型，為深入研究COPD 的發病機制及藥物作用機制提供依據。

材料和方法

1 動物和細菌

SPF級BALB/c小鼠288只，雄性，體重（20±2）g，購自北京維通利華實驗動物技術有限公司，合格證號為110011200106861568，許可證號為SCXK（京）2016-0006。本研究通過河南中醫藥大學實驗動物福利倫理審查委員會審查批準（倫理審查批號為DWLL202003210）。

肺炎克雷伯桿菌（貨號46114）購自中國生物制品檢驗鑒定所，使用前將細菌濃度調整為5×109CFU/L（預實驗確定）。

2 實驗材料、試劑和儀器

紅旗渠過濾嘴香煙（烤煙型，焦油量10 mg，煙氣煙堿量0.8 mg，煙氣一氧化碳量12 mg）由河南中煙工業有限責任公司生產；Poly I：C（貨號tlrl-picw-250）購自Invivogen，每次使用前將濃度調至1.25 g/L（預實驗確定）；小鼠腫瘤壞死因子α（tumor necrosis fac?tor-α，TNF-α）ELISA Kit（貨號555268）和小鼠白細胞 介 素6（interleukin-6，IL-6） ELISA Kit（ 貨 號555240）購自BD；小鼠基質金屬蛋白酶2（matrix me?talloproteinase-2，MMP-2） ELISA Kit（ 貨 號E-ELM0780c）購自Elabscience。 動物肺功能檢測系統（FinePointe PFT）；全波長酶標儀（Multiskan GO）；樣品破碎系統（TissueLyser Ⅱ）；高速臺式冷凍離心機（D-37520）。

3 方法

3.1 分組將288只SPF級BALB/c小鼠隨機分為6組：空白組（normal 組）、CS 組、細菌組（KP 組）、CS 聯合KP 組（CS+KP 組）、Poly I：C 組和CS 聯合Poly I：C組（CS+Poly I：C組），每組48只。

3.2 小鼠模型的制備第1～8 周，CS 組單用CS 熏吸，KP組單用KP（每只1×105CFU）滴鼻，CS+KP組采用CS 熏吸聯合KP 滴鼻，Poly I：C 組單用Poly I：C（每只25 μg）滴鼻，CS+Poly I：C 組采用CS 熏吸聯合Poly I：C 滴鼻。CS 熏吸方法：將小鼠放入熏煙箱，點燃香煙，使煙霧濃度達到（30±5）%進行煙霧熏吸，每次40 min，每天2次。KP 和Poly I：C 經鼻滴注，每7 d 1次，共8周。

分別于第4周（造模4周）、第8周（造模8周）、第16 周（停止造模8 周）及第24 周（停止造模16 周）取材。

3.3 肺功能測定分別于第0、4、8、12、16、20 和24周采用小動物全身體積描記檢測系統檢測小鼠50%潮氣量呼氣流量（50% tidal volume expiratory flow，EF50）和呼氣峰流速（peak expiratory flow，PEF）等指標。

3.4 肺組織病理學觀察采用10 %中性甲醛固定肺組織，72 h 后進行石蠟包埋及HE 染色。每張肺組織切片隨機截取6 個肺泡視野圖片，在圖片中央畫出“十”字，計算每個視野的肺泡數（alveolar number，Na）、肺泡隔膜數（septum number，Ns）、測量長度（length，L）和面積（size，S），計算公式如下：肺泡平均截距（mean linear intercept，MLI；μm）=L/Ns，平均肺泡數（mean alveolar number，MAN；mm?2）=Na/S［8］。

3.5 ELISA 檢測肺組織中TNF-α、IL-6 和MMP-2 水平將小鼠右肺分離后，50 mg 肺組織勻漿取上清，根據ELISA 試劑盒說明書檢測小鼠肺組織中TNFα、IL-6和MMP-2的水平。

3.6 R 值綜合評價采用R值綜合評價法［9］分別對各時點小鼠肺功能、肺組織病理、炎癥和蛋白酶指標進行R值綜合評價（R綜合），比較5 種造模方法對COPD 小鼠的病變程度。R綜合值大于CS 組R綜合值說明病變程度強于CS 組，R綜合值小于CS 組說明病變程度弱于CS組。

4 統計學處理

采用SPSS 22.0 統計軟件進行數據分析。計量數據以均數±標準差（mean±SD）描述。多組間比較采用方差分析，各組均數間的兩兩比較采用SNK-q檢驗。當P<0.05時認為差異有統計學意義。

結 果

1 肺功能

第4 周，與normal 組比較，CS+KP 組的PEF 顯著降低（P<0.05）；第8 周和第12 周，與normal 組比較，CS 組、CS+KP 組和CS+Poly I：C 組的PEF 和EF50 顯著降低（P<0.05），KP 組和Poly I：C 組的PEF 顯著降低（P<0.05）；第16 周，與normal 組比較，CS 組、CS+KP 組和CS+Poly I：C 組的PEF 和EF50 均 顯 著降低（P<0.05）；第20 周和第24 周，與normal 組比較，CS+KP 組和CS+Poly I：C 組的PEF 和EF50 顯著降低（P<0.05），見表1、2。

表1 不同時點各組小鼠PEF的變化Table 1.The changes of PEF in each group at each time point（mL/s.Mean±SD. n=8 to12）

表2 不同時點各組小鼠EF50的變化Table 2.The changes of EF50 in each group at each time point（mL/s.Mean±SD. n=8 to 12）

2 肺組織病理變化

HE 染色結果顯示，normal 組小鼠肺組織結構正常，未見病理改變；造模8 周后，CS 組、CS+KP 組和CS+Poly I：C 組小鼠肺組織出現大量炎癥細胞浸潤、肺泡腔擴張、肺泡壁斷裂融合、氣管壁增厚等病理變化，KP 組和Poly I：C 組小鼠肺組織僅出現炎癥細胞浸潤、肺泡腔擴張，見圖1。

Figure 1.The pathological changes in lung tissues of mouse in each group at each time point（HE staining，×200）.圖1 不同時點各組小鼠肺組織的病理變化

第4周，與normal組比較，CS+KP 組的MAN 顯著降低，MLI顯著升高（P<0.05）；第8周，與normal組比較，CS 組、CS+KP 組和CS+Poly I：C 組MAN 顯著降低，MLI顯著升高，KP組和Poly I：C組的MAN顯著降低，CS+KP 組較KP 組和Poly I：C 組的MAN 顯著降低（P<0.05）；第16 周，與normal 組比較，CS+KP 組和CS+PolyI：C 組的MAN 顯著降低，MLI 顯著升高，CS組的MAN 顯著降低（P<0.05）；第24 周，與normal 組比較，CS+KP 組和CS+Poly I：C 組的MAN 顯著降低，MLI 顯著升高，CS+KP 組較CS 組和KP 組和Poly I：C組的MLI顯著升高（P<0.05），見表3、4。

表3 不同時點各組小鼠平均肺泡數的變化Table 3.The changes of MAN in each group at each time point（mm?2.Mean±SD. n=8 to 12）

3 肺組織中TNF-α和IL-6的變化

第4 周，與normal 組比較，CS+KP 組的TNF-α 和IL-6 顯著升高（P<0.05）；第8 周，與normal 組比較，CS 組、CS+KP 組和CS+Poly I：C 組的TNF-α 和IL-6 均顯著升高，KP 組的TNF-α 顯著升高，CS+KP 組較CS組的IL-6 顯著升高，較KP 組和Poly I：C 組的TNF-α和IL-6 顯著升高，CS+Poly I：C 組較CS 組、KP 組和Poly I：C 組的IL-6 顯著升高（P<0.05）；第16 周，與normal 組比較，CS+KP 組和CS+Poly I：C 組的TNF-α和IL-6均顯著升高，CS組、KP 組和Poly I：C 組的IL-6顯著升高，CS 組較KP 組和Poly I：C 組的IL-6 顯著升高，CS+KP組和CS+Poly I：C組較CS組的TNF-α顯著升高，較KP 組和Poly I：C 組的TNF-α 和IL-6 顯著升高（P<0.05）；第24 周，與normal 組比較，CS+KP 組和CS+Poly I：C 組的TNF-α 和IL-6 顯著升高，CS+KP 組較CS 組、KP 組和Poly I：C 組的IL-6 顯著升高（P<0.05），見表5、6。

表5 不同時點各組小鼠肺組織中TNF-α水平的比較Table 5.Comparison of the levels of TNF-α in each group at each time point（ng/L.Mean±SD. n=8 to 12）

表4 不同時點各組小鼠肺泡平均截距的變化Table 4.The changes of MAN in each group at each time point（μm.Mean±SD. n=8 to 12）

表6 不同時點各組小鼠肺組織中IL-6水平的比較Table 6.Comparison of the levels of IL-6 in each group at each time point（ng/L.Mean±SD. n=8 to 12）.

4 肺組織中MMP-2的變化

第8 周，與normal 組比較，CS 組、KP 組、CS+KP組、Poly I：C 組和CS+Poly I：C 組的MMP-2 均顯著升高，CS+KP 組和CS+Poly I：C 組較CS 組、KP 組和Poly I：C 組的MMP-2 顯著升高（P<0.05）；第16 周，與nor?mal 組比較，CS 組、KP 組、CS+KP 組、Poly I：C 組和CS+Poly I：C 組的MMP-2 顯著升高，CS+KP 組較CS組、KP 組和Poly I：C 組的MMP-2 顯著升高，CS+Poly I：C 組較KP 組和Poly I：C 組的MMP-2 顯著升高（P<0.05）；第24 周，與normal 組比較，CS 組、CS+KP 組和CS+Poly I：C 組 的MMP-2 顯著升高（P<0.05），見表7。

表7 不同時點各組小鼠肺組織中MMP-2水平的比較Table 7.Comparison of the levels of MMP-2 in each group at each time point（μg/L.Mean±SD. n=8 to 12）

5 R值綜合評價

R值綜合評價結果顯示，造模4 周，CS+KP 組的R綜合值較CS 組、KP 組和Poly I：C 組顯著升高（P<0.05），各模型組的病變程度依次為CS+KP>CS>CS+Poly I：C>Poly I：C>KP；造模8 周，CS+KP 組和CS+Poly I：C 組的R綜合值較KP 組和Poly I：C 組顯著升高（P<0.05），各模型組的病變程度依次為CS+KP>CS+Poly I：C>CS>KP>Poly I：C；第16 周，CS+KP 組和CS+Poly I：C 組的R綜合值較KP 組和Poly I：C 組顯著升高，CS 組的R綜合值顯著高于Poly I：C 組（P<0.05），各模型組的病變程度依次為CS+KP>CS+Poly I：C>CS>KP>Poly I：C；第24 周，CS+KP 組和CS+Poly I：C 組的R綜合值較CS 組、KP 組和Poly I：C 組顯著升高，CS 組的R綜合值顯著高于Poly I：C組（P<0.05），各模型組的病變程度依次為CS+KP>CS+Poly I：C>CS>KP>Poly I：C；綜合所有時點R值結果顯示，與CS 組比較，KP組和Poly I：C 組的R綜合值顯著降低，CS+KP 組和CS+Poly I：C 組的R綜合值較CS 組、KP 組和Poly I：C 組顯著升高（P<0.05），見表8。

表8 不同時點各組小鼠指標R值綜合評價Table 8.The changes of comprehensive R values in each group at each time point and all time points（Mean±SD. n=7）

討 論

COPD 的發病率和死亡率在世界范圍內呈上升趨勢，其特點是慢性氣道炎癥、不可逆氣流受限和肺功能的加速下降。誘發和加重COPD 的環境危險因素主要包括吸煙、細菌病毒感染、職業性粉塵和空氣污染等。臨床上90% 的COPD 患者為吸煙者或曾有吸煙史［10］。吸煙可損傷上皮組織，引起炎癥細胞向黏膜、黏膜下層和腺體組織浸潤，誘發杯狀細胞和基底細胞增生、鱗狀上皮細胞化生、細胞外基質沉積增多，導致氣道重塑引起氣流受限［11-12］。此外，呼吸道感染是COPD 發病和加重的主要原因，與非感染性COPD 患者相比，細菌和病毒感染者的住院周期延長、低氧血癥和肺功能惡化程度加重、死亡率升高［13-16］。常見的感染細菌為流感嗜血桿菌、肺炎鏈球菌、肺炎克雷伯菌、銅綠假單胞菌和卡他莫拉菌，常見的病毒為單鏈RNA 病毒，如鼻病毒、副流感病毒、流感病毒和呼吸道合胞病毒［17-18］。

文獻中多采用單純CS 熏吸［19］、氣管內滴注彈性蛋白酶［20］、CS聯合脂多糖［21］及CS聯合細菌或病毒［22］構建COPD 動物模型，但存在諸多不足，如造模周期較長、病理改變不穩定、無法較好模擬COPD 臨床特征。活病毒用于動物模型的制備具有一定的風險、不易質控的局限性。Poly I：C 是雙鏈核糖核酸的合成類似物，結構明確、無傳染性、易于操作，可模擬呼吸道病毒感染復制的中間產物，誘發機體損傷，體內外研究常用Poly I：C 模擬RNA 病毒感染作用［23-24］。本課題組前期采用CS 熏吸聯合細菌感染成功模擬COPD 大鼠模型，造模8周即可呈現COPD 病理特征，觀察至第32 周，病變特征穩定。本研究以經濟、個體差異小的近交系小鼠為研究對象，通過比較CS、肺炎克雷伯桿菌和Poly I：C 單因素及復合因素誘導的COPD 模型，以期建立一種簡單、穩定、安全有效且成模周期短的造模方法。

肺功能和肺組織病理改變是COPD 動物模型制備的重要評價標準［25］。其中，無創肺功能的測定可動態監測氣道阻塞、肺容積、傳導性和通氣參數等變化，如EF50 反應氣道阻塞嚴重程度，潮氣量反應肺容積變化；PEF 反應傳導性變化，每分鐘通氣量反應通氣情況變化等［26］。肺組織病理改變作為評價COPD 模型的標準之一，可反映氣道和肺組織病變的嚴重程度［27］。王瑋等［28］采用香煙聯合氣道滴入脂多糖發現造模12 周各模型組大鼠在肺功能和肺病理方面出現COPD 的典型病理變化。炎癥反應和蛋白酶-抗蛋白酶失衡是COPD 的主要病理機制［29-30］。CS、細菌和病毒等致病因素侵入機體，刺激上皮細胞、肺泡巨噬細胞和T 細胞等產生多種炎癥因子，如TNF-α、IL-6 和IL-β 等，誘發炎癥反應級聯放大［31-33］，并引起各種蛋白酶失衡，促進巨噬細胞向肺實質及氣道聚集，誘導結構改變，導致肺氣腫的形成，促進COPD發生發展［34］。

本研究結果顯示，造模4 周后，CS 聯合細菌可降低小鼠肺功能，提高炎癥因子水平，CS 聯合細菌或Poly I：C 組肺組織出現病理損傷；造模8 周后，各模型組小鼠均出現COPD 典型病理變化，肺功能顯著降低，炎癥因子TNF-α、IL-6 和MMP-2 顯著升高；停止造模8 周后，各模型組病理變化依然存在；停止造模16 周后，CS 聯合細菌或Poly I：C 組病理變化仍持續存在。R值綜合評價結果顯示，造模4 周CS 聯合細菌組即可出現COPD 病理特征；造模8 周CS 聯合細菌或Poly I：C 組病理特征重于CS、細菌和Poly I：C組，且病理損傷可持續至停止造模后16周。

綜上所述，CS、細菌和Poly I：C 及其聯合均可以不同程度的引起小鼠肺功能下降、肺病理損傷，其中CS 聯合細菌或Poly I：C 組病理特征出現早、明顯、持續時間長，其病理學特征類似于COPD 患者，適用于發病機制的防治研究。