慢病毒介導的ADAM8基因沉默對胃癌MKN45細胞EMT、侵襲和遷移的影響

阿繼鵬 李德元 曹貴章

(青海省交通醫(yī)院普外科，青海 西寧 810001)

胃癌5年總生存率低，侵襲和轉移是其手術、放療和化療失敗的主要原因〔1～6〕。更好地了解腫瘤發(fā)生和癌細胞轉移對于胃癌患者的診斷標志物和新型有效療法的開發(fā)是必不可少的。解整合素和金屬蛋白酶(ADAM)8基因是ADAM蛋白酶家族的成員，具有蛋白水解酶活性，參與機體炎癥反應過程〔7〕。ADAM8在多種腫瘤中表達上調，如膠質瘤、肺腺癌、前列腺癌和乳腺癌等，在腫瘤的發(fā)病及進展中起積極作用〔8～10〕。研究顯示，ADAM8在胃癌組織中呈高表達，且與胃癌的淋巴結轉移、腫瘤大小、臨床分期等病理特征密切相關，提示ADAM8的高表達可能與胃癌的侵襲和轉移有關〔11〕。然而關于ADAM8對胃癌細胞上皮間質轉化(EMT)、侵襲和遷移的研究目前鮮有報道。因此本實驗通過慢病毒介導的ADAM8基因沉默探究ADAM8對胃癌MKN45細胞EMT、侵襲和遷移的影響，以期為胃癌的靶向治療提供新的實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1細胞株和主要試劑 人胃癌細胞株MKN45由中國科學院上海細胞資源中心提供；RPMI1640培養(yǎng)基由美國Invitrogen公司提供；胰蛋白酶、胎牛血清由美國Gibco公司提供；Real-time反轉錄試劑盒由日本TaKaRa公司提供；Trizol試劑、Real-time PCR檢測試劑盒由美國Promega公司提供；細胞裂解液、電化學發(fā)光(ECL)檢測試劑盒由美國Thermo公司提供；十二烷基硫酸鈉(SDS)-聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)配制試劑盒、二喹啉甲酸(BCA)蛋白濃度測定試劑盒由上海碧云天生物技術研究所提供；ADAM8 shRNA慢病毒載體構建及包裝由上海吉凱基因化學技術有限公司完成；Transwell小室由美國Millipore公司提供；基質膠由美國BD公司提供；ADAM8、E-鈣黏蛋白(cadherin)、波形蛋白(Vimentin)和N-cadherin單抗及辣根過氧化物酶標記的二抗均由美國CST公司提供。

1.2細胞培養(yǎng) 人胃癌MKN45細胞培養(yǎng)在含10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液中，放置在體積分數(shù)5%CO2、飽和濕度、37℃恒溫培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)。用顯微鏡觀察MKN45細胞狀況，待細胞貼壁生長密度達90%時，使用0.25%胰蛋白酶消化MKN45細胞，按照1∶3的比例進行傳代。

1.3MKN45細胞的慢病毒轉染 對數(shù)期的胃癌MKN45細胞用胰酶消化，以1×105/孔接種于6孔板中，放置到37℃培養(yǎng)箱過夜培養(yǎng)，待細胞生長融合率達50%左右時進行慢病毒轉染，其中感染復數(shù)(MOI)=20(參照預實驗結果)，將ADAM8 shRNA慢病毒載體轉染MKN45細胞記為實驗組(sh-ADAM8組)，將慢病毒空載體轉染MKN45細胞記為陰性對照組(sh-NC組)，未行轉染處理的MKN45細胞記為空白對照組(Blank組)。轉染后各組MKN45細胞繼續(xù)培養(yǎng)72 h，收集細胞進行相關指標檢測。

1.4Real-time PCR檢測 收集轉染72 h各組MKN45細胞，采用Trizol法抽提細胞總RNA，使用Nanodrop超微量核酸檢測儀測定RNA的純度和濃度。使用Real-time反轉錄試劑盒將RNA逆轉錄合成cDNA，以cDNA為模板，18s RNA為內參，每組設置3個復孔，采用Real-time PCR檢測試劑盒行Real-time PCR檢測。ADAM8引物：上游引物5′-CGATGATGCTGCCTGCGATTG-3′；下游引物5′-CGCAGGTGGAGGGTGAAGTT-3′。18s RNA引物：上游引物5′-GTAACCCGTTGAACCCCATT-3′；下游引物5′-CCATCCAATCGGTAGTAGCG-3′。反應程序設為：95℃ 5 min；95℃ 30 s，60℃ 30 s，72℃ 30 s，共40個循環(huán)。待反應結束后，獲取內參基因和目的基因的Ct值，采用相對定量2-ΔΔCt法分析各組MKN45細胞中ADAM8 mRNA的表達水平。

1.5Western印跡檢測 收集轉染72 h各組MKN45細胞，加入適量細胞裂解液，于冰上裂解細胞30 min提取總蛋白。用BCA蛋白濃度測定試劑盒對蛋白定量，在蛋白中加入3倍的上樣緩沖液，沸水加入5 min。配制SDS-PAGE凝膠，每個泳道孔加入30 μg蛋白樣品，行凝膠電泳，蛋白分離后轉印到聚偏氟乙烯(PVDF)膜上，于50 g/L脫脂奶粉中封閉2 h，洗滌膜后加入相應一抗，ADAM8一抗為1∶800稀釋，E-cadherin、Vimentin和N-cadherin一抗為1∶600稀釋，4℃孵育過夜，洗滌膜后再加入1∶2 000稀釋的二抗，室溫孵育1.5 h，洗滌膜后滴加ECL顯色液，顯影，曝光，以GAPDH進行標定，用Image J軟件分析各組MKN45細胞中目的蛋白表達水平。

1.6Transwell實驗 基質膠融化，用不含血清的培養(yǎng)液稀釋，加入Transwell小室的上室進行包被，晾干備用。收集轉染72 h后的各組MKN45細胞，加入不含血清的培養(yǎng)液懸浮細胞，調整細胞密度至1×105/ml。取200 μl細胞懸液加入基質膠包被的Transwell小室的上室，下室添加600 μl含10%胎牛血清的培養(yǎng)液，在37℃培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)24 h。取出小室，用棉簽擦去未穿過基底膜的細胞，甲醇固定后結晶紫染色，于顯微鏡下觀察各組MKN45細胞侵襲細胞數(shù)。

1.7劃痕實驗 轉染后各組MKN45細胞培養(yǎng)至對數(shù)生長期，以胰酶消化收集細胞，加入培養(yǎng)液重懸細胞，接種到34孔板中，放置在37℃培養(yǎng)箱常規(guī)培養(yǎng)，待細胞呈單層融合時，使用滅菌的槍頭在細胞中進行劃痕，PBS洗去劃下的細胞，更換培養(yǎng)液，放置在37℃培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)72 h，在倒置顯微鏡下觀察細胞劃痕寬度，分別計算各組MKN45細胞遷移率，細胞遷移率(%)=遷移距離/初始劃痕距離×100%。

1.8統(tǒng)計學分析 采用SPSS21.0軟件進行單因素方差分析。

2 結 果

2.1構建穩(wěn)定沉默ADAM8基因的MKN45細胞株 與sh-NC組相比，sh-ADAM8組MKN45細胞中ADAM8 mRNA和蛋白表達水平均明顯降低(P<0.05)，與Blank組相比，sh-NC組中ADAM8 mRNA和蛋白表達水平無明顯改變(P>0.05)。見圖1、表1。提示穩(wěn)定沉默ADAM8基因的MKN45細胞株構建成功。

圖1 Western印跡檢測MKN45細胞中ADAM8蛋白的表達

表1 各組MKN45細胞中ADAM8 mRNA和蛋白表達比較

2.2沉默ADAM8基因阻礙MKN45細胞EMT的發(fā)生 與sh-NC組相比，sh-ADAM8組MKN45細胞中E-cadherin蛋白表達明顯上調(P<0.05)，Vimentin和N-cadherin蛋白表達明顯下調(P<0.05)，與Blank組相比，sh-NC組中E-cadherin、Vimentin和N-cadherin蛋白表達無明顯改變(P>0.05)。見圖2、表2。表明沉默ADAM8基因能夠抑制MKN45細胞EMT過程。

表2 各組MKN45細胞中E-cadherin、Vimentin和N-cadherin蛋白表達比較

圖2 Western印跡檢測E-cadherin、Vimentin和N-cadherin蛋白表達

2.3沉默ADAM8基因抑制MKN45細胞侵襲能力 與sh-NC組相比，sh-ADAM8組侵襲細胞數(shù)明顯減少(P<0.05)，與Blank組相比，sh-NC組侵襲細胞數(shù)無明顯改變(P>0.05)。見表3。表明沉默ADAM8基因能夠抑制MKN45細胞侵襲能力。

2.4沉默ADAM8基因抑制MKN45細胞遷移能力 與sh-NC組相比，sh-ADAM8組細胞遷移率明顯降低(P<0.05)，與Blank組相比，sh-NC組細胞遷移率無明顯改變(P>0.05)。見表3。表明沉默ADAM8基因能夠抑制MKN45細胞遷移能力。

表3 各組MKN45細胞侵襲細胞數(shù)、細胞遷移率比較

3 討 論

ADAM8基因位于人類染色體10q26.3上，其編碼的蛋白質由824個氨基酸組成。ADAM8蛋白既具有蛋白水解酶的功能，可參與降解細胞外基質；又具有去整合素的功能，可參與調節(jié)細胞形態(tài)和運動〔12〕。研究表明，ADAM8作為促癌基因在肺癌、胰腺癌、乳腺癌和肝癌等多種惡性腫瘤組織和細胞中異常高表達，并且ADAM8的過量表達與腫瘤轉移相關〔13，14〕。劉光耀等〔15〕研究顯示，ADAM8在胃癌細胞株中的表達顯著高于正常細胞，提示ADAM8可能參與胃癌的發(fā)生和發(fā)展。但ADAM8在胃癌細胞中的研究目前尚未見報道。

本實驗采用慢病毒轉染技術，將ADAM8 shRNA轉染至胃癌MKN45細胞，分別在基因和蛋白水平上驗證了成功構建穩(wěn)定沉默ADAM8的MKN45細胞。隨后Transwell實驗和劃痕實驗結果顯示，沉默ADAM8的MKN45細胞侵襲和遷移能力均明顯降低。EMT是具有極性的上皮細胞向具有活動能力的間充質細胞轉化的過程。研究顯示，EMT與腫瘤的浸潤和轉移密切相關，EMT的發(fā)生為腫瘤轉移的發(fā)生提供先決條件〔16〕。本實驗結果提示沉默ADAM8能夠抑制EMT的發(fā)生，進而影響細胞侵襲和轉移能力。本實驗結果與以往關于ADAM8調節(jié)腫瘤細胞侵襲和轉移的研究相符，如胡以利等〔17〕研究顯示，ADAM8的表達異常升高能夠正向調控胃癌細胞的增殖活性和侵襲能力。如Conrad等〔18〕研究指出，ADAM8通過上調MMP-9和跨內皮遷移來促進乳腺癌MB-231細胞轉移。

綜上，沉默ADAM8可通過逆轉EMT抑制MKN45細胞的侵襲和遷移。提示ADAM8基因可能作為胃癌靶向治療的新靶點，為進一步探究ADAM8與腫瘤侵襲和轉移的關系提供新的實驗依據(jù)。然而，ADAM8在胃癌中是如何影響胃癌細胞侵襲和遷移，其具體作用機制尚需進一步探究。