基于代謝組學分析雪茄煙葉晾制時“青斑”組織的代謝差異及形成原因

于連營，楊錦鵬，余君，李楠芬，楊榮洲， 汪社亮，丁廣大，楊春雷，徐芳森

1.華中農業大學作物遺傳改良國家重點實驗室/微量元素研究中心，武漢430070；2.湖北省煙草科學研究院，武漢 430030

晾制過程是雪茄煙生產的關鍵步驟，新鮮煙葉在晾制過程中外觀顏色會發生顯著變化，這種外觀變化與葉綠素、類胡蘿卜素等質體色素關系密切。新鮮煙葉由于葉綠素含量較高而呈綠色[1]，在晾制過程中葉綠素被不斷降解，而類胡蘿卜素降解速度遠低于葉綠素，導致類胡蘿卜素與葉綠素的比值不斷升高，使煙葉顏色逐漸轉為黃色[2]，質體色素含量高低影響晾制后煙葉的外觀質量。茄衣煙葉作為雪茄產品可被消費者直觀評價，對其在晾制過程中所形成的外觀顏色要求較高[3]，因此，茄衣的外觀質量直接決定了雪茄煙的品質與檔次[4]。

茄衣煙葉在自然晾制過程中易出現青色斑點(簡稱“青斑”)，影響煙葉外觀質量和內在品質，代謝組學技術被廣泛應用于研究植物外觀顏色變化[5-6]，但基于代謝組學技術探究雪茄煙晾制過程外觀顏色變化尚未見報道。本研究以茄衣煙葉‘楚雪10號’品種為試驗材料，利用高壓液相色譜串聯質譜(HPLC-MS/MS)非靶向代謝組學技術，探究晾制期間煙葉“青斑”和正常組織部位代謝差異及“青斑”形成的可能原因，以期為晾制期間避免葉片產生“青斑”、提高煙葉外觀質量提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 試驗概況

試驗于2020年在湖北省恩施州崔壩晾曬煙基地(30°27′N，109°47′E；海拔860 m)開展。供試材料為雪茄煙品種‘楚雪10號’(CX-010)。田間試驗小區長8.0 m、寬4.0 m，共四行區，每行20株。供試土壤基本理化性質：堿解氮66.05 mg/kg、有機質21.17 g/kg、有效磷52.63 mg/kg、速效鉀128.30 mg/kg、pH值7.26。栽培中基施有機肥100 kg/667 m2，氮磷鉀化肥按N∶P2O5∶K2O=1∶1.5∶3配比施用，管理按照當地雪茄煙葉生產技術規范統一進行。成熟后采收中部煙葉，掛入4 m×7 m晾房，隨外界氣溫進行自然晾制。晾制期間每隔1 h記錄1次溫濕度，晾房溫濕度曲線如圖1所示，平均溫度為23.01 ℃，平均濕度為83.7%。晾制期間葉片出現了不同程度的青色斑點(圖2)，圖2所示煙葉為取自晾制末期的樣品，右上角為“青斑”和正常部位放大圖。晾制結束后在晾房隨機取煙葉樣品并迅速置于干冰中，隨后轉移至 -80 ℃超低溫冰箱中保存。樣品分析前從超低溫冰箱中取出煙葉，用打孔器和刀片快速挖出煙葉“青斑”部位，設為樣品處理G(Green spot)，同時取無“青斑”的正常部位設為樣品處理N(Normal)。

圖2 晾制期間產生的“青斑”現象Fig.2 “Green spot” phenotype during air-curing period

1.2 葉綠素含量測定

葉綠素含量的測定采用95%乙醇浸提，分光光度法測定[7]。

1.3 代謝物提取

“青斑”(G) 和正常 (N) 2組處理各設置6個重復，記為G1～G6，N1～N6。取經液氮研磨過的“青斑”樣品和正常樣品各100 mg于EP管中，加入500 μL的80%甲醇(純度：LC-MS grade)水溶液。渦旋震蕩后于冰浴中靜置5 min，然后于13 000 r/min、4 ℃離心20 min。取一定量的上清液加入質譜級水稀釋至甲醇含量為53%。再次放入13 000 r/min、4 ℃離心20 min并收集上清液。從每個試驗樣本中取等體積樣本混勻作為質控(quality control,QC)樣本。用53%甲醇水溶液代替試驗樣本作為空白(Blank)樣本，前處理過程與試驗樣本相同。

1.4 代謝產物測定方法

色譜柱為HypesilGold column(C18)，色譜分離條件設置為：流速0.2 mL/min、柱溫40 ℃；正離子模式流動相A為0.1%甲酸，流動相 B為甲醇；負離子模式流動相 A為5 mmol/L 醋酸銨(pH=9.0)，流動相B為甲醇，流動相梯度洗脫程序見表1。質譜參數如下：噴霧電壓3.2 kV，鞘層氣體流速40 mL/min ，輔助氣體流速10 mL/min，毛細管溫度320 ℃，掃描范圍：m/z100～1 500。

表1 流動相梯度 Table 1 The gradient of mobile phase

1.5 數據處理

質譜檢測原始文件導入Compound Discoverer 3.1軟件進行譜圖處理及數據庫檢索，用Blank 樣本去除背景離子并對定量結果進行歸一化，使用MetaX軟件對數據進行對數轉換及標準化處理。差異代謝物篩選主要參考VIP(variable importance in the projection )、FC(fold change)和P值參數。VIP是指PLS-DA模型第一主成分的變量投影重要度[8]，數值越大表示該差異物質對樣品組間分類判別的影響強度和解釋能力越強；FC指差異倍數，本研究中FC為“青斑”(G)/正常(N)；P值表示差異顯著性水平。使用Microsoft Excel 2010進行數據整理計算，軟件GraphPad Prism 9繪圖和方差分析。

2 結果與分析

2.1 “青斑”部位與正常部位葉綠素的含量

青斑”部位與正常部位的葉綠素含量如圖3所示，“青斑”部位葉綠素a、b含量都顯著高于正常部位。正常部位煙葉葉綠素a含量平均為0.165 mg/g，“青斑”部位煙葉葉綠素a平均含量達到0.543 mg/g，是正常部位的3.29倍。正常部位葉綠素b平均含量為0.066 mg/g，“青斑”部位葉綠素b平均含量達到0.281 mg/g，是正常部位的4.26倍。這表明青色斑點中葉綠素含量高是呈現“青斑”的主要原因。

**和***分別表示在0.01和0.001水平上顯著相關。** and *** indicate significant correlation at the level of 0.01 and 0.001,respectively.

2.2 主成分分析

所有試驗樣本和QC樣本的主成分分析(principal component analysis,PCA)如圖4所示。從總樣本PCA圖(圖4A)可以看出，QC樣本點的分布較為聚集且位于中心區域，說明QC樣本差異較小，分析方法的穩定性好、數據質量高。從G、N兩組樣本PCA圖(圖4B)可以看出，第1成分(PC1)對樣本的貢獻率為64.94%，第2成分(PC2)對樣本的貢獻率為6.21%。每個處理內部的樣本點分布集中，說明組內樣本重復性較好，代謝物高度一致；不同處理間樣本點分布明顯分離，說明“青斑”部位和正常部位之間代謝物存在顯著差異。

2.3 偏最小二乘法判別分析

圖4 總樣本PCA圖(A)和G、N兩組樣本PCA圖(B)Fig.4 PCA diagram of total sample (A) and PCA diagram between group G and N (B)

圖5 PLS-DA得分散點圖(A)和排序驗證圖(B)Fig.5 Scatter plot of PLS-DA score (A) and sort verification diagram (B)

2.4 差異代謝物篩選

本研究設定閾值VIP>1.0、FC>4.0 或 FC<0.25、P<0.01[9-10]對所有代謝物進行篩選。兩組織部位共檢測到代謝物總數1 430個，其中“青斑”部位與正常部位間存在顯著差異的代謝物109個，包括25個顯著上調代謝物和84個顯著下調代謝物。

對鑒定到的代謝物進行功能和分類注釋，109個顯著差異代謝物在Human Metabolome Database(HMDB)數據庫中成功分類注釋到61個，包括50個下調代謝物和11個上調代謝物(表2)。由表2可見，兩組織部位顯著差異代謝物中氨基酸、肽及其類似物最多，共25個，占成功分類注釋代謝物總數的41.0%。“青斑”部位僅有色氨酸1種氨基酸含量顯著高于正常部位，而正常部位L-苯丙氨酸、酪氨酸等24種氨基酸、肽及其類似物顯著高于“青斑”部位。

表2 兩組織部位中顯著差異物注釋結果 Table 2 Annotation results of important foreign bodies in two tissue parts

2.5 潛在化學標記物篩選

為尋找雪茄煙葉“青斑”與正常組織部位的潛在化學標記物，對顯著上調差異物按VIP值排序，發現綠原酸VIP值最高，為1.70；按FC值排序發現綠原酸排名第二，差異倍數為13.42。由此可見，其在上調代謝物中具有重要意義，可作為“青斑”形成的關鍵化學標記物。在顯著下調差異物中，篩選發現二氫玉米素FC值最大，高達29.12，遠高于其他下調差異物。最終篩選出綠原酸和二氫玉米素作為“青斑”形成過程的化學標記物，使用箱形圖比較其在兩組織部位間的含量豐度差異(圖6)。

2.6 KEGG通路富集分析

將兩組織部位間顯著差異代謝物注釋到KEGG數據庫，通過Pathway分析確定代謝物參與的最主要的生化代謝途徑是氨基酸代謝，富集到差異代謝物56個，占差異代謝物總數的51.4%。進一步借助超幾何檢驗方法得到通路富集的P值，本研究設定P≤0.05的通路為顯著富集通路，共篩選出3條顯著性差異代謝通路，每條通路富集到的代謝物如表3所示。

圖6 綠原酸(A)和二氫玉米素(B)的相對含量豐度Fig.6 Relative content abundance of chlorogenic acid(A) and dihydrozeatin(B)

表3 顯著差異通路及其富集代謝物 Table 3 Significant difference pathway and its metabolite enrichment

由表3可以看出，“青斑”(G)和正常(N)2組處理間酪氨酸代謝、苯丙氨酸代謝和類黃酮生物合成途徑具有顯著差異，其中類黃酮生物合成途徑富集到了化學標記物——綠原酸。基于KEGG Pathway代謝通路數據庫，繪制了晾制煙葉中綠原酸生物合成及類黃酮生物合成途徑(圖7)。

本研究發現雪茄煙葉中綠原酸生物合成途徑有2條，第1條途徑為對香豆酸CoA經對香豆酰奎寧酸合成綠原酸，第2條途徑為對香豆酸CoA經對香豆酰莽草酸、咖啡酰莽草酸最終合成綠原酸。由圖7可見，在類黃酮生物合成途徑中，山奈酚參與雪茄煙葉黃酮醇的生物合成，二氫山奈酚、二氫楊梅素和二氫槲皮素則共同參與調控煙葉花青素的代謝。

3 討 論

3.1 雪茄煙葉晾制期間“青斑”產生的生理機制

在植物體中，葉綠素主要與蛋白質、脂類相結合以復合體的形式存在于葉綠體中。鮮煙葉中與葉綠素結合的蛋白質約占蛋白質總量的50%，當蛋白質充分降解時，絕大部分葉綠素也被降解[11]。煙葉蛋白質在晾制過程中會降解成氨基酸或多肽，對鑒定到的代謝物進行分類注釋時發現“青斑”和正常部位之間的顯著差異代謝物主要是氨基酸、多肽類物質，正常部位氨基酸、多肽和類似物有24個顯著增多，占下調代謝物總數的28.6%，而“青斑”部位僅有1種氨基酸上調，占上調代謝物總數的4.0%。通過Pathway分析可以確定代謝物參與的最主要的生化代謝途徑是氨基酸代謝，富集到差異代謝物56個，占差異代謝物總數的51.4%。上述差異說明正常部位煙葉蛋白質分解較充分，而“青斑”部位煙葉僅有少量蛋白質降解。煙葉葉綠素在晾制過程會降解形成新植二烯、植物呋喃和吡咯衍生物等產物[12]，在分析“青斑”和正常組織的顯著差異代謝物中，筆者發現3種呋喃類物質和3種吡咯衍生物下調，而其他新植二烯、植物呋喃和吡咯衍生物等代謝產物未發現下調。此外，“青斑”部位葉綠素含量是正常部位的3.57倍。因此，結合2組處理的代謝組學差異及葉綠素含量等方面的對比分析結果，推測雪茄煙葉片在晾制期間，葉綠素分解不完全是“青斑”產生的主要原因。

圖7 雪茄煙葉中類黃酮生物合成通路Fig.7 Pathway map of flavonoid biosynthesis in cigar tobacco

本研究發現“青斑”與正常部位類黃酮生物合成途徑為差異途徑且該途徑富集到了化學標記物——綠原酸(表3)，綠原酸是煙草中主要的酚類化合物，占總多酚的75%～90%[13]，在晾制過程中會通過酶促棕色化反應形成醌類等棕色色素使煙葉顏色轉深[14]，基于代謝組學分析發現“青斑”部位綠原酸含量顯著高于正常部位，“青斑”部位大量綠原酸未發生酶促棕色化反應，未被氧化成棕色色素，這可能也是“青斑”形成的原因之一。其余4種代謝物兒茶素、表沒食子兒茶素、5-O-咖啡酰莽草酸和山奈酚均為下調代謝物，參與調控煙葉黃酮醇合成和花青素代謝(圖7)，有研究表明，類黃酮中的山奈酚及其糖苷和花青素可以調控黃色形成[15-16]，這些代謝物在正常部位含量顯著高于“青斑”部位，可能與正常部位煙葉變黃有關。

3.2 雪茄煙葉晾制期間“青斑”產生的環境因素

濕度是影響雪茄煙葉葉綠素降解的一個關鍵因素，同時水分又是許多代謝過程的重要原料。結合溫濕度記錄圖(圖1)可以看出，在晾制第4天至第14天期間晾房濕度較低、波動較大，該時段對應雪茄煙葉晾制的變色期，是煙葉色素降解的關鍵時期，有80%以上的葉綠素被降解[1]。戴培剛等[17]研究表明，煙葉失水過快容易形成青煙。本研究中，變黃期濕度僅有70%左右，遠低于正常濕度(80%～85%)，導致細胞快速失水死亡、大量葉綠素無法降解。殘留的葉綠素在晾制過程中沉積，可能是“青斑”產生的環境因素，建議采用濕度可控晾房晾制，適當提高變黃期濕度。

3.3 關于“青斑”形成過程的化學標記物

在雪茄煙葉晾制過程中綠原酸含量在變黃初期較高，隨晾制時間延長而不斷降低[18]。本研究發現晾制末期“青斑”部位綠原酸含量仍較高，說明在變黃期時“青斑”部位葉片細胞代謝緩慢或已死亡，導致大量綠原酸無法分解，最終在“青斑”部位顯著富集。盧紹浩等[19]研究表明，綠原酸含量高低與色素含量存在一定正相關性。內源性化學標記物是差異研究中用來區分彼此的特征物質，經大量研究目前已形成了系統的代謝組學策略來尋找植物中的內源性化學標記物，并成功應用于甘藍[20]、青花椒[21]等作物的差異研究。本研究應用上述方法篩選化學標記物，發現綠原酸在上調代謝物中VIP值及FC值排名分別是第一和第二。因此，綠原酸可以作為“青斑”形成過程的標記物質。

二氫玉米素是兩組織部位差異倍數最大的物質，差異倍數為29.12，其化學結構和生理活性與玉米素相似，二者都是植物體內主要的游離細胞分裂素，具有促進細胞分裂和代謝、保持細胞活力的作用[22]。正常部位二氫玉米素含量高，細胞代謝旺盛，有利于葉綠素分解，“青斑”部位二氫玉米素含量較低，細胞代謝活動較弱，葉綠素降解緩慢，二氫玉米素可作為區別“青斑”與正常部位的標記物質。結合綠原酸的分析，在雪茄煙葉晾制變色期監測綠原酸和二氫玉米素的含量變化，可作為預判葉片是否會產生“青斑”的有效手段，對茄衣煙葉而言具有重要的理論價值和生產意義。

綜上，雪茄煙葉在晾制過程中葉綠素降解不完全，大量的綠原酸未被氧化成深色色素，因此，推測殘留的葉綠素和綠原酸在晾制末期沉積是晾制煙葉“青斑”產生的生理機制。在雪茄煙葉晾制變色期監測綠原酸和二氫玉米素的含量變化，可作為預判葉片是否會產生“青斑”的有效手段之一。