分泌anti-PD-L1及IFNα的間充質干細胞聯合治療小鼠黑色素瘤①

林 浩 李 民 韓 萍 楊選明 （上海交通大學生命科學技術學院，上海 200240）

腫瘤及其周圍的免疫細胞、免疫分子、細胞外基質、血管和淋巴網絡等共同組成了免疫抑制性的腫瘤微環境，促進腫瘤的生長和轉移，抑制抗腫瘤免疫細胞如T細胞和NK細胞的活化和效應功能，誘導腫瘤免疫抑制細胞如調節性T 細胞、腫瘤相關巨噬細胞、髓系來源的抑制細胞等，幫助腫瘤細胞逃避免疫監視［1-2］。因此，調節腫瘤微環境，改變其免疫抑制性是提高腫瘤治療效果的關鍵之一［3-4］。

近年來，以免疫檢查點治療為代表的腫瘤免疫治療在臨床上取得巨大突破，但臨床上僅有部分患者對免疫治療有較好的響應，仍然許多患者對免疫治療不響應或在初始響應后發生耐受性，因此，關于免疫檢查點阻斷治療方案仍需繼續改善［5-7］。PD-L1是細胞程序性死亡蛋白（programmed death-1，PD-1）的兩個配體之一，廣泛表達于造血與非造血干細胞，腫瘤細胞和腫瘤基質都能表達PD-L1，PD-1/PD-L1 是最知名的免疫檢查點通路之一，在腫瘤環境中，PD-1和PD-L1 的結合可傳遞T 細胞負向調控信號，從而削弱T 細胞的抗腫瘤功能，anti-PD-L1 抗體可阻斷PD-1和PD-L1的結合，解除T細胞的抑制信號，恢復T 細胞活化和效應功能，達到治療腫瘤的效果［8-9］。PD-1/PD-L1 信號通路阻斷抗體對多種腫瘤有治療效果，但也有相當一部分患者對PD-1/PD-L1 抗體治療缺乏響應，其中的原因與機制目前尚無定論，腫瘤組織缺乏足夠的淋巴細胞浸潤，腫瘤突變負荷較低，腫瘤微環境內PD-1/PD-L1表達水平低以及多種免疫抑制性細胞的作用均可能導致治療效果不佳［10-13］。

IFNα是Ⅰ型干擾素家族成員，是最早被用于臨床治療的干擾素，也是目前臨床上腫瘤免疫治療最常用的細胞因子之一［14］。研究表明，IFNα可誘導腫瘤表面MHCⅠ分子表達，促進樹突狀細胞活化，其還可活化效應T 細胞、B 細胞、NK 細胞、巨噬細胞，誘導腫瘤細胞凋亡［15］。IFNα 通過調控淋巴細胞活性以及對腫瘤的浸潤，可以調節免疫抑制性的腫瘤微環境，此外，IFNα 還可直接抑制腫瘤細胞增殖和血管生成，協同作用達到抗腫瘤的效果。然而，IFNα 高劑量及毒副作用是制約其臨床應用的主要原因［16-18］。

間充質干細胞（mesenchymal stem cells，MSC）是一類多能干細胞，可以從骨髓、脂肪組織、胎盤、臍帶等多種組織中分離出來，由于其易分離、易培養擴增、免疫原性低等特點在臨床上有廣泛用途［19-20］。既往研究表明MSC 存在特殊的歸巢機制，外源性的MSC 具有向體內受損的組織、炎癥部位以及腫瘤組織遷移的能力，因此MSC 可作為抗腫瘤藥物的載體用于腫瘤治療［21-22］。本研究以MSC 為載體，分別構建了能分泌 anti-PD-L1 蛋白和 IFNα4 蛋白的 MSC 細胞系，利用MSC 的歸巢特性，聯合腫瘤免疫檢查點阻斷抗體和細胞因子兩種免疫治療方法，靶向調控腫瘤微環境，從而提高治療腫瘤的效果。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 實驗均采用雌性6～8周齡小鼠。C57BL/6 小鼠［體質量（17.0±1.1）g］購自北京維通利華實驗動物技術有限公司。OT-Ⅰ轉基因小鼠［體質量（17.8±0.5）g］購自美國 Jackson 實驗室。NDG免疫缺陷小鼠［體質量（20.2±1.4）g］購自百奧賽圖基因生物技術有限公司。小鼠的繁殖、飼養及實驗均在恒溫（20～26℃）、恒濕（50%～56%）的SPF級動物房進行。動物的培育和使用符合國際實驗動物使用準則及上海交通大學實驗動物倫理與使用委員會規則。

1.1.2 細胞與試劑 Lenti-293X 細胞購自美國Clontech 公司；MSC 細胞由上海隆耀生物科技有限公司饋贈；B16-OVA 細胞由美國芝加哥大學Hans Schreiber饋贈。表達質粒pCDH-EF1-MCS購自美國System Biosciences 公司；DMEM、α-MEM、RPMI 等液體培養基和雙抗購自Hyclone 公司；胎牛血清購自美國Gibco 公司；分子克隆所用酶購自美國NEB 公司；CCK-8 溶液購自日本同仁公司；WB（Western blot）實驗所用抗體購自美國 Sigma 公司；qPCR 實驗所用試劑購自南京諾唯贊生物科技公司。

1.2 方法

1.2.1 細胞系的構建和培養 將anti-PD-L1（或IFNα4）及hFc 序列克隆到改造后的表達質粒pCDH-EF1-MCS-puro 上 ，構 建 出 pCDH-EF1-anti-PD-L1-Fc 及 pCDH-EF1-IFNα4-Fc 重組質粒并分別生產慢病毒，利用慢病毒感染MSC 細胞，通過puromycin 篩 選 后 獲 得 MSC-anti-PD-L1-Fc 和 MSCIFNα4-Fc 兩種細胞系。本實驗所用的MSC 細胞均在37℃、5%CO2條件下培養，所用培養基為含15%胎牛血清、2 mmol/L L-谷氨酰胺、100 U/ml 青霉素和100 μg/ml鏈霉素的α-MEM細胞培養基。

1.2.2 細胞系的鑒定與表征 37℃恒溫培養MSC、MSC-anti-PD-L1-Fc、MSC-IFNα4-Fc 3 種細胞，換液后24 h 收集上清，通過ELISA 實驗檢測Fc 融合蛋白含量；利用Protein A Beads富集3種細胞上清中的Fc蛋白并使用WB 進行檢測，分析Fc融合蛋白對應條帶。收集MSC-anti-PD-L1-Fc 的上清作為一抗，與表達PD-L1 的黑色素瘤B16-OVA 細胞共同孵育，流式檢測B16-OVA 細胞表面PD-L1 的表達水平。收集MSC-IFNα4-Fc 細胞上清與B16-OVA 細胞共同孵育，利用流式細胞術檢測B16-OVA細胞表面PD-L1和MHCⅠ分子表達水平。

1.2.3 細胞增殖-毒性實驗 100 μl的 B16-OVA 細胞懸液置于96 孔板，每孔1×104個細胞。將培養板在37℃恒溫培養箱預培養24 h，向培養板中加入等體積的MSC 細胞培養上清液和對照培養基，孵育24 h 后每孔加入10 μl CCK-8 溶液，搖床內孵育2 h后，酶標儀測定其在450 nm處的吸光值。

1.2.4 OT-Ⅰ-T 細胞殺傷實驗 取OT-Ⅰ小鼠的脾臟，研磨后用紅細胞裂解液1×ACK 裂解，中和后離心獲得包含T 淋巴細胞的脾臟細胞，培養于含10%胎牛血清的RPMI 培養基中，將脾臟細胞、B16-OVA細胞及MSC 細胞系上清液加入96 孔板中共培養，48 h 后對B16-OVA 細胞計數并收集上清液，利用CBA檢測上清液中IFN-γ的表達水平。

1.2.5 小鼠腫瘤生長與測量 取6～8周齡的小鼠，在其背部右側皮下注射約7.5×105個B16-OVA 細胞，1 周后測量小鼠腫瘤體積［長（mm）×寬（mm）×高（mm）/2］，并使用構建的MSC 細胞系在腫瘤所在位置皮下治療，每周2次測量腫瘤體積。

1.2.6 MSC 細胞體內存續分析 對治療后的C57BL/6 小鼠進行周期性靜脈取血，ELISA 檢測分析血液內Fc濃度。取約8周齡的NDG 小鼠，皮下接種7.5×105個B16-OVA細胞，1周后靜脈注射1×106個MSC 細胞，取不同時間點的小鼠腫瘤組織并提取全基因組DNA，利用qPCR檢測MSC細胞的DNA。

1.2.7 小鼠腫瘤微環境分析 利用MSC 細胞系治療荷瘤小鼠7 d 后，稱取約150 mg 腫瘤組織，盡可能剪碎后，利用含10%Liberase L、8%DnaseI和1%雙抗的RPMI 培養基作為消化液擠壓、研磨、消化，37℃搖床孵育約15 min 后利用EDTA 溶液和血清中和消化液，移液槍吹勻后轉移至70 μm的濾膜過濾，利用含10%FBS的RPMI培養基沖洗，獲得細胞懸液后離心并棄去上清，重懸細胞于PBS 緩沖液。加入不同的單克隆抗體組合于4℃孵育，流式分析腫瘤微環境中各類群免疫細胞。

1.3 統計學處理 兩組間數據比較使用非成對雙尾T檢驗，多組間數據比較使用單因素方差分析。誤差條代表標準差或標準誤。（統計學差異的意義用P表示，差異無統計學意義、P＜0.05、P＜0.01 和P＜0.001分別以ns、*、**和***表示）。

2 結果

2.1 MSC 細胞系的構建與鑒定 ELISA 檢測結果顯示 MSC-anti-PD-L1-Fc 和 MSC-IFNα4-Fc 兩種細胞系的上清中都有Fc 蛋白的表達（圖1A），WB 檢測結果與ELISA 結果相符（圖1B）。流式分析可檢測到與MSC-anti-PD-L1-Fc 的上清共同孵育的B16-OVA細胞表面PD-L1 的表達（圖1C）。以上結果證明構建的兩種MSC 細胞系都能在體外分泌Fc 蛋白，MSC-anti-PD-L1-Fc 細胞系分泌的上清具有anti-PDL1抗體功能。

圖1 改造分泌免疫調節分子的MSCs細胞系Fig.1 Engineering MSCs to secret anti-PD-L1-Fc and IFNα4-Fc

2.2 MSC 細胞系的體外功能驗證 CCK-8 實驗結果顯示，相比對照組，加入MSC-IFNα4-Fc細胞上清的B16-OVA細胞生長受到顯著抑制（P＜0.001，圖2A）。流式實驗結果顯示相比對照組，MSC-IFNα4-Fc細胞上清液可顯著提升B16-OVA 細胞表面的PD-L1 及MHCⅠ的表達水平（圖2B、C，P＜0.001）。

OT-Ⅰ-T 細胞殺傷實驗結果顯示，無論是MSC-anti-PD-L1-Fc 細胞上清還是 MSC-IFNα4-Fc 細胞上清，都能顯著增強OT-Ⅰ小鼠T 細胞對黑色素瘤細胞的殺傷能力，相比之下，MSC-IFNα4-Fc 細胞上清對OT-Ⅰ小鼠T 細胞的殺傷能力提升比MSC-anti-PD-L1-Fc 細胞上清更強（圖2D），原因可能是IFNα4不僅能活化OT-Ⅰ小鼠T 細胞，還對B16-OVA 細胞的生長有直接抑制作用。OT-Ⅰ小鼠T 細胞與B16-OVA 細胞共培養上清流式檢測結果表明，MSC-anti-PD-L1-Fc 和 MSC-IFNα4-Fc 細胞上清都能促使 T 細胞IFN-γ表達水平顯著提高（P＜0.001，圖2E）。

圖2 MSC細胞系分泌免疫調控蛋白的體外功能研究Fig.2 Functional characterization of MSC-secreted IFNα4-Fc and anti-PD-L1-Fc in vitro

以上實驗表明MSC-anti-PD-L1-Fc和MSC-IFNα4-Fc 兩種細胞系在體外情況下可分泌有功能活性的an-PD-L1-Fc 和 IFNα4-Fc 蛋白，并且都能在體外刺激T 細胞活化，提升對小鼠黑色素瘤的殺傷能力，IFNα4-Fc 蛋白還能直接作用于黑色素瘤細胞，抑制腫瘤細胞生長。

2.3 MSC 細胞系的體內藥效及分布 對治療后的小鼠靜脈取血，ELISA 檢測分析血液內Fc 濃度，結果顯示治療后第3 天所有小鼠血液均檢測到Fc，第8天時大部分小鼠血液內依然存在一定濃度的Fc（圖3A），證明該治療在小鼠體內有較好的持續性。

圖3 MSCs細胞在體內的藥效及分布Fig.3 In vivo duration of PD-L1-Fc and IFNα4-Fc secreted from MSCs

在NDG 小鼠B16-OVA 腫瘤模型中，利用qPCR檢測是否存在MSC 細胞，結果顯示在MSC 細胞治療后的10 d 內，小鼠腫瘤組織中可檢測到MSC 細胞（圖3B），說明本研究中使用的MSC細胞具有向炎癥性腫瘤環境遷移并在腫瘤內長期存續的能力。

2.4 MSC 細胞系的體內抗腫瘤活性研究 在C57BL/6 小鼠體內構建B16-OVA 腫瘤模型研究MSC-anti-PD-L1-Fc 和 MSC-IFNα4-Fc 在體內的抗腫瘤功能，實驗結果顯示MSC-anti-PD-L1-Fc 和MSCIFNα4-Fc 的聯合治療可顯著抑制腫瘤的生長（P＜0.001，圖4A），相比于單獨的MSC-anti-PD-L1-Fc 或MSC-IFNα4-Fc治療，聯合治療對腫瘤生長抑制作用更加明顯（P＜0.05），相比對照組，接受MSC-anti-PDL1-Fc 或MSC-IFNα4-Fc 治療的小鼠生存時間均顯著延長（P＜0.05），聯合治療組的效果更為顯著（P＜0.01，圖4B）。流式分析小鼠腫瘤微環境中CD4+T細胞和CD8+T 細胞的比例，結果顯示MSC 聯合治療可顯著提升CD4+T 細胞和CD8+T 細胞浸潤，單獨治療可以提升CD8+T 細胞浸潤，但對CD4+T 細胞浸潤提升不明顯（圖4C、D），由此推測MSC 聯合治療主要依賴CD8+T 細胞發揮抗腫瘤功能，聯合治療中anti-PD-L1和IFNα4具有協同作用，提升CD4+T細胞的浸潤，因此能進一步提高治療腫瘤的效果。

圖4 MSC細胞系的體內抗腫瘤活性研究Fig.4 Anti-tumor activity of MSC-anti-PD-L1-Fc and MSC-IFNα4-Fc in vivo

3 討論

隨著對腫瘤研究的不斷深入，研究者們意識到腫瘤的形成是一個動態的過程，在腫瘤發生發展的過程中，腫瘤細胞從被免疫系統識別監控，被清除或抑制，到和免疫系統彼此共存并持續對抗，最終發展成腫瘤細胞逃避免疫監控，迅速增殖并開始向周邊組織侵襲和轉移［23-24］。腫瘤免疫治療是當下的研究熱點，其通過活化機體免疫系統，恢復被抑制的抗腫瘤免疫反應達到治療腫瘤的效果，理論上其相比于傳統的化療等治療方式具有更好的靶向性和更低的副作用［25-27］。目前，以 PD-1/PD-L1 免疫阻斷和CAR-T 細胞療法為代表的免疫治療在多種腫瘤中都顯示了長期、顯著的療效，但這種良好的治療效果往往只限于部分患者，大部分患者往往對免疫治療響應不足甚至不響應，造成這一情況的機制目前尚在研究之中。腫瘤免疫治療起效需要免疫細胞對腫瘤細胞的特異性識別，效應細胞的足量增殖及活化免疫細胞可對腫瘤組織的充分浸潤［2］。腫瘤細胞通過免疫抑制的腫瘤微環境介導免疫逃逸和免疫耐受，改變抑制性的腫瘤微環境是恢復免疫系統抗腫瘤功能，提高免疫治療效果的關鍵之一［3］。本研究利用改造的MSC 從免疫檢查點阻斷和細胞因子兩個方面調節腫瘤微環境并活化免疫細胞，從而提高腫瘤治療效果。

PD-1/PD-L1 通路抑制是目前臨床上最常用的免疫檢查點抑制之一，臨床上只有一部分腫瘤患者響應PD-1/PD-L1 抗體治療，有效的PD-L1 抗體治療不僅需要腫瘤微環境中存在足夠的PD-L1 抗體，而且需要足夠的淋巴細胞浸潤腫瘤組織［28］。IFNα 是臨床上免疫治療中常用的細胞因子，具有活化免疫細胞，調控腫瘤環境、抑制腫瘤細胞生長的功能，但其在體內半衰期較短，缺乏對腫瘤組織的靶向性，劑量過高時也會產生較強的毒副作用。本研究利用MSC 細胞聯合PD-L1 抗體和IFNα 兩種免疫治療手段，綜合二者的優勢改善抑制性的腫瘤微環境，協同治療腫瘤。MSC 細胞由于其低免疫原性和向腫瘤組織遷移的能力，是理想的腫瘤靶向治療載體，課題組在基因水平改造MSC 細胞，使其具備分泌anti-PD-L1-Fc 和IFNα4-Fc 蛋白的能力。有研究表明，MSC 細胞具有免疫抑制和促進腫瘤生長功能，具體通過 IDO、iNOS 等機制實現，IDO 是一種具有免疫調節能力的酶，可分解色氨酸，并能通過代謝通路生成犬尿氨酸，色氨酸是T 細胞活化的必需氨基酸，而犬尿氨酸則對T細胞活化有抑制作用，人源的MSC 細胞能表達IDO 進而產生免疫抑制性［29-32］，因此將MSC 用于腫瘤治療可能會增強免疫抑制，影響治療效果。本實驗使用MSC 細胞取得了顯著的抗腫瘤效果，一方面可能是因為本實驗使用了IFNα-Fc 蛋白，研究顯示干擾素蛋白轉染后的MSC 細胞免疫抑制效果會減弱，免疫反應會由促腫瘤向抗腫瘤轉變［33］；另一方面，已有大量研究表明MSC 作為載體攜帶藥效分子的抗腫瘤治療具有可行性，這些藥效分子通常有較強的治療效果，相比之下MSC 自身潛在的促腫瘤效果可能會被覆蓋［34-36］。在本研究中，anti-PD-L1-Fc 和 IFNα4-Fc 兩種蛋白在腫瘤微環境中高表達，在腫瘤微環境的免疫調節中占主導地位，這種情況下，MSC 自身的免疫抑制作用可能比較有限；此外，本研究使用的MSC 細胞來源為臍帶，相比其他MSC，臍帶來源的MSC免疫抑制能力更弱，適用于腫瘤治療［37］。

在體內和體外實驗中，改造后的MSC 細胞都顯示了抗腫瘤功能。在小鼠腫瘤模型中，MSC-anti-PD-L1-Fc 和MSC-IFNα4-Fc 兩種細胞的聯合治療改善了腫瘤微環境，增加CD4+T 細胞和CD8+T 細胞的浸潤，延長了小鼠的生存時間，相比單獨治療，聯合治療對腫瘤生長的抑制更加明顯。聯合治療可綜合兩種治療方法的優勢，彌補單獨治療的局限性，腫瘤微環境中IFNα 的免疫調控能力可增加淋巴細胞對腫瘤的浸潤，提升PD-L1 抗體的功能。IFNα 和anti-PD-L1共同作用，提升了對T淋巴細胞的活化能力。腫瘤環境中IFNα 會導致PD-L1 分子表達水平上調，在聯合治療中，PD-L1分子表達水平上調可能導致了MSC 分泌的anti-PD-L1-Fc 蛋白在腫瘤微環境中富集，提升了靶向抗腫瘤能力。MSC 細胞向腫瘤組織的歸巢能力可確保anti-PD-L1-Fc和IFNα4-Fc蛋白能靶向進入腫瘤微環境發揮功能，降低毒副作用。通過MSC 細胞持續表達兩種蛋白可以延長治療持續時間，本實驗中，經檢測大部分小鼠血清中的重組蛋白可以存在超過1 周，相比傳統細胞因子直接注射治療，MSC 細胞治療的方式藥效時間更長。

綜上所述，本實驗以MSC 細胞為載體，通過基因改造方式分別構建了能表達anti-PD-L1-Fc 和IFNα4-Fc的MSC 細胞系，通過聯合免疫檢查點阻斷治療和細胞因子治療兩種免疫治療方法調控腫瘤微環境，提升了對腫瘤的治療效果。anti-PD-L1-Fc和IFNα4-Fc二者聯合治療可以綜合雙方的優勢，并在一定程度上彌補單獨治療的局限性。本實驗結果證明利用MSC 細胞作為載體的聯合免疫治療方式是可行的思路，并有望成為未來臨床上提高腫瘤免疫治療效果的新策略。