lncRNA TUG1靶向TGF-β/Samds信號通路促人牙周膜成纖維細胞纖維化的作用機制研究

孫海濤 高 濤 馮小東 （首都醫科大學附屬北京世紀壇醫院，北京 100038）

人牙周膜成纖維細胞（human periodontal ligament fibroblasts，HPLDFs）位于牙周膜組織膠原纖維中的間質細胞，在牙周組織的發育、損傷修復等過程中發揮關鍵調節作用［1］。正常生理狀態下，HPLDFs 可促進合成和降解膠原，分泌多種細胞活性因子、刺激成骨細胞和破骨細胞以完成牙周組織的修復與再生，并促進牙槽骨及牙本質膠原不斷更新和重塑以維持牙槽骨的穩態［2-3］。受外界刺激時，HPLDFs 的生物學活性異?；罨?，激活并促進牙周組織損傷，最終引起牙周結締組織纖維化及牙槽骨病變［4］。目前，體外分離培養HPLDFs是研究牙周膜組織疾病的重要手段之一。

長鏈非編碼RNA（long non-coding RNA，lncRNA）是一類長度超過200 nt 的非編碼RNA［5］。最新測序研究表明，lncRNAs 參與細胞的發育分化、增殖、遷移及凋亡等生物功能［6］。多項研究表明，某些lncRNAs 通過表觀遺傳、轉錄前后等方式調控成纖維細胞的增殖、遷移和活化，從而參與多種疾病的發生發展［7-8］。MITCHELL等［9］證實lncRNA MALAT1可參與內調控皮細胞功能和血管生長。lncRNA MALAT1 下調可抑制糖尿病大鼠心肌細胞凋亡，減弱左室功能，抑制視網膜內皮細胞的增殖和遷移，從而減弱視網膜血管損傷的炎癥反應［10］。TAO等［11］研究發現，下調lncRNA H19可抑制心臟成纖維細胞增殖，可能與導致DUSP5/ERK1/2 軸相關的部分基因異常表達以及引起細胞周期相關的基因表達上調有關。已有研究證明，過表達lncRNA TUG1與食管鱗狀細胞癌的腫瘤分型和分期密切相關［12］。上調lncRNA TUG1 表達可促進骨肉瘤細胞和膀胱癌細胞的增殖［13-14］。因此，lncRNA TUG1 在發育和功能維持方面有重要作用，其表達失調會導致多種疾病。但lncRNA TUG1在HPLDFs 中參與調控牙周組織功能的作用及機制未見報道。

本實驗通過研究高表達lncRNA TUG1 對HPLDFs 增殖、遷移及膠原合蛋白成的影響，進一步檢測其對TGF-β1/Smads 信號通路蛋白表達影響以探討相關的分子機制，為lncRNA 調控牙周組織病變、修復及再生過程提供新思路，為進一步治療牙周病提供理論依據。

1 資料與方法

1.1 資料

1.1.1 標本來源 健康志愿者（12～20 歲）前磨牙或智齒，取自首都醫科大學附屬北京世紀壇醫院、北京積水潭醫院及首都醫科大學附屬北京同仁醫院口腔科正畸拔除的牙齒，均無齲壞、牙周炎及根尖周疾病等，患者及其家屬均知情同意。本研究經首都醫科大學附屬北京世紀壇醫院倫理委員會批準。

1.1.2 主要試劑 DMEM 培養基及胎牛血清購自美國Life 公司；波形絲蛋白及角蛋白抗體購自Abcam 公司；t-Smad3、p-Smad3 及 TGF-β1 抗體購自Cell Signaling Technology 公 司 ；GAPDH 抗 體 購 自Proteintech 公司；青霉素、鏈霉素和Ⅰ型膠原酶購自美國Invitrogen 公司；DAPI 染色液購自碧云天生物技術公司；TRIzol 試劑購自美國Thermo Scientific公司；逆轉錄試劑盒、RT-PCR 試劑盒購自日本TaKaRa 公司；所有PCR 引物均由生工生物公司提供；lncRNA TUG1 過表達慢病毒由上海吉瑪制藥技術有限公司構建；CCK-8 試劑盒購自日本同仁化學研究所。

1.1.3 主要儀器 ABI 7500 實時定量PCR 儀購自Applied Biosystems 公司；微量移液器購自Eppendorf公司；生物安全柜購自Heal Force 公司；多功能酶標儀購自 Thermo Scientific 公司；SynergyTM2 酶標儀購自美國Bio-Tek公司。

1.2 方法

1.2.1 HPDLCs 的分離培養及鑒定 HPDLCs 采用組織貼壁消化法分離而得。拔取新鮮牙齒標本后迅速置于含雙抗預冷的PBS 中，清洗去除血污。將牙齒標本立即轉移至實驗室超凈工作臺，于無菌條件下刮除牙根上1/3 牙周膜組織。將牙周膜組織置于無菌離心管，1 200 r/min 離心5 min。棄上清液，加入0.5%Ⅰ型膠原酶500 μl，置于37℃恒溫搖床，20～30 min 后加入 500 μl DMEM 完全培養基中和，1 200 r/min 離心5 min。棄上清液，挑取細胞沉淀分別鋪于培養皿中，加入少量培養基，微微傾斜置于37℃恒溫CO2培養箱中。30 min 后緩慢放平培養皿，繼續培養1 周。待細胞長滿后使用0.25%胰酶37℃消化3 min，加入完全培養基中和，按1∶3 比例傳代。收集第3代細胞培養至細胞融合達60%后進行后續實驗。

1.2.2 HPDLCs 的鑒定 采用免疫細胞化學染色方法鑒定HPDLCs標志物。使用0.25%胰酶消化并收集第 3 代細胞，以 1×105個/ml 接種于培養小室，孵育培養過夜。4%多聚甲醛固定10 min，PBS 清洗3次，每次5 min。加入含 0.5%Triton 的 5%BSA 進行細胞穿孔及抗原封閉，室溫靜置40 min。加入100 μl一抗（波形蛋白 Vimentin，1∶200；角蛋白 Keratin，1∶200），4℃ 孵育過夜，同時以PBS 代替抗體作為陰性對照。PBS 清洗 3 次，每次 5 min。加入 100 μl 二抗，室溫孵育45 min，PBS 清洗，梯度乙醇脫水封片。光學顯微鏡下觀察并拍照。

1.2.3 重組lncRNA TUG1 慢病毒感染構建過表達HPDLCs［15］取第 3 代生長對數期的 HPDLCs 接種于6 孔板，細胞分為過表達lncRNA TUG1 慢病毒組（Lv-lncRNA TUG1）、慢病毒空載體組（Lv-NC）和空白對照組（Ctrl）。過表達lncRNA TUG1 慢病毒組、慢病毒空載體組分別加入Lv-lncRNA TUG1、Lv-NC對照空白質粒病毒和培養基轉染HPDLCs，空白組不做處理，置于37℃恒溫培養箱。培養24 h后，吸棄含病毒培養基，更換2 ml 10%FBS 完全培養基，37℃繼續培養；病毒感染72 h后，消化細胞行后續處理。

1.2.4 RT-PCR 檢測 各組細胞轉染72 h 收獲各組細胞 HPDLFs，置于 1.5 ml 無酶 EP 管，1 000 r/min離心5 min；棄上清液，每管加入1 ml Trizol，置于冰上充分裂解后，加200 μl氯仿，室溫靜置5 min；4℃、12 000 r/min 離心 5 min。取 500 μl 上清液，加入等量異丙醇混勻，-20℃ 靜置30 min；4℃、12 000 r/min離心30 min后，可見白色沉淀，棄上清液；加入200 μl 75%乙醇，4℃、12 000 r/min離心5 min；棄上清，室溫干燥5～10 min；加入20 μl DEPC 充分溶解。采用全自動酶標儀測定總RNA 純度，控制A260/A280在1.9～2.1，RNA 電泳檢測其完整性。檢測濃度及純度后取2 μg 總RNA 應用逆轉錄試劑盒合成第一鏈cDNA。逆轉錄條件如下：37℃反應15 min，85℃反應5 s。將逆轉錄所得cDNA 純化后應用ABI 7500實時定量PCR 儀進行PCR 擴增。反應總體積為20 μl∶1.5 μl cDNA 模板，1 μl 引物，10 μl SYBR?Premix Ex TaqTMⅡ，7.5 μl H2O。PCR 反應條件為：95℃ 預變性30 s，擴增循環95℃ 5 s，60℃ 34 s，共40個循環。以 GAPDH 為參照，采用 2-ΔΔCt法計算 lncRNA TUG1 mRNA 的相對定量表達量；以 TGF-β1 為參照，采用2-ΔΔCt法計算COLⅠ、COLⅢ和COLⅣ mRNA的相對定量表達量。相關引物序列見表1。

表1 相關引物序列Tab.1 Relevant primer sequences

1.2.5 CCK-8 檢測細胞增殖 過表達lncRNA 組、空白質粒病毒處理組和空白對照組細胞轉染72 h收獲各組細胞HPDLFs，分別接種于96孔板，接種密度 3 000 個/孔，37℃ 培養過夜。在 0 h 和 24 h 將10 μl/孔 CCK-8 試劑加入各孔細胞，37℃ 培養 1 h 后測定450 nm處吸光度值。

1.2.6 劃痕實驗檢測細胞遷移 過表達lncRNA組、空白質粒病毒處理組和空白對照組細胞轉染72 h收獲各組細胞HPDLFs，分別接種于6 孔板，細胞單層融合80%～90%時，換成2%胎牛血清的DMEM 培養基。用200 μl 槍頭在各組細胞中垂直劃線，無菌PBS 清洗 1 遍，換成 2%FBS 培養基，培養 24 h，在倒置顯微鏡下觀察并拍照。同時，對細胞劃痕進行成像和測量，用虛線區域測量細胞遷移面積。

1.2.7 Western blot 檢測蛋白表達水平 各組細胞轉染72 h 收獲各組細胞HPDLFs，用RIPA 裂解液提取各組細胞總蛋白。將提取的蛋白樣本與含SDS的loading 緩沖液混合，通過10%SDS-PAGE 膠進行蛋白分離，濕法轉移至PVDF膜，5%BSA溶液室溫封閉1 h。按照抗體說明書稀釋一抗（GAPDH，1∶1 000；t-Smad3、p-Smad3、TGF-β1，1∶1 000），4℃ 孵育過夜。用TBST 清洗3 次，加入二抗，室溫下孵育1 h。采用ECL化學發光系統檢測信號并拍照分析。

1.3 統計學分析 采用GraphPad Prism 8.0 統計學軟件進行統計分析。計量資料以表示，組間比較采用t檢驗，多組比較采用單因素方差One Way ANOVA分析。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 HPDLFs 鑒定 HPDLFs 培養 1 周后可見大量集落生長的細胞，呈紡錘形，有多個突起（圖1A）。傳代培養至P3 代，細胞形態均勻飽滿，提示可能分離培養得到HPDLCs。采用免疫細胞化學染色對細胞免疫表型進行鑒定（圖1B、C），與陰性對照組相比，波形蛋白Vimentin 呈陽性，角蛋白Keratin 呈陰性；陰性對照組均未見陽性染色結果（圖1D、E）。表明提取的原代HPDLCs 純度較高，無雜細胞，可用于后續體內外實驗。

圖1 代表性HPDLFs特性Fig.1 Characteristics of representative HPDLFs

2.2 重組慢病毒感染HPDLFs 中lncRNA TUG1 的表達水平 過表達lncRNA TUG1 慢病毒組（LvlncRNA TUG1）HPDLFs 細胞 lncRNA TUG1 表達水平較空白對照組（Ctrl）或空白質粒病毒處理組（Lv-NC）顯著增加（P＜0.01），而Ctrl 組或Lv-NC 組HPDLFs 細胞lncRNA TUG1 表達水平差異無統計學意義（P＞0.05），見圖2。

圖2 3組HPDLFs細胞中lncRNA TUG1表達比較Fig.2 Comparison of lncRNA TUG1 expression in HPDLFs of 3 groups

2.3 過表達lncRNA TUG1 對HPDLFs 增殖的影響 Lv-lncRNA TUG1 組HPDLFs 細胞吸光度值在培養12 h、24 h和48 h時均較Ctrl組或Lv-NC組顯著增加（P＜0.05 或P＜0.01），而 Ctrl 組或 Lv-NC 組HPDLFs細胞吸光度值在培養12 h、24 h和48 h時差異無統計學意義（P＞0.05），見圖3。

圖3 不同培養時間點3組HPDLFs細胞增殖能力的比較Fig.3 Comparison of HPDLFs cell proliferation for different incubation time in 3 groups

2.4 過表達lncRNA TUG1 對HPDLFs 遷移的影響 Lv-lncRNA TUG1 組HPDLFs 細胞劃痕面積均較 Ctrl 組或 Lv-NC 組顯著減少（P＜0.01），而 Ctrl 組或Lv-NC 組HPDLFs 細胞劃痕面積差異無統計學意義（P＞0.05），見圖4。

圖4 3 組HPDLFs 細胞遷移情況（A）和細胞劃痕面積（B）比較Fig.4 Comparison of HPDLFs cell migration condition（A）and cell healing area（B）in 3 groups

2.5 lncRNA TUG1 對 HPDLFs 纖維鈣化的影響Lv-lncRNA TUG1 組 HPDLFs 細胞中 COLⅠ、COLⅢ、COLⅣ及MMP-2 mRNA表達水平均較Ctrl組或Lv-NC組顯著增加（P＜0.05 或P＜0.01），而Ctrl 組或Lv-NC組 HPDLFs 細胞中 COLⅠ、COLⅢ、COLⅣ及 MMP-2 mRNA表達水平差異無統計學意義（P＞0.05），見圖5。

圖5 3組HPDLFs細胞中COLⅠ、COLⅢ、COLⅣ及MMP-2相對表達量比較Fig.5 Comparison of relative expressions of COLⅠ，COLⅢ，COLⅣand MMP-2 in HPDLFs of 3 groups

2.6 lncRNA TUG1 在HPDLFs 細胞表型轉化中的分子機制研究 Lv-lncRNA TUG1 組HPDLFs 細胞中 TGF-β1 蛋白表達水平均較 Ctrl 組或 Lv-NC 組顯著增加（P＜0.05 或P＜0.01），而 Ctrl 組或 Lv-NC 組HPDLFs 細胞中TGF-β1 蛋白表達水平差異無統計學意義（P＞0.05），見圖 6A。Lv-lncRNA TUG1 組HPDLFs 細胞中p-Smad3 蛋白表達水平均較Ctrl 組或 Lv-NC 組顯著增加，而 Ctrl 組或 Lv-NC 組 HPDLFs細胞中p-Smad3 表達水平差異無統計學意義。3 組HPDLFs 細胞中t-Smad3 表達水平差異無統計學意義（P＞0.05），見圖6B。

圖6 3 組 HPDLCs 中 TGF-β1 和 Smad3 蛋白的表達情況比較Fig.6 Comparison of expressions of TGF-β1 and Smad3 proteins in HPDLFs of 3 groups

3 討論

牙周炎在世界范圍內的發病率約為十萬分之一，其高復發率、長期療效不佳易導致牙齒周圍槽骨逐漸喪失，嚴重影響患者生活質量［16-17］。遺傳因素是牙周組織發育及炎癥發生發展的關鍵因素，因此，尋找新的標志物以開發更有效、安全的治療策略具有重要臨床意義［18］。HPLDFs 與牙周組織病變、修復及再生過程密切相關，能持續合成與降解膠原蛋白纖維以維持牙周組織的更新與重建，且HPLDFs 還能分泌多種細胞活性因子刺激成骨細胞和破骨細胞完成牙周組織的修復與再生，如骨形態發生蛋白家族BMP-2、BMP-4及BMP-7等［19］。因此，HPLDFs 異?；罨彩茄乐苎装l病的主要決定因素之一。

研究表明，lncRNA 失調可導致多種包括炎癥性疾病、纖維化和腫瘤等相關疾病［20-21］。近年來，lncRNA 參與多種纖維化疾病發生的研究日益受到關 注［22］。lncRNA TUG1 是 一個 長 度為 7.1 kb 的lncRNA，首次在小鼠視網膜細胞發育的基因組篩檢中被發現［23］。近期研究表明，lncRNA TUG1 是一種新型癌基因，其表達上調可促進腫瘤細胞的增殖和遷移如lncRNA TUG1 表達下調可抑制腎細胞癌細胞的遷移、侵襲和增殖，并激活細胞凋亡過程［14］。最新研究發現，非小細胞肺癌中lncRNA TUG1 表達下調［24］。研究證實，lncRNA 對 HPDLFs 的影響主要為促進細胞增殖、膠原合成、成骨分化等［25］。然而，lncRNA TUG1 在HPDLFs 中的潛在功能尚不清楚。本研究發現，過表達lncRNA TUG1的HPDLFs增殖、遷移均顯著增加，提示lncRNA TUG1 是治療牙周病的新靶點，其表達上調可促進HPDLFs的活化。

TGF-β1 參與牙齒移動、牙周組織發育、損傷修復等多種生物學過程，可顯著促進體外培養的HPDLFs 增殖和 ALP 活性［25-27］。體外研究表明，TGF-β1在早期可誘導Ⅰ型膠原mRNA 表達，隨著時間延長，膠原的表達反而受到抑制［28］。但是，對于lncRNA在HPDLFs 纖維鈣化方面的信號轉導通路的研究國內外鮮見報道。本研究初步探討了lncRNA TUG1對HPDLFs 增殖、膠原合成、纖維鈣化等作用可能涉及的信號通路。與對照組相比，lncRNA TUG1 可上調 TGF-β1 和 p-Smad3 信號蛋白的表達量，提示lncRNA TUG1 可能通過激活 TGF-β1/Smads 途徑促HPDLFs的異常活化。本研究還表明，lncRNA TUG1是治療牙周病的新靶點，提示其可通過上調TGF-β1/Smads信號通路促進HPDLFs的增殖、遷移能力及纖維化。

綜上所述，lncRNA TUG1 是治療牙周病的新靶點，lncRNA TUG1 表達上調可顯著促進HPLDFs 的增殖、遷移及促進COLⅠ、COLⅢ、COLⅣ和MMP-2的 mRNA 水平，同時上調 TGF-β1/p-Smad3 信號通路蛋白，提示 lncRNA TUG1 通過激活 TGF-β 途徑促HPLDFs 增殖、遷移及纖維化過程，但其具體調控機制有待進一步探索。