大黃靈仙方對LPS 誘導的肝內膽管組織損傷大鼠炎癥反應及Wnt5a-Ca2+-PKC信號轉導通路的影響①

張 曼 戴建業 俞 淵 唐乾利 陳金梅（湖南中醫藥大學研究生院，長沙 410208）

原發性肝內膽管結石（primary intrahepatic bile duct stones，PIS）始發于肝內膽管系統，是我國常見病和難治?。?］。研究發現肝內膽管組織反復炎癥損傷是導致PIS 膽道淤塞、結石形成、甚至膽管癌的主要原因之一，因此預防和緩解膽道系統炎癥反應是治療肝內膽管結石形成的主要思路之一［2-3］。Wnt5a-鈣離子（Ca2+）-活化蛋白激酶C（protein kinase C，PKC）信號轉導通路可誘導炎癥因子釋放并引起細胞損傷［4］。目前國內外對于該通路的研究多集中于心腦損傷、關節炎、癌癥等疾病，但其在肝內膽管結石形成過程中的調控作用尚未見報道［5］。此外，肝內膽管結石治療一直是膽道外科難題，外科手術是西醫主要治療手段，但術后復發率較高，嚴重危害患者身心健康［6］。因此探尋PIS 新的治療手段尤為重要。課題組經驗方大黃靈仙方具有疏肝利膽、攻下排石功效，可有效防止肝內膽管結石形成，得到廣大醫生和患者認可，且前期研究發現其能抑制膽管細胞炎癥損傷，但分子機制尚不明確［7］。本研究推測大黃靈仙方可能通過Wnt5a-Ca2+-PKC通路抑制膽管系統炎癥損傷，進而防治肝內膽管結石，并建立PIS 動物模型對此進行驗證，以期為臨床合理用藥提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 6～8 周齡清潔級健康SD 大鼠70只，體質量200～250 g，由廣西壯族自治區食品藥品檢驗所實驗動物中心提供，合格證號：SCXX（桂）2019-0001，動物質量合格證號：省科2000A027。所有大鼠于湖南中醫藥大學研究生院層流動物房常規飼養，本研究經湖南中醫藥大學研究生院動物倫理委員會批準，批號：IACUC-01（20160917），試驗符合3R原則。

1.1.2 主要試劑及儀器 大黃靈仙方由生大黃15 g、威靈仙30 g、芒硝10 g、金錢草30 g、枳殼12 g、雞內金10 g、澤蘭15 g、柴胡12 g、郁金12 g、磁石12 g、黃芪30 g、甘草5 g 組成，各中藥配方顆粒劑由江陰天江藥業有限公司提供，購于廣西中醫藥大學第一附屬醫院。HE染色試劑盒（貨號：E677218-0200，上海生物公司）；血清總膽紅素（TBIL）、總膽汁酸（TBA）ELISA試劑盒（貨號：F6696-A、F6697-A，上海奧陸生物科技有限公司）；大鼠IL-6、腫瘤壞死因子（TNF-α）等ELISA試劑盒（貨號：CSB-E04640r、CSB-E69066r，武漢華美生物工程有限公司）；Trizol試劑盒、反轉錄試劑盒（貨號：15596026、4366597，賽默飛世爾中國公司）；Fluo-3/AM 鈣熒光指示劑（貨號：JB0234，江蘇碧云天生物有限公司）；Wnt5a、骨橋蛋白（OPN）、PKC、IL-6 抗體（貨號：ab229200、ab75285、ab32376、ab229381，美國Abcam 公司）；BCA 蛋白定量試劑盒和胰蛋白酶（貨號：P0768、P0231，美國Pierce公司）；光學顯微鏡（SMZ745，日本尼康公司）；激光掃描共聚焦顯微鏡（LSM510，德國Carl Zeiss 公司）；冰凍切片機（CM3050S，德國Leica公司）；蛋白電泳儀、半干轉膜儀（1659001、Trans-Blot SD，美國 Bio-Rad 公司）；化學發光儀（GIS-500，杭州米歐儀器公司）等。

1.2 方法

1.2.1 大鼠膽管炎癥損傷模型建立及分組給藥SD 大鼠隨機分為正常對照組、模型組、大黃靈仙方（320 mg/kg）組、炎癥信號阻斷劑組（PDTC+SB203580，120 mg/kg+10 mg/kg）、大黃靈仙方+信號阻斷劑組（320 mg/kg+120 mg/kg+10 mg/kg），每組12只，除正常對照組外，其余各組大鼠均參照文獻［8］采用戊巴比妥鈉麻醉，暴露膽總管，均經膽總管內緩慢注入1 ml LPS 溶液（2 μg/ml），分層關腹，建立PIS模型。正常對照組經膽總管內緩慢注入1 ml 生理鹽水，其余均同模型組。建模前3 d 開始灌胃給藥，正常對照組及模型組給予生理鹽水，大黃靈仙方組及炎癥信號阻斷劑組按文獻［7］設置劑量并進行灌胃及腹腔注射干預3 d。

1.2.2 大鼠標本采集 末次給藥12 h，取各組麻醉后大鼠腹主動脈血2 ml，分離血清置于-20℃保存。各組隨機取6 只大鼠，迅速處死，開腹，并經下腔靜脈注射肝素進行全身肝素化灌注預熱，待肝臟變為均一的土黃色時，在外科顯微鏡下取完整膽管樹，稱重，置于液氮中冷凍30 min，-80℃保存。另外6只大鼠同樣取膽管樹組織標本，部分置于-80℃保存，其余部分清洗后置于4%多聚甲醛溶液固定。

1.2.3 各組大鼠血清炎癥因子及肝功能指標檢測 取1.2.2 中血清，4℃冰箱解凍，按照ELISA 試劑盒說明書檢測血清炎癥因子TNF-α、IL-6 及肝功能指標TBIL、TBA水平。

1.2.4 各組大鼠膽管組織HE染色病理形態觀察取1.2.2 中4%多聚甲醛中膽管組織，常規透明，浸蠟，包埋，切片（5 μm），按HE 試劑盒說明書染色，光鏡下觀察組織形態。

1.2.5 RT-qPCR 檢測膽管組織 Wnt5a、OPN 及 PKC mRNA 表達 取各組1.2.2 中-80℃ 保存的膽管組織，4℃ 解凍，勻漿，Trizol 試劑盒抽提總RNA，采用反轉錄試劑盒將1 μg RNA 反轉錄為cDNA，并以此為模板進行RT-qPCR 反應。引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，引物設計見表1。以β-actin 為 內 參 ，2-ΔΔCt法 計 算 Wnt5a、OPN 及 PKC mRNA相對表達。

表1 RT-qPCR引物序列Tab.1 RT-qPCR primer sequences

1.2.6 Western blot 法檢測膽管組織中Wnt5a、OPN、PKC、IL-6 蛋白表達 取 1.2.2 中-80℃ 保存膽管組織，4℃解凍，蛋白提取試劑盒提取蛋白，BCA 試劑盒檢測蛋白總濃度。取50 μg 蛋白上樣，進行電泳和轉膜反應，TBST溶液清洗，5%脫脂牛奶室溫封閉1 h，TBST 溶液清洗3 次，加入一抗（Wnt5a、OPN、PKC、IL-6、β-actin），內參抗體1∶2 000稀釋，其余抗體1∶1 000 稀釋，4℃搖床室溫孵育過夜，TBST 振洗，加入 HRP 羊抗兔二抗（1∶2 000 稀釋），37℃ 搖床室溫孵育1 h，TBST 清洗3 次，增強化學發光法顯色，化學發光儀觀察條帶并拍照，Image J軟件分析各組蛋白相對表達。

1.2.7 熒光免疫法檢測膽管組織細胞Ca2+濃度取1.2.2中膽管樹組織標本，冷凍切片機切片（8 μm），按Fluo-3/AM 鈣熒光指示劑說明書進行熒光標記，調整激光共聚焦顯微鏡激發波長為488～500 nm，物鏡下觀察膽管組織Ca2+熒光強度，熒光強弱反映細胞內游離鈣水平，Image-RroPlus6.0 圖像處理系統測定標本淺層區域面積及熒光強度，以單位面積熒光強度表示膽管組織細胞Ca2+水平［9］。

1.3 統計學分析 采用SPSS22.0軟件進行統計學分析，計量資料以表示，多組間比較采用單因素方差分析，進一步兩組間比較采用SNK-q檢驗，P＜0.05表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 大黃靈仙方對血清TBIL、TBA 水平的影響與正常對照組相比，模型組大鼠血清TBIL、TBA 水平升高（P＜0.05）。與模型組相比，炎癥信號阻斷劑組及大黃靈仙方組大鼠血清TBIL、TBA 水平均降低（P＜0.05）；與炎癥信號阻斷劑組及大黃靈仙方組相比，大黃靈仙方+信號阻斷劑組大鼠血清TBIL、TBA水平進一步降低（P＜0.05，表2）。

表2 大鼠血清TBIL、TBA水平比較（，n=12，μmol/L）Tab.2 Comparison of serum TBIL and TBA levels of rats（，n=12，μmol/L）

表2 大鼠血清TBIL、TBA水平比較（，n=12，μmol/L）Tab.2 Comparison of serum TBIL and TBA levels of rats（，n=12，μmol/L）

Note：Compared with normal control，1）P＜0.05；compared with model，2）P＜0.05；compared with inflammatory signal blocker，3）P＜0.05；compared with Dahuang Lingxian prescription，4）P＜0.05.

Groups Normal control Model Inflammatory signal blocker Dahuang Lingxian prescription Dahuang Lingxian prescription+signal blocking agent TBIL 2.36±1.39 142.98±19.211）89.14±13.621）2）53.27±9.861）2）3）TBA 8.60±3.56 129.28±17.361）82.54±11.071）2）59.62±10.351）2）3）35.82±6.121）2）3）4）37.29±7.131）2）3）4）

2.2 大黃靈仙方對血清炎癥因子的影響 與正常對照組相比，模型組大鼠血清TNF-α、IL-6 水平均升高（P＜0.05）。與模型組相比，炎癥信號阻斷劑組及大黃靈仙方組大鼠血清TNF-α、IL-6水平均降低（P＜0.05）。與炎癥信號阻斷劑組及大黃靈仙方組相比，大黃靈仙方+信號阻斷劑組大鼠血清TNF-α、IL-6水平進一步降低（P＜0.05，表3）。

表3 大鼠血清TNF-α、IL-6水平比較（，n=12）Tab.3 Comparison of serum TNF-α and IL-6 levels of rats（，n=12）

表3 大鼠血清TNF-α、IL-6水平比較（，n=12）Tab.3 Comparison of serum TNF-α and IL-6 levels of rats（，n=12）

Note：Compared with normal control，1）P＜0.05；compared with model，2）P＜0.05；compared with inflammatory signal blocker，3）P＜0.05；compared with Dahuang Lingxian prescription，4）P＜0.05.

Groups Normal control Model Inflammatory signal blocker Dahuang Lingxian prescription Dahuang Lingxian prescription+signal blocking agent TNF-α/（ng·L-1）11.16±1.69 39.15±3.401）33.09±3.311）2）25.04±2.521）2）3）IL-6/（pg·ml-1）103.09±10.09 185.32±18.101）166.08±16.121）2）144.84±14.151）2）3）19.12±1.641）2）3）4）124.38±14.141）2）3）4）

2.3 大黃靈仙方對膽管組織形態的影響 正常對照組大膽管組織形態正常。模型組大鼠可見膽管細胞變性、增生，匯管區淋巴細胞、漿細胞浸潤及膽小管擴張淤積明顯。炎癥信號阻斷劑組、大黃靈仙方組、大黃靈仙方+信號阻斷劑組大鼠膽管組織變性、炎癥浸潤等病理損傷現象逐漸緩解（圖1）。

圖1 各組大鼠膽管組織HE染色（×200）Fig.1 HE staining of bile duct tissue of rats in each group（×200）

2.4 大黃靈仙方對膽管組織Wnt5a、OPN 及PKC mRNA 表達的影響 與正常對照組相比，模型組大鼠膽管組織Wnt5a、OPN 及PKC mRNA 表達水平升高（P＜0.05）。與模型組相比，炎癥信號阻斷劑組及大黃靈仙方組大鼠膽管組織Wnt5a、OPN 及PKC mRNA 表達水平降低（P＜0.05）。與炎癥信號阻斷劑組及大黃靈仙方組相比，大黃靈仙方+信號阻斷劑組大鼠膽管組織Wnt5a、OPN 及PKC mRNA 表達進一步降低（P＜0.05，表4）。

表4 大鼠膽管組織Wnt5a、OPN 及PKC mRNA 表達比較（，n=6）Tab.4 Comparison of mRNA expressions of Wnt5a，OPN and PKC in bile duct tissue of rats（，n=6）

表4 大鼠膽管組織Wnt5a、OPN 及PKC mRNA 表達比較（，n=6）Tab.4 Comparison of mRNA expressions of Wnt5a，OPN and PKC in bile duct tissue of rats（，n=6）

Note：Compared with normal control，1）P＜0.05；compared with model，2）P＜0.05；compared with inflammatory signal blocker，3）P＜0.05；compared with Dahuang Lingxian prescription，4）P＜0.05.

Groups Normal control Model Inflammatory signal blocker Dahuang Lingxian prescription Dahuang Lingxian prescription+signal blocking agent Wnt5a/β-actin 0.16±0.09 1.33±0.151）OPN/β-actin 0.19±0.06 1.36±0.161）PKC/β-actin 0.18±0.08 1.39±0.141）1.01±0.121）2）1.03±0.131）2）1.07±0.121）2）0.74±0.131）2）3）0.71±0.121）2）3）0.73±0.141）2）3）0.42±0.121）2）3）4）0.48±0.131）2）3）4）0.42±0.131）2）3）4）

2.5 大黃靈仙方對膽管組織Wnt5a、OPN、PKC 及IL-6 蛋白表達的影響 與正常對照組相比，模型組大鼠膽管組織 Wnt5a、OPN、PKC 及 IL-6 表達水平均升高（P＜0.05）。與模型組相比，炎癥信號阻斷劑組及大黃靈仙方組大鼠膽管組織Wnt5a、OPN、PKC 及IL-6 表達水平均降低（P＜0.05）。與炎癥信號阻斷劑組及大黃靈仙方組相比，大黃靈仙方+信號阻斷劑組大鼠膽管組織Wnt5a、OPN、PKC及IL-6表達水平進一步降低（P＜0.05，圖2、表5）。

表5 大鼠膽管組織Wnt5a、OPN、PKC及IL-6表達比較（，n=6）Tab.5 Comparison of expressions of Wnt5a，OPN，PKC and IL-6 in bile duct tissue of rats（，n=6）

表5 大鼠膽管組織Wnt5a、OPN、PKC及IL-6表達比較（，n=6）Tab.5 Comparison of expressions of Wnt5a，OPN，PKC and IL-6 in bile duct tissue of rats（，n=6）

Note：Compared with normal control，1）P＜0.05；compared with model，2）P＜0.05；compared with inflammatory signal blocker，3）P＜0.05；compared with Dahuang Lingxian prescription，4）P＜0.05.

IL-6/β-actin 0.38±0.10 1.59±0.131）1.22±0.141）2）0.89±0.111）2）3）0.42±0.101）2）3）4）Groups Normal control Model Inflammatory signal blocker Dahuang Lingxian prescription Dahuang Lingxian prescription+signal blocking agent Wnt5a/β-actin 0.26±0.09 1.43±0.151）1.11±0.121）2）0.84±0.131）2）3）0.49±0.121）2）3）4）OPN/β-actin 0.29±0.06 1.46±0.161）1.13±0.131）2）0.81±0.121）2）3）0.51±0.131）2）3）4）PKC/β-actin 0.28±0.08 1.49±0.141）1.17±0.121）2）0.83±0.141）2）3）0.52±0.131）2）3）4）

圖2 Western blot 檢測各組大鼠膽管組織Wnt5a、OPN、PKC及IL-6蛋白表達Fig.2 Western blot of Wnt5a，OPN，PKC and IL-6 protein expressions in bile duct tissue of rats in each group

2.6 大黃靈仙方對膽管組織細胞內Ca2+水平的影響 與正常對照組相比，模型組大鼠膽管組織細胞熒光強度較高，細胞內游離Ca2+水平升高（P＜0.05）。與模型組相比，炎癥信號阻斷劑組及大黃靈仙方組大鼠膽管組織細胞熒光強度較低，細胞內游離Ca2+水平均降低（P＜0.05）。與炎癥信號阻斷劑組及大黃靈仙方組相比，細胞內游離Ca2+水平進一步降低（P＜0.05，圖3、表6）。

表6 大鼠膽管組織細胞內Ca2+水平比較（，n=6）Tab.6 Comparison of intracellular Ca2+ levels in bile duct tissues of rats（，n=6）

表6 大鼠膽管組織細胞內Ca2+水平比較（，n=6）Tab.6 Comparison of intracellular Ca2+ levels in bile duct tissues of rats（，n=6）

Note：Compared with normal control，1）P＜0.05；compared with model，2）P＜0.05；compared with inflammatory signal blocker，3）P＜0.05；compared with Dahuang Lingxian prescription，4）P＜0.05.

Ca2+level/AU 0.50±0.05 1.86±0.131）0.76±0.071）2）0.67±0.051）2）3）0.58±0.041）2）3）4）Groups Normal control Model Inflammatory signal blocker Dahuang Lingxian prescription Dahuang Lingxian prescription+signal blocking agent

圖3 各組大鼠膽管組織細胞Ca2+水平熒光圖（×400）Fig.3 Fluorescence diagram of Ca2+level in bile duct tissue cells of rats in each group（×400）

3 討論

現代醫學認為膽石癥與膽管炎癥關系密切，膽管炎癥反應會引起膽管炎性狹窄、梗阻及膽汁引流不暢，是膽石癥形成的關鍵病理機制［10］。LPS 可誘導或加重機體炎癥反應，引起結石或導致結石復發率上升［11］。本研究經膽管內注射LPS 后發現，大鼠血清TNF-α、IL-6 及膽管組織IL-6 蛋白表達均顯著高于正常對照組，同時肝組織出現膽管細胞變性、增生、匯管區炎癥浸潤、膽管擴張淤積等病理損傷，與人類膽管結石組織病理學相似，提示造模成功［12］。另外，文獻證實PIS 患者結石化學成分中絕大部分為膽紅素鈣結石，且臨床發現膽石癥患者血清肝功能指標 TBIL、TBA 水平均不同程度升高［13］。本研究也檢測到模型組大鼠血清TBIL、TBA 水平異常升高，進一步表明造模成功。

中醫將膽石癥歸為“脅痛”“黃疸”范疇，認為“外感六淫、情志不暢、飲食失節、脾胃虛弱、肝陰不足”等所致肝膽氣機不暢，疏泄失常，濕熱蘊蒸于肝膽，膽汁通降不暢，日久成石，堵塞于膽道是膽石癥形成的主要病機，主要以疏利肝膽、清熱利濕藥疏通臟腑淤積，且療效較好［14］。本科室經驗方大黃靈仙方中金錢草、柴胡、雞內金、郁金及澤蘭等藥物均可入肝膽，具有清熱、利濕、解郁之功，白芍、黃芪等養陰柔肝、補氣升陽能調暢肝膽氣機而解淤滯，全方契合膽石癥的病因病機，重在清熱利濕、疏肝利膽排石。另外，研究報道金錢草、雞內金、郁金在泌尿系統結石中有較好的排石功效［15］。本研究發現大黃靈仙方組大鼠血清TNF-α、IL-6及膽管組織IL-6蛋白表達降低，且肝膽管組織病理損傷明顯減輕，表明大黃靈仙方能夠降低炎癥反應、緩解肝內膽管組織炎癥損傷。

藥物治療膽石癥常從削弱炎癥信號通路出發，通過減輕炎癥反應減少結石形成［16］。Wnt5a/Ca2+信號轉導通路可調控炎癥反應降低組織損傷［17］。研究證實炎癥刺激下，細胞中的Wnt5a可與卷曲蛋白-2受體特異性結合，激活G蛋白和散亂蛋白，引起細胞內Ca2+濃度升高，在活化PKC 及鈣調蛋白依賴性蛋白激酶Ⅱ表達的同時，誘發IL-6、TNF-α 等炎癥因子大量表達，加重組織損傷［18-19］。本研究發現，模型組大鼠膽管組織中Wnt5a、PKC mRNA 及蛋白表達、細胞內Ca2+水平異常高于正常對照組，提示Wnt5a-Ca2+-PKC 信號通路活化可能參與膽管組織炎癥反應。另外，促炎細胞因子也可誘導巨噬細胞分泌OPN，通過與細胞表面OPN 受體結合放大炎癥反應，加速細胞凋亡［20］。Wnt5a 與 OPN 間也存在調控關系，在膝關節炎中被證明共同參與炎癥反應進程［21］。本研究在模型組大鼠膽管組織中檢測到OPN mRNA 及蛋白表達異常增高，而采用炎癥信號阻斷劑阻斷炎癥反應后，隨著大鼠血清炎癥因子TNF-α、IL-6 及膽管組織 IL-6 蛋白表達降低，大鼠膽管組織中Wnt5a、PKC mRNA、OPN mRNA 及蛋白表達、細胞內Ca2+水平降低的同時，肝膽管組織病理損傷明顯緩解，進一步證實Wnt5a-Ca2+-PKC 信號通路參與膽管組織炎癥反應。給予大黃靈仙方治療后，大鼠膽管組織中Wnt5a、PKC、OPN mRNA 及蛋白表達、細胞內Ca2+水平均降低，提示大黃靈仙方可抑制Wnt5a-Ca2+-PKC 信號通路活化，可能是其降低膽管組織炎癥反應、防治膽管結石的機制之一。而大黃靈仙方與炎癥通路阻斷劑聯用后，大鼠上述通路指標進一步降低的同時，膽管組織炎癥損傷也進一步緩解，表明炎癥信號阻斷劑可進一步促進大黃靈仙方抑制Wnt5a-Ca2+-PKC信號通路活化作用。

綜上所述，大黃靈仙方可能通過抑制Wnt5a-Ca2+-PKC 信號通路活化降低膽管組織炎癥反應，為闡明大黃靈仙方防治膽管結石的分子機制提供參考。但中藥防治膽管結石的靶點及途徑較多，有待進一步研究。