系統性紅斑狼瘡合并動脈粥樣硬化動物模型及其發病機制研究進展①

楊 月 劉一凡 薛 鸞 （上海中醫藥大學附屬岳陽中西醫結合醫院風濕科，上海 200437）

系統性紅斑狼瘡（systemic lupus erythematosus，SLE）是由自身免疫介導的，以免疫性炎癥損傷為特點的結締組織疾病，由于細胞和體液免疫功能障礙，產生多種自身抗體，其炎癥損傷可累及皮膚、漿膜、關節、腎臟及中樞神經等全身多個系統及器官，臨床表現多樣，病情變化多端。全身不同程度的血管炎作為其發病的病理基礎，主要表現為各種免疫復合物在血管壁沉積，從而激活補體系統，引起發病。

近年研究發現，心血管病變是SLE 常見的并發癥，其中又以冠狀動脈粥樣硬化性疾病為主，其是導致SLE患者死亡的重要原因之一［1-2］。SLE合并早發的動脈粥樣硬化（atherosclerosis，AS）的發病機制目前并不明確，傳統危險因素并不能完全解釋其發病，因此，建立合適的SLE 合并AS 的動物模型并深入研究其可能的發病機制就成為研究的重點。本文就現有的常用SLE 合并AS 的小鼠模型做一簡要闡述（總結如表1）。

表1 SLE合并AS小鼠模型Tab.1 Mouse model of SLE with AS

1 雜交純化模型

lpr 和 gld 品系小鼠分別在 Fas 和 FasL 基因位點上存在突變，而Fas/FasL 信號通路是調控細胞凋亡的信號通路之一，從而導致大量的淋巴細胞異常增殖，出現與人類SLE 相似的特異性自身抗體［3-4］。以C57BL/6 為背景的載脂蛋白 E（apolipoprotein E，ApoE）基因敲除小鼠（ApoE-/-mice）和低密度脂蛋白受體（low density lipoprotein receptor，LDLR）基因敲除小鼠（LDLr-/-mice）是目前用來研究AS 的經典動物模型［5］。ApoE 是一種富含精氨酸的堿性蛋白，具有調節膽固醇和脂蛋白代謝的功能。因此，ApoE基因的缺失能夠導致含有膽固醇的物質在血管中不斷積聚，最終形成AS。LDLR 是一類單鏈糖蛋白膜受體，主要功能是介導血漿中富含膽固醇的低密度脂蛋白進入胞內代謝分解，清除血管中的多余脂質，LDLR 功能異常將導致體內脂代謝紊亂。因此，通過將SLE 和AS 兩種模型的小鼠雜交純化從而獲得同時具備SLE 和AS 表現的小鼠模型就被率先提出。

最早在 2004 年，APRAHAMIAN 等［6］首先將同是C57BL/6背景的ApoE-/-和gld小鼠交配，選取其中的 4 種純合子基因型：ApoE-/-、gld、gld. ApoE-/-以及ApoE+/+gld+/+（WT）。雖然 gld. ApoE-/-小鼠的高膽固醇血癥較ApoE-/-小鼠輕，但gld. ApoE-/-小鼠的主動脈斑塊面積較ApoE-/-小鼠明顯增多。gld.ApoE-/-小鼠不僅ANA、aCL 和IgG 的水平較其余3 組明顯升高，同時脾腫大和淋巴結增生、腎小球體積增大和蛋白尿的生成也較其余3組嚴重。以上表現在高脂飲食時更明顯。gld. ApoE-/-小鼠在動脈斑塊、淋巴結、血液中均可見凋亡核碎片增加，但在淋巴結檢查發現吞噬凋亡碎片的巨噬細胞數量明顯下降。該模型的發病機制可能與凋亡物質增加而巨噬細胞吞噬功能不足有關，可見，凋亡細胞清除障礙同時加重了該模型的AS 和免疫表型。王世穎等［7-8］也通過這種方法成功建立了SLE合并AS的小鼠模型，同時發現gld.ApoE-/-小鼠體內內皮祖細胞（endothelial progenitor cells，EPCs）數量減少，且骨髓EPCs 黏附、吞噬及促血管生成功能受損，這可能是狼瘡伴AS發生的原因之一。WATKINS 等［9］還發現干擾素調節因子5（interferon regulatory factor 5，IRF5）在該模型SLE 合并AS 病變中起到了特殊的調節作用。IRF5缺乏可改善狼瘡病情，但可促進AS 和代謝功能障礙。這可能與IRF5缺乏導致的Toll樣受體7（TLR7）和 Toll 樣受體 9（TLR9）信號下游抗 AS 細胞因子IL-10的減少有關。

辛伐他汀和嗎替麥考酚酯治療均可改善gld.ApoE-/-小鼠的 AS 和免疫表型［10-11］。常規劑量的辛伐他汀不僅對gld.ApoE-/-小鼠主動脈斑塊病變范圍有緩和的抑制作用（25%），其對免疫的改善更顯著，其中淋巴組織增生和脾腫大下降達到66%和48%，ANA 滴度下降57%，蛋白尿和腎小球增生基本恢復正常，其作用機制和調控Th1/Th2 細胞因子平衡相關，抑制促炎因子TNF-α、IFN-γ的釋放，促進抗炎因子IL-4、IL-10 的表達，并最終減少凋亡碎片聚集。過氧化物酶體增殖物激活受體-γ（peroxisome proliferator-activated receptor γ，PPARγ）激動劑羅格列酮是一種常用的胰島素增敏劑，同時具有免疫調節作用。APRAHAMIAN 等［12］研究發現羅格列酮通過誘導脂聯素能夠降低gld. ApoE-/-小鼠的ANA 水平和腎臟病變程度，減輕AS病變。

與此相似，FENG 等［13］在 2007 年通過將 ApoE-/-和lpr小鼠交配獲得了另一種同時具備狼瘡和AS的ApoE-/-Fas-/-C57BL/6 小鼠。該模型鼠同時表現為狼瘡腎炎、AS 和骨量減少。在該模型中，抗氧化磷脂（OxPL）IgG抗體含量增加與動脈斑塊面積、腎小球叢面積呈正相關，與骨密度和骨體積分數呈負相關，提示共享的信號通路可能促進以上3種疾病的發生。

LEWIS 等［14］還使用 LDLr-/-小鼠與 Sle16 小鼠雜交產生了Sle16. LdLr-/-小鼠。Sle16 小鼠又稱B6.129chr1b小鼠，是在1號染色體攜帶一個起源于129 小鼠的間隔［15］。盡管 Sle16 小鼠在血清中具有高水平的自身抗體，腎臟中沉積了高水平的IgG 和C3，但僅表現為輕度增生性腎小球腎炎。在此種易感狼瘡背景下，高脂肪飲食不僅會導致Sle16.LdLr-/-小鼠AS斑塊范圍增加，還會使斑塊組成發生質的變化，凋亡細胞增加，抗ds-DNA 抗體、抗ss-DNA 抗體及抗chromatin 抗體滴度升高，從而導致更嚴重的病變。SLE 加速的AS 和腎臟炎癥與免疫復合物的形成和系統補體的耗竭密切相關。高脂血癥會增強腎免疫復合物介導的補體沉積和腎炎的發展，而加速AS 的發生與補體的耗竭和凋亡碎片攝取的減少有關。這些結果提示積極治療SLE患者高脂血癥可減少狼瘡性腎炎的發生，降低加速AS的風險。

2 誘導模型

Pristane 的化學名是2，6，10，14-四甲基十五烷（2，6，10，14-tetramethylpentadecane）。SATOH 等［16］1995 年發現給非自發性免疫鼠BALB/c 鼠1 次性腹腔注射Pristane 0.5 ml 可成功誘導小鼠狼瘡，之后陸續發現非自身免疫性小鼠對Pristane 的易感性普遍存在，其中包括C57BL/6 小鼠［17］。該造模方法小鼠外周血循環產生大量的ANA 抗體、anti-dsDNA 抗體、抗 snRNP/Sm 抗體、anti-Su 抗體等，同時可導致腎小球腎炎、蛋白尿、關節炎等病變，跟人類SLE 具有相似的血清特異性抗體和腎臟免疫復合物沉積，有較好的相關性［18］。目前該方法已成為誘導型狼瘡小鼠模型最常用方法，是唯一在IFN-Ⅰ升高特征上與人類 SLE 相似的動物模型［19］。LEE 等［20-21］發現腹腔未成熟的Ly6Chigh單核細胞的聚集是Pristane 處理的小鼠體內IFN-Ⅰ的主要來源，Ly6Chigh單核細胞耗竭后IFN-Ⅰ的表達迅速消失。Pristane 僅通過TLR7 和髓樣分化因子88（MyD88）依賴通路誘導IFN-Ⅰ的產生、單核細胞的募集和自身抗體的產生。TLR7 缺失不僅可以消除Pristane 誘導的IFN-Ⅰ產生，還可消除自身抗體的產生，提示TLR7/MyD88/IFN-Ⅰ通路在該模型中發揮關鍵作用［22］。

近年來，通過AS模型鼠誘導狼瘡模型的研究逐漸增多。ZHANG 等［23］對 ApoE-/-小鼠進行腹腔注射Pristane，ApoE-/-pristane 組小鼠出現 ANA、ENA 水平升高和脾腫大，其中包括抗Sm、抗nRNP、抗核糖體抗體，符合SLE 的特征。且ApoE-/-pristane 組小鼠動脈斑塊的膠原含量明顯下降，凋亡細胞增多。Pristane能夠增加AS 斑塊的易損性，這與IFN-I 的活化密切相關。

3 骨髓移植嵌合體模型

MOREL等［24］在1996年描述了NZM2410小鼠株中3個主要的染色體區間，分別為Sle1、Sle2和Sle3，它們與狼瘡易感性高度相關。STANIC 等［25］將B6.Sle1.2.3三倍同源小鼠的狼瘡易感性表型轉移到受致命性輻射、AS 易感的LDLr-/-小鼠體內，從而制造骨髓移植嵌合體模型LDLr.Sle。LDLr.Sle小鼠表現出狼瘡樣病變，以雙鏈DNA 抗體升高和腎臟病變為特征。經過高脂飲食喂養，盡管LDLr.Sle 較LDLr.B6 小鼠出現更為嚴重的AS 病變，但LDLr. Sle 小鼠的膽固醇和甘油三酯水平卻較LDLr.B6 小鼠低，且兩種小鼠的血壓水平無明顯差異，血清肌酐和尿素氮水平與動脈斑塊面積無明顯相關性，證明除了血脂異常、腎臟病變、高血壓，還有其他機制導致了該狼瘡易感小鼠的AS 進展。LDLr.Sle 小鼠的斑塊部位出現更多的炎癥細胞浸潤，外周CD4+T 細胞和B 細胞高度活化，出現明顯升高的抗氧化低密度脂蛋白抗體和抗心磷脂抗體。

BRAUN 等［26］還發現普通飲食和高脂飲食對于LDLr.Sle 小鼠狼瘡表型和加速AS 的出現以及斑塊部位增多的CD4+T 細胞、抗氧化低密度脂蛋白抗體和抗β2-GPI抗體的升高均無影響，但高脂飲食喂養的LDLr. Sle 小鼠的死亡率和狼瘡病情活動度較普通飲食小鼠明顯升高。VAN LEUVEN 等［27］進一步研究發現，盡管阿托伐他汀能明顯降低LDLr.Sle 小鼠的膽固醇水平，但其并不能改善LDLr.Sle 小鼠的動脈斑塊面積，反而是嗎替麥考酚酯能明顯降低LDLr.Sle 小鼠的動脈斑塊面積，抑制CD4+T 細胞活化和向動脈斑塊部位的浸潤。而在此時間點上，嗎替麥考酚酯對LDLr.Sle 小鼠的抗ds-DNA 抗體滴度和腎臟功能以及腎臟病理并無明顯改善，提示嗎替麥考酚酯對LDLr.Sle 小鼠AS 的改變并非是其改善腎臟病變的間接影響。以上結果也從另一側面為SLE 中觀察到的加速AS 與自身免疫相關提供了額外的證據。

GAUTIER 等［28］還使用 gld 小鼠的骨髓細胞移植到LDLr-/-小鼠體內制造了另一種骨髓移植嵌合體模型gld→LDLr-/-。gld→LDLr-/-小鼠和wt→LDLr-/-小鼠在血漿脂質、脂蛋白譜以及腎功能和蛋白尿方面均無明顯差異，但gld→LDLr-/-小鼠的AS 斑塊面積較wt→LDLr-/-小鼠明顯升高?？赡苁怯捎诶钳彶∏閷е铝嗣庖呦到y的激活，從而在心血管系統中誘導了炎癥反應，并導致內皮細胞活化以及凋亡碎片、巨噬細胞、CD4+T 細胞的聚集，從而加速了AS 病變進展。

4 高脂飲食喂養模型

研究表明，ApoE-/-小鼠體內本身就可能存在異常的免疫反應。ApoE-/-小鼠能夠通過提升抗原遞呈細胞表面協同刺激信號分子CD40 和CD80 的表達，增強T細胞免疫反應［29］。WANG 等［30］發現ApoE-/-小鼠能夠通過下調TLR4 信號通路從而導致脾臟細胞凋亡減輕，促進ANA 和ds-DNA 抗體的產生。同時該團隊還發現ApoE-/-小鼠高脂飲食喂養4 個月后，出現血肌酐和尿蛋白的升高，能自發性地形成血清ANA 抗體和抗ds-DNA 抗體，同時出現脾腫大和增生性腎小球腎炎，IgG、C3 在腎小球沉積，這些疾病特征在雌性小鼠中表現為更明顯，與SLE 動物模型Fas-/-小鼠（MRL/lpr mice）極其相似。但不同于Fas-/-小鼠，只有在ApoE-/-小鼠的主動脈內膜觀察到AS斑塊，動脈斑塊內還可以檢測到IgG、C3的沉積和巨噬細胞的浸潤。以上表現提示ApoE-/-小鼠經高脂飲食喂養后出現了自身免疫炎癥和臟器的損傷［31］。

劉麗等［32］試圖通過用狼瘡模型小鼠（MRL/lpr mice）高脂飲食喂養誘導SLE 合并AS 模型，發現即使予以足夠時間的高脂飲食，該模型鼠仍不能表現出明顯的高脂血癥和AS病變。

除了以上提到的4 種造模方法，通過對ApoE-/-小鼠誘導慢性移植物抗宿主?。╟GVHD）（B6.GVH.ApoE-/-小鼠）也成為狼瘡合并AS 的造模方法之一［33］。cGVHD 會加劇 AS，同時出現抗 ds-DNA 抗體、抗chromatin 抗體、抗心磷脂抗體及抗氧化低密度脂蛋白抗體升高。但抗體水平沒有MRL/lpr.ApoE-/-小鼠（MRL/lpr 小鼠與ApoE-/-小鼠雜交鼠）升高明顯，目前該模型研究較少。

綜上所述，選擇合適的動物模型，并從系統性炎癥反應、自身抗體、細胞凋亡、補體耗竭、IFN-Ⅰ、趨化因子等方面進一步探討SLE 合并AS 的作用機制，可能為臨床防治SLE心血管事件帶來新的突破。