膿腫分枝桿菌臨床分離株藥物敏感性初探

岳陳達 岑蕊言 楊偉江 王利群 羅杰夫 黎 敏 魯衛平 雷 霞

1陸軍軍醫大學大坪醫院(陸軍特色醫學中心)皮膚科，重慶，400042；2陸軍軍醫大學大坪醫院(陸軍特色醫學中心)檢驗科，重慶，400042

膿腫分枝桿菌(Mycobacteriumabscessus, MAB)屬于非結核分枝桿菌(nontuberculous mycobacteriaum, NTM)中的快速生長分枝桿菌群(rapid-growing mycobacteriaum，RGM)，可侵犯人體的肺、皮膚軟組織、骨關節、淋巴結等組織器官造成局部或播散性的感染，是造成我國皮膚NTM病最常見的RGM[1，2]。皮膚膿腫分枝桿菌感染的皮損常表現為在手術或受傷部位形成的柔軟、波動、局限的皮下膿腫或結節[3]，特別是一些美容注射后的感染病變，常為皮下多發膿腫結節，部分甚至形成難以愈合的潰瘍和竇道。MAB僅對極少數抗生素敏感，對一線抗結核藥物如異煙肼、利福平均天然耐藥，臨床上治療十分困難。美國胸科協會和美國臨床和實驗室標準協會(Clinical and Laboratory Standards Institute, CLSI)推薦針對RGM感染時需先用阿米卡星、頭孢西丁、環丙沙星、克拉霉素、米諾環素、美羅培南、利奈唑胺、莫西沙星等進行藥敏實驗后根據結果再進行相關臨床用藥[4，5]。根據國內外指南，當前皮膚膿腫分枝桿菌感染的治療仍參照肺部感染的治療方案，除單純單個皮膚軟組織病變可僅口服抗生素治療外，其余感染均需要靜脈注射藥物和口服藥物聯合治療，并分初始和維持兩個階段進行：初始階段靜脈應用阿米卡星和替加環素聯合口服大環內酯類藥物，至少4周；維持階段口服大環內酯類藥物并根據藥物敏感性實驗聯合使用下列1～3種藥物：氯法齊明、利奈唑胺、米諾環素、莫西沙星、復方新諾明，至少6個月。總之，當前對于皮膚膿腫分枝桿菌感染的治療需要多藥物聯合長時間治療[6-9]。

為了解皮膚和軟組織感染中膿腫分枝桿菌的藥物敏感性和耐藥現狀，本研究檢測了膿腫分枝桿菌臨床分離株以及標準菌株對國內外指南中推薦的藥物及一線抗結核藥的藥物敏感性，以期在臨床治療皮膚軟組織膿腫分枝桿菌感染方面提供一定的實驗依據。

1 資料與方法

1.1 菌株、試劑及材料

1.1.1 菌株 膿腫分枝桿菌標準株ATCC 19977購自北納生物菌種保藏中心，臨床菌株分離自2019年9月至2021年6月就診于陸軍軍醫大學大坪醫院皮膚科的膿腫分枝桿菌皮膚軟組織感染患者，在本次研究中收集的11例膿腫分枝桿菌感染的病人均為青壯年女性，且都有感染部位的皮膚軟組織侵入性操作史，其中5例為埋線減肥、1例為針灸、6例為“精華”、“蛋白”注射。取患者膿液標本進行細菌培養后分別采用高效液相色譜法和微陣列芯片法進行菌種鑒定，兩種鑒定方法均確定為膿腫分枝桿菌后保存菌株，編號為MAB01-11用于后續實驗。

1.1.2 材料及試劑 Middlebrook 7H9肉湯培養基基礎，CAMHB肉湯培養基基礎，刃天青鈉，克拉霉素、阿奇霉素、阿米卡星、鹽酸莫西沙星、鹽酸環丙沙星、鹽酸米諾環素、美羅培南、利奈唑胺、異煙肼、利福平、頭孢西丁、頭孢美唑標準品(北京索萊寶)。PBS緩沖液、二甲基亞砜(DMSO)、吐溫80(Tween-80)、甘油(上海生工)。

1.2 主要試劑配制 7H9肉湯培養基：用450 mL雙蒸水溶解2.35 g Middlebrook7H9肉湯培養基基礎，加入1 mL甘油及0.25 g Tween-80，充分攪拌使培養基完全溶解后分裝。121℃滅菌10 min，置于4℃冰箱保存。

CAMHB肉湯培養基：用1000 mL雙蒸水溶解22.0 g CAMHB肉湯培養基基礎，加入0.5 g Tween-80，充分攪拌使培養基完全溶解后分裝。121℃滅菌10 min，置于4℃冰箱保存。

抗生素配制：先將抗生素粉末制成10 mg/mL的貯存液過濾后置于-20℃冰箱保存，其中克拉霉素、阿奇霉素、利福平、頭孢西丁、頭孢美唑用DMSO溶解，阿米卡星、鹽酸莫西沙星、鹽酸環丙沙星、鹽酸米諾環素、美羅培南、利奈唑胺、異煙肼用雙蒸水溶解。每次使用前將儲存液用菌懸液稀釋為1280 μg/mL的工作液。

刃天青配制：先將刃天青鈉粉末溶于雙蒸水制成1 mg/mL的儲存液，置于4℃冰箱保存。使用時將儲存液用CAMHB肉湯培養基稀釋至0.2%的工作液備用。

1.3 菌液制備及接種 挑取受試菌接種于7H9肉湯培養基中，于35℃、150 r/min搖床中培養至對數生長期，OD600為0.8左右；8000 r/min，5 min離心后用含有0.05% Tween-80的PBS洗去死菌及代謝產物，反復2～3次。用生理鹽水將麥氏濁度調至0.5備用。Tween-80用于減少膿腫分枝桿菌聚集的趨勢。

1.4 微量肉湯稀釋法測定MIC 參照CLSI系列文件和相關文獻并稍作修改，用CAMHB肉湯培養基調至濃度約為5×105cfu/mL，加入96孔細胞培養板中、第1列每孔180 μL，第2～11列每孔100 μL，最后1列為無菌對照，在第1列每孔加入20 μL抗生素工作液，混勻后取100 μL至第二列、而后逐級稀釋至第11列，此時每一行抗生素濃度均128～0.0625 μg/mL。將培養板用封板膜密封，錫箔紙包裹后放入37℃恒溫培養箱中培養。60 h后每孔加入過濾除菌的刃天青工作液，繼續孵育12 h后記錄顏色結果[10-12]。

2 結果

培養結束后取出96孔板，若陽性對照孔中細菌生長良好(粉紅色)且空白對照孔中未見細菌生長(藍色)，則可以進行讀數，MIC定義為使刃天青保持藍色的最低抗生素濃度(圖1)。 MIC數值見表1，實際MIC應位于最后一個藍色孔和第一個紅色孔所對應的數值之間。

表1 12株膿腫分枝桿菌對12種抗生素的MIC值(μg/mL)

圖1 刃天青測膿腫分枝桿菌對12種抗生素的MIC

克拉霉素對MAB的MIC為0.125～0.5 μg/mL，阿奇霉素對MAB的MIC為0.5～16 μg/mL，阿米卡星對MAB的MIC為2～4 μg/mL，米諾環素對MAB的MIC為32～128 μg/mL，莫西沙星對MAB的MIC為4～8 μg/mL，環丙沙星對MAB的MIC為4～16 μg/mL，美羅培南對MAB的MIC為32～64 μg/mL，利奈唑胺對MAB的MIC為4～32 μg/mL，頭孢西丁對MAB的MIC為32 μg/mL，頭孢美唑對MAB的MIC為16～32 μg/mL，異煙肼和利福平對MAB的MIC均>128 μg/mL。

根據CLSI指南，比對指南中RGM對各種抗生素的折點(表2)，將各菌株的耐藥情況進行判定，具體見表3，菌株實際的MIC應為最后一個藍色孔和第一個紅色孔所對應的數值之間。由于部分抗生素(阿奇霉素、頭孢美唑)指南中并未規定折點，故參照該同類的有折點的抗生素(克拉霉素、頭孢西丁)進行判讀；針對抗結核藥(異煙肼、利福平)則參照慢生長分枝桿菌的折點進行判讀。

表2 CLSI中推薦各抗生素的折點

表3 12株膿腫分枝桿菌對12種抗生素的敏感性情況

結果顯示，MAB對克拉霉素、阿米卡星、利奈唑胺、頭孢西丁均敏感，對異煙肼、利福平、米諾環素、環丙沙星、美羅培南均耐藥，對莫西沙星除1例為中度敏感外均耐藥。

3 討論

雖然NTM相關感染在我國并不強制報道，但我們仍可以發現皮膚NTM感染的發病率和患病率在國內外快速上升[13-15]。皮膚MAB感染常發生于外傷[16]、手術、美容注射[17]、針灸、紋身[18]等侵入性操作之后，大都與醫源性侵入操作相關。由于MAB對含氯消毒劑、酒精、戊二醛等常用醫用消毒劑有較強的抵抗力，其在醫療美容機構內的爆發也并不少見[19-21]。在本次研究中收集的11例膿腫分枝桿菌感染的病人全部都有皮膚軟組織的侵入性操作史，如埋線減肥、針灸、蠶絲蛋白注射等。結合國內外文獻和我們科之前的診療經驗，大部分皮膚軟組織侵入性操作后發生的經久不愈感染均應高度懷疑非結核分枝桿菌感染，特別是膿腫分枝桿菌感染，在經驗用藥時應盡量避免采用異煙肼、利福平等天然耐藥的藥物[22]。

表2的結果說明，皮膚感染的MAB僅對于克拉霉素、阿米卡星、利奈唑胺和頭孢西丁敏感，對于異煙肼、利福平、米諾環素、美羅培南、環丙沙星均耐藥，對于莫西沙星，除1株MAB中度敏感外其余菌株同樣耐藥。由于部分抗生素如阿奇霉素、頭孢美唑指南中沒有推薦的折點，我們參照其同類的其他抗生素進行比對，根據表1的結果我們可以發現，克拉霉素相比于阿奇霉素對膿腫分枝桿菌的MIC更低，而頭孢美唑對于膿腫分枝桿菌的MIC則與頭孢西丁相當。

此外，在本次實驗中，我們加入了MAB的標準菌株ATCC19977，該細菌是由肺部MAB感染的樣本中分離，該菌株表現出了與皮膚感染的MAB不完全相同的耐藥特性：皮膚感染的MAB對于大環內酯類藥物克拉霉素、阿奇霉素和噻唑烷酮類藥物利奈唑胺更加敏感，而對于喹諾酮類藥物環丙沙星、莫西沙星則更加耐藥，而對阿米卡星、頭孢西丁、頭孢美唑則基本相當。Guo[23]、陳振華等[24]針對臨床中肺部感染的MAB的耐藥性研究結果同樣顯示肺部感染的MAB有相當比例對喹諾酮類、四環素類以及碳青霉烯類藥物仍較為敏感,表明皮膚和肺部感染的MAB的耐藥性可能存在一定差異，尤其是喹諾酮類和碳青霉烯類藥物當前在皮膚MAB感染的治療中作為一線藥物被廣泛使用，值得我們進一步研究及探討。Jeong[25]和Philips[22]等對于皮膚及肺外膿腫分枝桿菌感染的研究中也可以觀察到類似結果，皮膚分離的膿腫分枝桿菌對于喹諾酮類藥物以及四環素類藥物的耐藥性均較高。然而在當前的臨床實踐中，喹諾酮類、四環素類藥物以及碳青霉烯類藥物被作為一線藥物廣泛使用，值得我們進一步研究及探討。目前并沒有文獻或研究發現肺部感染與皮膚感染膿腫分枝桿菌存在遺傳上的差異，故二者不同的體外藥敏結果可能與膿腫分枝桿菌的生物學特性相關。膿腫分枝桿菌是一種專性需氧菌，在低氧條件下(比如皮膚膿腫內)可轉入休眠狀態，在與外界較低的物質交換水平下保持分裂，此時細菌對于抗生素的攝取下降，可能導致耐藥性上升[26]。膿腫分枝桿菌還存在一種誘導耐藥機制，這種機制可使膿腫分枝桿菌在長期與大環內酯類藥物共同作用后對其產生耐藥，并通過一系列復雜機制使細菌的外排泵活性發生變化，肺部感染膿腫分枝桿菌的病人多有基礎疾病史且長期使用多種抗生素，這可能誘導膿腫分枝桿菌對不同抗生素的外排發生變化[27]。皮膚感染的患者大多為外源性感染，一次性感染細菌的載量較大，細菌可在皮膚軟組織內形成休眠體、生物膜、索狀結構等復雜的生物結構，從而表現出不同的耐藥性。此外，當然，作為一種典型的胞內寄生菌，MAB感染是細菌與人體相互作用的復雜過程，雖然體外藥敏實驗可以提供較為客觀量化的細菌耐藥情況，但不同抗生素在體內發揮作用的機制不同，臨床用藥的效果可能與體外藥敏的結果并不完全平行。

總的來說，由于膿腫分枝桿菌特殊的細菌結構以及特殊的耐藥機制，導致其對于臨床上常用的抗生素均存在不同程度的耐藥，這導致了皮膚膿腫分枝桿菌治療充滿困難，包括有限的藥物選擇、治療周期長、易反復和極易產生耐藥。相比于肺部感染MAB的患者，皮膚MAB感染患者大多為身體健康、無基礎疾病的青壯年；如前所述，皮膚的結構、感染MAB的方式也與肺部感染有較大差異。因此，皮膚MAB感染的治療是否需要參考甚至照搬肺部感染的方案，仍需大量研究去探索和驗證。