西帕依固齦液成分鑒定及其治療復發(fā)性阿弗他潰瘍作用機制的網(wǎng)絡藥理學研究*

馬 璇，范晨陽，季志紅，李柯翱，聶繼紅

（1.新疆醫(yī)科大學藥學院，新疆 烏魯木齊 830011；2.新奇康藥業(yè)股份有限公司，新疆 烏魯木齊 830011；3.新疆醫(yī)科大學附屬中醫(yī)醫(yī)院，新疆 烏魯木齊 830000）

復發(fā)性阿弗他潰瘍（RAU）為臨床常見口腔黏膜疾病，常反復發(fā)作，病因尚不明確，主要與遺傳及免疫、細菌因素、微量元素缺乏及食物抗原、精神因素、機械損傷、系統(tǒng)疾病及激素紊亂、氧化應激等有關(guān)［1-2］。目前多采用局部治療與全身治療相結(jié)合，以達到縮短潰瘍發(fā)作期、延長間歇期、減輕疼痛和減少潰瘍數(shù)量的目的［3］。西帕依固齦液以沒食子為原料經(jīng)現(xiàn)代工藝制成，收載于《中華人民共和國衛(wèi)生部藥品標準》［4］，有健齒固齦、清血止痛等功效，用于治療口腔疾病。臨床研究表明，西帕依固齦液可明顯減少復發(fā)性口腔潰瘍數(shù)，縮小潰瘍直徑，對口腔黏膜無刺激性［5-6］。本研究中通過網(wǎng)絡藥理學手段分析西帕依固齦液中化合物可能的作用靶點及作用途徑，預測其治療RAU的機制?，F(xiàn)報道如下。

1 化學成分鑒定

1.1 儀器與試藥

儀器：H-Class 型超高效液相色譜儀及XEVO-G2XS QTOF型質(zhì)譜儀（美國Waters公司）。

試藥：西帕依固齦液（新奇康藥業(yè)股份有限公司，批號為20190905）。

1.2 方法與結(jié)果

1.2.1 試驗條件

色譜條件：色譜柱為Kromasil C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相為水（A）-乙腈（B），梯度洗脫（0～1 min時1%B，1～5 min時10%B，5～50 min時25%B，50～80 min時30%B，80～90 min 時50%B，90～100 min 時90%B）；流速為0.8 mL/min。

質(zhì)譜條件：負電離（ES-）掃描模式，毛細管電壓2.5 kV；樣品錐孔電壓40.0 kV，源溫度100 ℃，去溶劑溫度250 ℃，錐孔氣流量50.0 L/h，去溶劑氣流600.0 L/h。

1.2.2 試驗結(jié)果

采用液相色譜-質(zhì)譜法分析，結(jié)果見圖1。經(jīng)過分子量比對，查閱文獻［7-8］，鑒定出8 種化學成分，詳見表1。

表1 西帕依固齦液化學成分鑒定結(jié)果Tab.1 Identification of chemical components in Xipayi Mouth Rinse Fluid

2 網(wǎng)絡藥理學研究

2.1 活性成分及靶點收集

文獻挖掘西帕依固齦液中8個化學成分，質(zhì)譜分析得11個化學成分，去重后共獲得914個靶點。

2.2 RAU 疾病靶點收集

以“recurrent aphthous ulcer（stomatitis）”為關(guān)鍵詞在DisGeNET，Human Phenothpe Ontology 和DrugBank 數(shù)據(jù)庫進行搜集，分別獲得RAU基因27，11，117個；從GEO數(shù)據(jù)庫（系列：GSE37265）獲得RAS的差異表達基因，利用RStudio進行分析，共獲得差異表達基因80個，前20個見圖2（紅色代表基因上調(diào)，黑色代表未發(fā)生差異表達，綠色代表基因下調(diào)）。獲得的差異表達基因作為RAU 的相關(guān)靶點，與DisGeNET、Human Phenothpe Ontology和DrugBank數(shù)據(jù)庫獲得的靶點取交集，共獲得206個疾病靶點。

2.3 復方靶點網(wǎng)絡構(gòu)建、基因本體論（GO）富集及京都基因與基因組百科全書（KEGG）通路分析

將西帕依固齦液活性成分914 個靶點與RAU 疾病206 個靶點取交集，獲得33 個靶點。反向?qū)ふ?，獲得5 個對應的化學成分（見表2），導入Cytoscape 3.7.2 軟件，構(gòu)建復方靶點的網(wǎng)絡圖，結(jié)果見圖3（綠色代表活性成分，紅色代表基因）。

表2 西帕依固齦液治療RAU靶點對應化學成分Tab.2 Chemical components corresponding to the target of Xipayi Mouth Rinse Fluid in the treatment of RAU

對33 個基因進行GO 富集分析，共獲得920 項，其中生物過程（BP）877 項，細胞成分（CC）10 項，分子功能（MF）33 項（P＜0.01），P值較小的前10 項富集結(jié)果見圖4。前3個生物過程為對脂多糖的反應、對細菌來源分子的反應、細胞因子產(chǎn)生的正調(diào)控，前3 大細胞組成為膜筏、膜微區(qū)、膜區(qū)，前3 項分子功能為細胞因子活性、細胞因子受體結(jié)合、受體配體活性。

對33個潛在基因進行KEGG通路分析，共獲得12條通路（P＜0.01），結(jié)果見圖5。前4條信號通路為NF-κB信號通路、HIF-1 信號通路、程序性壞死、細胞因子-細胞因子受體相互作用。

3 討論

本研究中利用液相色譜/質(zhì)譜和網(wǎng)絡藥理學技術(shù)構(gòu)建了西帕依固齦液治療RAU 的靶點網(wǎng)絡。結(jié)果表明，西帕依固齦液中5個化學成分對多個靶點均有影響，如沒食子酸、鞣花酸和棕櫚酸分別作用于FAS 和CYP2E1靶點。沒食子酸類物質(zhì)具有抗癌［9］、抑菌［10］、抗炎［11］、抗病毒［12］、促進細胞凋亡［13］等多種藥理活性。鞣花酸清除自由基的能力很強，具有抗氧化［14］作用，還可通過影響NK細胞活性而起到一定的免疫調(diào)節(jié)作用［15］。

目前的研究認為，RAU 的發(fā)生、發(fā)展與細胞因子如白細胞介素（IL）、干擾素（IFN）、腫瘤壞死因子（TNF）以及轉(zhuǎn)化生長因子（TGF）有關(guān)，包括IL-6，IL-10，IL-4，IL-18，IFN-γ，TNF-α，TGF-β 等［16-18］。網(wǎng)絡藥理學分析發(fā)現(xiàn)，西帕依固齦液治療RAU 最相關(guān)的通路為NF-κB 信號通路、低氧誘導因子-1（HIF-1）信號通路、程序性壞死與細胞因子-細胞因子受體相互作用，通路中涉及的抗炎、鎮(zhèn)痛相關(guān)靶點包括IL-6，TNF，F(xiàn)AS 等，與目前研究的RAU 主要靶點相一致。臨床研究表明，西帕依固齦液能降低慢性牙周炎患者齦溝液中的TNF-α，IL-6，IL-8 水平，升高超氧化物歧化酶（SOD）和谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）水平［19］。西帕依固齦液能抑制模型大鼠牙齦炎牙齦組織中核因子（NF）-κB-p65 和環(huán)氧合酶（COX-2）的表達［20］；同時，西帕依固齦液可明顯抑制前列腺素E2（PGE2）的合成與分泌［21］。沒食子提取物可抑制口腔細菌生物膜中葡萄糖轉(zhuǎn)移酶的（GTF）活性，發(fā)揮防齲作用［22］。

IL-6 是炎性疼痛的重要參與因子，可通過增加TNF-α，誘導產(chǎn)生前列腺素而引起疼痛反應［15］。此外，RAS 的發(fā)生也有細菌因素，正常人群口腔內(nèi)細菌的種類主要由9個細菌門組成，RAU患者口腔菌群發(fā)生了改變［2，23］。酶促抗氧化系統(tǒng)在RAU 的發(fā)病機制中起了關(guān)鍵作用，RAU 患者血清中丙二醛（MDA）、谷胱甘肽（GSH）、TNF-α、髓過氧化物酶（MPO）、總氧化狀態(tài)（TOS）水平和氧化應激指數(shù)（OSI）升高，一氧化氮（NO）、IL-10和抗氧化狀態(tài)（TAS）水平降低［24-25］。

綜上所述，西帕依固齦液所含沒食子酸等核心成分能作用于TNF，IFN-γ 等基因，繼而調(diào)控NF-κB，HIF-1等多條信號通路，從而發(fā)揮治療RAU的作用。