金茵利膽口服液高效液相色譜指紋圖譜及多成分含量同時測定研究*

趙麗娟，王 信，潘新波，李彩東

（甘肅省蘭州市第二人民醫院，甘肅 蘭州 730046）

金茵利膽口服液（甘藥制備字Z20200419000）在我院臨床應用已逾20年，由茵陳、廣金錢草、枳殼、蒲公英、黃連、甘草等18味中藥組方，主要含有蒽醌類、生物堿類、黃酮類、有機酸類等成分，具有疏肝利膽、清熱解毒等功效，用于治療黃疸、慢性肝炎、膽道結石、膽囊炎等癥。現行質量標準對方中茵陳、枳殼、蒲公英和五味子進行了薄層色譜定性鑒別，并測定了柚皮苷和新橙皮苷的含量［1］。本研究中參考2020年版《中國藥典（一部）》［2］及文獻［3-6］，采用高效液相色譜（HPLC）法構建了21 批金茵利膽口服液的指紋圖譜，運用主成分分析（PCA）法篩選了批次間的主要差異成分，同時測定了8 種主要有效成分的含量，為建立該制劑的質量控制方法提供了參考。現報道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

LC-20A 型高效液相色譜儀（日本Shimadzu 公司）；FA2004N 型電子分析天平（上海精密科學儀器有限公司）；XPE105 型電子分析天平（梅特勒托利多儀器＜上海＞有限公司）；TH-100BQ 型超聲波提取機（濟寧天華超聲電子儀器有限公司）。

1.2 試藥

沒食子酸對照品（批號為110831-200302，含量91.5%），綠原酸對照品（批號為110753-201817，含量96.6%），夏佛塔苷對照品（批號為111912-201703，含量95.6%），甘草苷對照品（批號為111610-201106，含量93.7%），柚皮苷對照品（批號為110722-201111，含量93.2%），新橙皮苷對照品（批號為111857-201102，含量99.6%），鹽酸小檗堿對照品（批號為110713-201212，含量86.7%），甘草酸銨對照品（批號為110731-201116，含量93.1%），均購自中國食品藥品檢定研究院；金茵利膽口服液（醫院制劑室自制，批號分別為20181206，20181213，20181220，20190314，20190328，20190411，20190425，20190516，20190530，20190704，20190822，20190919，20190930，20191024，20191107，20191113，20191121，20191128，20191206，20191213，20200116，依次記為S1-S21；規格為10 mL/支）；磷酸、甲醇、乙腈均為色譜純，其余試劑均為分析純，水為雙蒸水。廣金錢草（批號為19112202，廣西產），茵陳（批號為19090804，甘肅產），黃連（批號為20021002，四川產），厚樸（批號為20021202，四川產），甘草（批號為19111705，甘肅產），香附（批號為19031303，廣西產），木香（批號為20021101，云南產），牡丹皮（批號為20020701，河南產），枳殼（批號為19102106，江西產），桃仁（批號為19111905，山東產），川楝子（批號為20021001，四川產），山楂（批號為20021102，山東產），麥芽（批號為19112602，甘肅產），神曲（批號為20020702，甘肅產），南五味子（批號為19040603，廣西產），均購自蘭州安泰堂藥業有限公司；大黃（批號190410，甘肅產），虎杖（批號為B909181-01，甘肅產），蒲公英（批號為190601，甘肅產），均購自蘭州九州通醫藥有限公司。

2 方法與結果

2.1 色譜條件

色譜柱：DIKMA Diamonsil?C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相：乙腈（A）-0.1%磷酸水溶液（B），梯度洗脫（0～34 min時93%B→71%B，34～50 min時71%B→65%B，50～60 min 時65%B→0B）；流速：0.9 mL/min，檢測波長：254 nm；柱溫：25 ℃；進樣量：10 μL。

2.2 溶液制備

單一對照品溶液：分別稱取沒食子酸對照品3.18 mg、綠原酸對照品2.96 mg、夏佛塔苷對照品2.13 mg、甘草苷對照品5.07 mg、柚皮苷對照品29.50 mg、新橙皮苷對照品49.64 mg、鹽酸小檗堿對照品1.82 mg、甘草酸銨對照品0.51 mg，置不同25 mL 棕色容量瓶中，用甲醇溶解并定容，制成質量濃度分別為沒食子酸0.116 4 g/L、綠原酸0.114 4 g/L、夏佛塔苷0.081 5 g/L、甘草苷0.190 0 g/ L、柚皮苷1.099 8 g/ L、新橙皮苷1.977 7 g/L、鹽酸小檗堿0.063 1 g/L、甘草酸銨0.019 0的單一對照品溶液，4 ℃避光保存。

混合對照品溶液：分別取沒食子酸、綠原酸、夏佛塔苷、甘草苷、柚皮苷、新橙皮苷、鹽酸小檗堿、甘草酸銨對照品4.30，1.45，0.53，1.35，9.23，9.65，0.75，0.30 mg，精密稱定，置同一25 mL 棕色容量瓶中，用50%甲醇溶解并定容，制成質量濃度分別為沒食子酸0.157 4 g/L、綠原酸0.056 0 g/L、夏佛塔苷0.020 7 g/L、甘草苷0.050 6 g/ L、柚皮苷0.344 1 g/ L、新橙皮苷0.384 5 g/ L、鹽酸小檗堿0.026 0 g/ L、甘草酸銨0.011 2 g/L的混合對照品溶液，4 ℃避光保存。

供試品溶液：精密量取樣品5 mL，置10 mL 容量瓶中，加甲醇定容，超聲（功率為250 W，頻率為50 kHz，下同）處理10 min，放冷至室溫，稱定質量，用甲醇補足減失的質量，搖勻，1 000 r/ min 離心10 min，濾過，取續濾液，即得。

2.3 HPLC 指紋圖譜研究

2.3.1 方法學考察

精密度試驗：取2.2 項下供試品溶液（S1）適量，按2.1 項下色譜條件連續進樣6 次，以柚皮苷（11 號峰）為參照峰，計算各特征峰的相對保留時間及相對峰面積。結果的RSD均小于3.0%（n=6），表明方法精密度良好。

穩定性試驗：取2.2 項下供試品溶液（S1）適量，分別于室溫下放置0，6，12，24，36，48 h時按2.1項下色譜條件進樣測定，以柚皮苷為參照峰，計算各特征峰的相對保留時間及相對峰面積。結果的RSD均小于3.0%（n=6），表明室溫下供試品溶液在48 h內穩定。

重復性試驗：取樣品（S1）適量，精密稱定，按2.2項下方法平行制備6 份供試品溶液，分別進樣分析，以柚皮苷為參照峰，計算各特征峰的相對保留時間及相對峰面積。結果的RSD均小于3.0%（n=6），表明方法重復性良好。

2.3.2 特征圖譜建立及共有峰定位

取21 批樣品，按2.1 項下方法制備供試品溶液，按2.1項下色譜條件進樣測定，將所得色譜數據導入“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統（2012版）”，以樣品S1的HPLC 圖譜為參照，采用平均數法，設定時間窗寬度為0.1 min，得HPLC 疊加指紋圖譜（圖1）及對照指紋圖譜（圖2）。21批樣品的色譜圖中共有18個共有峰，指認其中8個特征峰，分別為1號峰（沒食子酸）、6號峰（綠原酸）、8號峰（夏佛塔苷）、9號峰（甘草苷）、11號峰（柚皮苷）、12號峰（新橙皮苷）、15號峰（鹽酸小檗堿）、18號峰（甘草酸銨）。21批樣品指紋圖譜相似度均在0.947～0.999（見表1），表明各批次樣品化學成分相似，制劑工藝穩定。

2.4 主成分分析

采用SPSS 19.0 統計學軟件對樣品進行主成分分析，發現前3個主成分（PC1，PC2，PC3）分別表征了原始數據的27.289%，22.502%，15.182%，累計64.973%的信息量，且均包含了8種化學成分組成信息。結果顯示，鹽酸小檗堿和甘草酸銨在PC1中得分較高，新橙皮苷在PC2 中得分最高（0.810），夏佛塔苷和沒食子酸在PC3中得分較高，說明這5種成分的含量在不同批次樣品間有相對差異，提示在實際生產質控過程中需重點監測。主成分得分系數矩陣見表2。

表2 金茵利膽口服液主成分得分系數矩陣Tab.2 Rotated component matrix of principal components of Jinyin Lidan Oral Liquid

2.5 含量測定

2.5.1 方法學考察

系統適用性試驗：精密量取2.2項下混合對照品溶液、供試品溶液各適量，按2.1項下色譜條件進樣測定，記錄色譜圖。結果供試品溶液色譜中，在與混合對照品溶液色譜相應位置有吸收峰。理論板數按沒食子酸峰計應不低于3 000，分離度均大于1.5，基線分離良好。詳見圖3。

線性關系及檢測限、定量限考察：分別精密吸取2.2項下混合對照品溶液1.0，2.0，3.0，4.0，5.0，7.5mL，置10mL容量瓶中，加50%甲醇定容，制成系列混合對照品溶液，按2.1 項下色譜條件進樣測定，以進樣量（X，μg）為橫坐標、峰面積（Y）為縱坐標進行線性回歸。以信噪比（S/N）3∶1和10∶1時的進樣量記作檢測限和定量限。結果見表3。

表3 8個成分的線性關系、線性范圍和檢測限、定量限（n=6）Tab.3 Linear relationship，linear range，LOD and LOQ of eight components（n=6）

精密度試驗：精密吸取2.2項下混合對照品溶液適量，按2.1 項下色譜條件連續進樣測定6 次，記錄色譜圖。結果沒食子酸、綠原酸、夏佛塔苷、甘草苷、柚皮苷、新橙皮苷、鹽酸小檗堿、甘草酸銨峰面積的RSD分別為0.55%，1.31%，0.86%，0.81%，0.76%，1.31%，0.78%，0.81%（n=6），表明儀器精密度良好。

穩定性試驗：取樣品（S21），按2.2項下方法制備供試品溶液，分別于室溫下放置0，6，12，24，48 h時按2.1項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積。結果沒食子酸、綠原酸、夏佛塔苷、甘草苷、柚皮苷、新橙皮苷、鹽酸小檗堿、甘草酸銨峰面積的RSD分別為0.55%，1.10%，0.68%，1.54%，1.33%，2.68%，1.82%，1.39%（n=5），表明室溫下供試品溶液放置48 h內穩定。

重復性試驗：取樣品（S21），按2.1項下方法平行制備供試品溶液6份，按2.1項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積，并計算樣品含量。結果沒食子酸、綠原酸、夏佛塔苷、甘草苷、柚皮苷、新橙皮苷、鹽酸小檗堿、甘草酸銨含量的RSD分別為1.46%，1.68%，1.85%，1.97%，1.96%，1.92%，2.76%，0.17%（n=6），表明方法重復性良好。

加樣回收試驗：精密量取已知含量的供試品溶液（S21）適量，分別加入2.2項下單一對照品溶液，按2.2項下方法制備供試品溶液，按2.1 項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積，計算加樣回收率。結果見表4。

表4 加樣回收試驗結果（n=6）Tab.4 Results of the recovery test（n=6）

2.5.2 含量測定

取8 批樣品，按2.2 項下方法制備供試品溶液，按2.1 項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積，計算各成分的含量。結果見表5。

表5 金茵利膽口服液中8個成分含量測定結果（g/L）Tab.5 Results of content determination of eight components in Jinyin Lidan Oral Liquid（g/L）

3 討論

3.1 測定指標確定

金茵利膽口服液方中君藥茵陳含綠原酸、異綠原酸、咖啡酸等有機酸［7］，廣金錢草含皂苷、黃酮苷、生物堿、多糖等成分［8-9］，可清熱除濕、利膽退黃。黃連含小檗堿等異喹啉生物堿類，蒲公英含甾醇、有機酸等，虎杖、大黃主含蒽醌類，共為臣藥，可利膽排石、通腑瀉熱。木香、枳殼、厚樸、桃仁等為佐藥，可疏肝行氣、化郁止痛、軟堅散結；五味子、甘草等為使藥，可健脾和胃、調和諸藥［10］。根據2020年版《中國藥典（一部）》及相關文獻報道［11-14］，對方中各藥材有效成分進行峰歸屬和含量測定研究［15］，發現厚樸酚、和厚樸酚、丹皮酚、苦杏仁苷、甘草次酸、枸櫞酸等在制劑中無法檢出，大黃酸、大黃素等蒽醌類成分在煎煮過程中易發生變化，最終確定以沒食子酸、綠原酸等8種成分為檢測指標。

3.2 流動相和檢測波長選擇

預試驗中考察了甲醇-水、乙腈-水、甲醇-磷酸、乙腈-磷酸等流動相對檢測結果的影響，結果發現，以乙腈-0.1%磷酸水體系為流動相、流速為0.9 mL/min時，色譜峰峰形良好，分離度高，無雜質干擾。全波長掃描發現，沒食子酸在215，271 nm 波長處吸收較強，綠原酸在218，326 nm 波長，夏佛塔苷在271，336 nm 波長處吸收較強，柚皮苷、新橙皮苷在283 nm 波長處有最大吸收峰，鹽酸小檗堿在228，264，345 nm 波長處有較大吸收峰，甘草苷最大吸收波長在216，276 nm 處，甘草酸銨最大吸收波長在254 nm 處。設定檢測波長210，254，326 nm，對比各峰，發現210 nm 波長處存在強吸收雜質峰，326 nm波長處沒食子酸、甘草苷基本無吸收，254 nm波長處色譜圖基線平穩，各成分在考察范圍內線性關系均良好，故選擇檢測波長為254 nm。

3.3 主成分分析評價

金茵利膽口服液處方含有藥材種類多，化學成分復雜，極性差異較大，會對實際質控檢測待測物質造成干擾。主成分分析作為一種化學計量學方法，在處理復雜數據降維后代替原始指標，能較充分地反映原始數據信息的特性［16］。本研究中在構建金茵利膽口服液指紋圖譜的基礎上，應用主成分分析法對21 批樣品中8 種成分進行評價，發現鹽酸小檗堿、甘草酸銨、新橙皮苷、夏佛塔苷和沒食子酸的含量在不同批次樣本間存在一定差異。

3.4 方法評價

本研究中建立的金茵利膽口服液指紋圖譜，及其中8種成分含量測定方法，簡便快速，穩定性、重復性均較好，準確度較高，可用于該制劑的質量評價。